PLoS ONE: Karakterisering af en Novel Anti-Cancer Compound for Astrocytomas

Abstrakt

standard kemoterapi for hjernetumorer er temozolomid (TMZ), men så mange som 50% af hjernesvulster er efter sigende TMZ resistente forlader patienter uden en kemoterapeutisk mulighed. Vi udførte seriel screening af TMZ resistente astrocytom cellelinjer, og identificerede forbindelser, der er cytotoksiske for disse celler. Den mest cytotoksisk forbindelse var en analog af thiobarbitursyre at vi henviser til som CC-I. Der er en dosisafhængig cytotoksiske effekt af CC-I i TMZ resistent astrocytomceller. Celledød synes at forekomme via apoptose. Efter CC-I eksponering, var der en stigning i astrocytomceller i S og G2 /M faser. I

in vivo

athymiske (

nu

/

nu

) nøgne mus subkutane og intrakranielle tumormodeller, CC-I fuldstændig hæmmet tumorvækst uden lever eller nyre toksicitet. Molekylmodelleringsundersøgelser og enzymaktivitetsassays indikerer, at CC-I selektivt inhiberer topoisomerase IIα ligner andre lægemidler i denne klasse, men dens cytotoksiske virkninger på astrocytomceller er stærkere end disse forbindelser. Den cytotoksiske virkning af CC-I er stærkere i celler, der udtrykker ikke-methyleret O

6-methylguanin methyltransferase (MGMT), men er stadig toksisk for celler med methyleret MGMT. CC-I kan også øge den toksiske effekt af TMZ på astrocytoma, når de to forbindelser kombineres. Afslutningsvis har vi identificeret en forbindelse, der er effektiv mod astrocytomer herunder TMZ resistente astrocytomer i både cellekultur og

in vivo

hjerne tumor-modeller. Den forbedrede cytotoksicitet af CC-I og sikkerhedsprofilen for denne familie af stoffer kunne give et interessant redskab for en bredere vurdering mod hjernetumorer

Henvisning:. Lee SY, Slagle-Webb B, Rizk E, Patel A, Miller PA, Sung SS, et al. (2014) Karakterisering af en Novel Anti-Cancer Compound for Astrocytomas. PLoS ONE 9 (9): e108166. doi: 10,1371 /journal.pone.0108166

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, Spanien

Modtaget: 19 Maj 2014; Accepteret: August 19, 2014; Udgivet: 25 September, 2014

Copyright: © 2014 Lee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette projekt er finansieret dels af en bevilling med National Cancer Institute of National Institutes of Health under Award nummer R21CA167406 til SL. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health. Denne undersøgelse også delvist understøttet af Elsa U. Pardee Foundation og Tara Leah Witmer Endowment. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser: Connor er delvis ejer af NuHope LLC, som har en økonomisk interesse i udvikling af forbindelser til behandling hjernetumorer, der oprindeligt screenet under anvendelse cellelinier valgt til HFE genotype. Lee har en royalty aftale med NuHope LLC. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Gliomer konto for 28% af alle primære hjerne og centralnervesystemet (CNS) tumorer, og 80% af gliomer er maligne [1]. Blandt gliomer, glioblastoma (glioblastoma multiforme, grad IV astrocytoma, GBM) er den mest almindelige malignt gliom. Dødeligheden af ​​primær malign hjerne og CNS-tumorer er høj; ca 22,620 nye voksne tilfælde af ondartet hjerne og CNS kræftformer i 2013 [1] og 13.700 dødsfald i 2012 [2]. Den mediane overlevelse for GBM patienter var 14,6 måneder, og de 2 års overlevelse af patienter med GBM var 10,4% for strålebehandling alene og kun 26,5% undergår kombinationsbehandling behandling af temozolomid (TMZ) og stråling [3].

nuværende standard behandling for GBM er total resektion efterfulgt af strålebehandling alene eller kombination med TMZ kemoterapi [4], [5]. TMZ er en oral alkyleringsmiddel anvendes i behandlingen af ​​kræft i hjernen,

f.eks.

, GBM og oligodendroglioma [6]. Det er også blevet anvendt til behandling af melanom, prostatacancer, pancreascancer carcinom, bløddelssarkom, og renalcellecarcinom [7] – [11]. TMZ hæmmer celle reproduktion ved at hæmme DNA-replikation [12] og har unikke egenskaber i forhold til andre alkylerende stoffer. For eksempel er det administreres oralt, krydser blod-hjerne-barrieren, er mindre toksisk end andre alkyleringsmidler, og ikke kemisk tværbinde DNA. Selv TMZ er den nuværende kemoterapeutiske standard for behandling af hjernetumorer og andre cancere, så mange som 50% af hjernetumorer er resistente over for TMZ behandling [13], [14]. Derudover næsten alle tumorer i sidste ende komme tilbage og det store flertal af tilbagevendende tumorer er resistente over for kemoterapi [15], [16]. Derfor er udviklingen af ​​nye behandlingsmuligheder, herunder nye lægemidler til terapi resistente hjernetumorer er et presserende behov for.

Ud over de alkyleringsmidler som TMZ, topoisomeraseinhibitorer er en anden gruppe af anti-cancer medicin under evaluering. Topoisomeraser er vigtige nukleare enzymer, der regulerer topologien af ​​DNA, opretholder genomisk integritet og er essentielle for DNA-replikation, rekombination, transkription og kromosom opdeling [17]. Der er seks human topoisomerase-enzymer [18], og tre af dem, topoisomerase I, topoisomerase IIα og topoisomerase IIβ, har betydelig involvering i kræft og kræft kemoterapi [19]. Den topoisomerase I enzym nicks og slutter sig en streng af duplex-DNA, og topoisomerase II-enzym forbigående bryder og lukker dobbeltstrenget DNA [20]. Topoisomerase I-inhibitorer (fx topotecan) er blevet anvendt til patienter med recidiverende småcellet lungecancer, tilbagevendende maligne gliomer, tilbagevendende barndommen hjernetumorer [21], [22]. Selvom topoisomerase II-hæmmere blev undersøgt i gliom celler [23] – [25], de topoisomerase II-hæmmere er ikke blevet meget udbredt i voksne med primære hjernetumorer grundet deres dårlige CNS penetrans. Derfor ville små molekyler med evne til at trænge ind i hjernen være meget ønskeligt at behandle gliomer

in vivo

.

Vi har tidligere rapporteret, at humane neuroblastomceller og humane astrocytom cellelinjer udtrykker almindeligt forekommende polymorfier i HFE genet var resistente over for kemoterapi og stråling [26]. HFE genprodukt er involveret i jern-homeostase og de fælles HFE polymorfismer, H63D og C282Y, føre til en række ændringer i celler, såsom øget endoplasmatisk reticulum stress og forøget oxidativt stress [27] – [29]. I den foreliggende undersøgelse, brugte vi astrocytom cellelinjer, som vi identificeret med HFE genvarianter og TMZ modstand til screening af forbindelser fra DIVERSet stofbibliotek fra Chembridge (San Diego, Californien) og fundet en række effektive forbindelser med en lignende kemotype. Vi identificerede en analog af en thiobarbitursyre forbindelse, som har stærk toksisk virkning på TMZ-resistente astrocytomceller. Vi rapporterer her karakterisering af den ledende forbindelse i

in vitro

cellekultur og

in vivo

hjerne tumor-modeller.

Materialer og metoder

Materialer

Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM), føtalt bovint serum (FBS) og andre cellekulturingredienser blev købt hos Life Technologies (Grand Island, NY). Alle PCR Array ingredienser blev leveret fra SABiosciences (Frederick, MD). TMZ blev indkøbt fra Oakwood Products Inc. (West Columbia, SC) og blev opløst i celledyrkningsmedium eller 100% DMSO. Den ledende kemotype Forbindelsen-I (CC-I) blev bestilt fra Chembridge Corporation (San Diego, CA). Forbindelsen blev opløst i DMSO som en stamopløsning og fortyndet til eksperimentet. Topoisomerase-enzymer I og IIα assay kits blev bestilt fra TopoGen Inc. (Port Orange, FL). Merbaron blev opnået fra Calbiochem (San Diego, CA). Alle de andre anvendte kemikalier blev erhvervet fra Sigma Co. (St. Louis, MO).

Menneskelig astrocytoma cellekultur, behandling og cytotoksicitet assay

Humane astrocytomceller (SW1088-grade III, U87-MG-grad IV, CCF-STTG1-grad IV, T98G-grad IV, LN-18-grad IV) blev bestilt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og opretholdt i DMEM (Gibco af Life Technologies, katalog 11885) suppleret med 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 0,29 mg /ml L-glutamin og 10% FBS. Alle eksperimenter blev udført ved 37 ° C i 5% CO

2 atmosfære celledyrkningsbetingelser. For cytotoksicitetsassays blev de testede forbindelser fremstillet ved først at fortynde dem fra stamopløsningen i celledyrkningsmedier. Forbindelserne blev udsat til cellerne i 3-6 dage. Cellecytotoksicitet blev udført ved MTS [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium] celleproliferationsassay (Promega, Madison, WI ) eller sulforhodamin B (SRB) assay ved udgangen af ​​cellekulturen periode.

Akut toksicitet bestemmelse

Akut toksicitet CC-i blev bestemt i athymiske nøgne mus (stamme 088 eller 490, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) i henhold til NIH lægemiddeludviklingsprogram akutte giftighed procedure med mindre modifikation. Til bestemmelse af akut toksicitet, i alt seks hunmus (1-2 måneder gamle) blev injiceret intraperitonealt med 3 forskellige doser (f.eks, 20 mg /kg, 37,5 mg /kg, 50 mg /kg) af CC-I eller køretøj kontrol en gang om ugen, og derefter observeret i en periode på 7-14 dage. Musene blev observeret dagligt for ændringer i kropsvægt, synlig og /eller håndgribelig dermal infektion, tilstedeværelse af ascites, fødevareforbrug eller ernæring status, og grooming eller forringet mobilitet eller død for at bestemme akut toksicitet. Ved 7-14 dage efter behandling, 0,5-1 ml blod blev opsamlet gennem en hjerte- hjertepunktur mens musene var under bedøvelse (ketamin 100 mg /kg legemsvægt /xylazin 10 mg /kg legemsvægt, intraperitonealt) for blod toksicitet undersøgelse . Alle dyr i undersøgelsen blev huset i kim-fri miljøværelser og individuelle boble systemer. Alle dyreforsøg blev godkendt (IACUC # 2011-062) af Pennsylvania State University Institutional Animal Care og Brug udvalg.

Subkutan tumor model

For at teste anti-tumor effekt af CC- jeg mod human astrocytoma tumor, en-to måneder gammel kvindelig immundefekte (

nu

/

nu

) nøgne mus (stamme 088, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) blev implanteret 10 × 10

6 celler pr mus subkutant med TMZ følsom SW1088 eller TMZ resistente CCF-STTG1 astrocytomceller. Når tumoren nåede ca. 32-100 mm

3 i størrelse musene (n = 10 eller 11) blev tilfældigt opdelt i to grupper. CC-I blev injiceret intraperitonealt i en koncentration på 25 mg /kg kropsvægt i et volumen på 200-300 pi i 12,5% ethanol gang om ugen i 7 uger. Kontrolgruppen blev givet phosphatbufret saltvand (PBS) i det samme volumen og regimen. Tumorstørrelse blev målt ugentligt med en skydelære i 7 uger ved en investigator blindet for forsøgsbetingelser. Tumor volumen (V) blev beregnet i overensstemmelse med formlen V =

en

2/2 × b, hvor

en

b

er mindre og større akser af tumor-foci, hhv. Tumorstørrelsen, sundhed og overlevelse af musene var synligt overvåges dagligt, og tumorstørrelsen målt ugentligt. Vi tog ikke billeder af tumorer. Vi vil overveje at tage billeder for kommende eksperimenter. For at overvåge toksicitet af forbindelser blev dyrene aflivet med ketamin /xylazin 100/10 mg /kg legemsvægt intraperitonealt og målt lever og nyre toksicitet ved afslutningen af ​​forsøget.

intrakranielt xenograftmodel

Kvinde immundefekte nøgne mus (stamme 088, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) blev der vejer 20-30 g bedøvet ved intraperitoneal injektion af ketamin-xylazin 100 mg /kg-10 mg /kg legemsvægt. Humane U87-MG og CCF-STTG1 astrocytoma cellelinier blev implanteret at skabe den hjernetumor xenograft. Kort fortalt blev hovedet holdes i vandret stilling og 1 million astrocytomceller i et volumen på 10 pi blev injiceret langsomt ind caudatus putamen region med en lille animalsk stereotaktisk apparat. De stereotaktiske koordinater anvendes til xenotransplantater er P = 0,5, L = 1,7, H = 3,8 mm. De astrocytomceller blev injiceret langsomt i 10 minutter for at undgå forøgelse i det intrakranielle tryk eller cellesuspensionen lækage opad gennem banen af ​​nålen. Dyrene blev givet buprenorphin (0,05-0,1 mg /kg legemsvægt subkutan) for smerte under og efter operationen. Dette blev givet hver 8-12 timer i 24-48 timer efter operationen. Dyrene blev udsat for T1 vægtet magnetisk resonans (MRI) to gange; én gang for at fastslå, at en tumor er etableret i hjernen (~ 3 uger injektion af astrocytomceller) og ved afslutningen af ​​forsøget. Dyrene blev monitoreret dagligt og legemsvægten blev registreret ugentligt. Når en tumor blev observeret, at mus (n = 12 eller 15) blev tilfældigt opdelt i to grupper. CC-I (25 mg /kg legemsvægt) eller PBS blev injiceret en gang om ugen intraperitonealt. Den samlede overlevelse af mus blev udført ved en Kaplan-Meier overlevelse kurve. Dyrene blev aflivet efter acceptabel metode til eutanasi, som defineret af American Veterinary Medical Association (AVMA) Retningslinjer om eutanasi – Godkendt eutanasi Metoder, 2013. Når dyrene får en huld score på mindre end 2, dyrene blev aflivet med ketamin /xylazin 100/10 mg /kg legemsvægt intraperitonealt samt en sekundær fremgangsmåde til cervikal dislokation. Ved afslutningen af ​​forsøget, blev plasma indsamlet til analyse af lever og nyrer toksicitet efter aflives med ketamin /xylazin 100/10 mg /kg legemsvægt intraperitonealt.

T1 vejet MRI Images of

T1 vægtede MRI-kontrastmiddel blev anvendt til at visualisere tumorvækst under anvendelse 7T MRI-system (Bruker, Biospec GmbH, Ettlingen, Tyskland). De billeddiagnostiske parametre for T1 scanningen er TR /TE = 540 ms /11 ms, 8 gennemsnit, 192 × 192, 0,5 mm skive tykkelse og 3,2 cm

2 FOV. Musene blev bedøvet ved inhalation af 1-2% isofluran og anbragt i en position med hjerne placeret i midten af ​​spolen. Intrakraniel tumor volumen blev estimeret ved hjælp af Gadolinium forbedret T1 vejede multislice aksial hurtig spin-ekko billeder. Fra disse billeder på størrelsen af ​​tumoren blev beregnet ved anvendelse af regionen af ​​interesse værktøj til rådighed på Paravision software (Bruker Biospec, Ettlingen, Tyskland).

Lever og nyre toksicitet

Leveren og nyre toksicitet (total bilirubin, blod urea nitrogen (BUN), kreatin, aspartat aminotransferase (AST), alaninaminotransferase (aLT) og alkalisk fosfatase) blev vurderet for både subkutan tumor model og intrakranielle xenograft model ved hjælp af en automatiseret kemianalysator (Roche Cobase MIRA) og kits fremstillet af Thermo Electron (Louisville, CO). Blodet blev opnået fra kontrollen eller CC-I injicerede mus med astrocytomceller ved afslutningen af ​​forsøget.

Apoptose assay

For apoptose assay, 3 × 10

6 CCF-STTG1 celler blev dyrket i 48 timer med adskillige koncentrationer (~36 uM) af CC-i eller actinomycin D (-80 nM) som en positiv kontrol. Cellerne blev høstet efter trypsin-EDTA eksponering og vasket i kold PBS. Derefter 100 pi af cellesuspensionen (~ 1 x 10

6 celler) blev inkuberet med 1 pi 100 pg /mL rød-fluorescerende propidiumiodid nukleinsyrebindende farvestof og 5 pi Annexin V-FITC (Molecular Probes, Carlsbad, CA) i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. Cellerne blev analyseret ved flowcytometri (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) af emission ved 530 nm (for eksempel FL1) og 575 nm (fx FL3). De celler, der er bundet af Annexin V illustrerer tidligt apoptotiske celler. Celler, der er reaktive for både Annexin V og propidiumiodid er nekrotiske celler.

genekspressionsprofilering

Vi brugte Apoptose PCR Array (SABiosciences, Frederick, MD) for at afgøre, hvilke gener der er ændret af CC -I i TMZ resistent CCF-STTG1 celler. PCR Array blev udført ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt blev totalt RNA ekstraheret fra køretøjet (0,1% DMSO) behandlet eller CC-I behandlede CCF-STTG1 cellelinjer under anvendelse qPCR-Grade RNA Isolation kit. Et ug RNA blev anvendt til første streng cDNA-syntese ved hjælp af revers transkription med MMLV revers transkriptase. Derefter realtids-PCR blev udført med fortyndet cDNA og master mix med ROX filter. For signal detektion blev ABI Prism 7900 Sequence Detector System programmeret med en indledende sterilisering ved 2 minutter ved 50 ° C efterfulgt af 10 minutter denaturering ved 95 ° C og derefter 40 cykler i 15 sekund ved 95 ° C, 1 minut ved 60 ° C og 30 sekunder ved 72 ° C. Hver reaktion prøve blev udført tre gange. PCR Array data beregnet af ΔΔcycle tærskel (ΔΔ

Ct

) metoden, derefter normaliseret mod flere husholdning gener og udtrykt som betyder fold ændringer i CC-I behandlede prøver i forhold til vehikelbehandlede kontrolprøver.

Cell cyklus analyse

for cellecyklus analyse blev CCF-STTG1 celler dyrket natten over med en tæthed på 2-5 × 10

6 celler pr kolbe. Den følgende dag blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af CC-I i frisk celledyrkningsmedium. Efter 24-48 timer senere blev de adhærerende celler høstet og split (1 × 10

6 celler pr rør) til vask med Hanks puffer, derefter fikseret i iskold 70% ethanol natten over ved -20 ° C. For DNA-farvning dag blev cellerne inkuberet med propidiumiodid (100 ug /ml) og RNase A (20 ug /ml) i 15 minutter ved 4 ° C (beskyttet mod lys). Prøver blev analyseret under anvendelse af BD FACS Calibur Flowcytometri Analyzer.

Topoisomerase afslapning og decatenation assay

DNA afslapning og kinetoplast DNA (kDNA) decatenation assay blev udført under anvendelse af topoisomerase I eller II medikamentscreening kit eller Topopoisomerase II assaykit (TopoGEN, Inc., Port Orange, FL) i overensstemmelse med producentens anvisninger [30]. Topoisomerase IIα decatenates kDNA som består af højt catenated netværk af cirkulært DNA i en ATP-afhængig reaktion til opnåelse individuelle minicircles af DNA. Kort fortalt, for topoisomerase IIα medieret kDNA decatenation assay indeholder reaktionsblandingen 20 pi følgende komponenter; 50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, 0,5 mM dithiothreitol, 30 pg /ml bovint serumalbumin, 2 mM ATP, 260 ng kDNA, adskillige koncentrationer af forbindelser, og 4 U af human topoisomerase IIα. Den endelige koncentration på 0,5% (v /v) DMSO blev anvendt, fordi denne koncentration ikke påvirker aktiviteten af ​​topoisomerase IIα. Inkubationen af ​​assay blanding blev udført ved 37 ° C i 30 minutter og afsluttes ved tilsætning af 4 pi Stop indlæsning farvestof. De kDNA decatenation produkter fra reaktionsblandingen blev opløst på en 1% agarosegel ved 100 V i 40 minutter, derefter farvet med 0,5 ug /ml ethidiumbromid i TAE-buffer (4 mM Tris-base /iseddike [0,11% (v /v)] /2 mM Na

2EDTA).

Molekylær modellering undersøgelse

de molekylære modellering undersøgelser var baseret på X-ray krystalstrukturen af ​​human topoisomerase IIα bundet til L-peptid på 1,50 Å opløsning (FBF identifikationskode: 2q5a) [31]. Positionen af ​​L-peptidet blev anvendt til at specificere dimensionerne af CC-I-bindingssted for docking studier. Docking mellem topoisomerase IIα protein og CC-I blev udført ved hjælp af GLIDE programmet (Grid Based ligand Docking fra Energetics, fra Schrödinger, L.L.C.) [32], [33]. Den Jørgensen OPLS-2005 kraftfelt var ansat i GLIDE programmet. Den optimale bindende geometri for hver model blev opnået med GLIDE, som er baseret på Monte Carlo stikprøveteknikker kombineret med energi minimering. GLIDE SP (Standard Precision tilstand) blev anvendt til at forankre forbindelsen CC-I efterfulgt af GLIDE XP (Extra Precision tilstand). Schrödingers LigPrep blev brugt til at generere 3D-konformationer af CC-I

Statistisk Analyse

Alle data blev udsat for statistisk analyse af den studerende

t

-test, når man sammenligner to grupper. Vi anvendte en-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey-Kramer test for mere end to gruppesammenligninger at bestemme, om forskellene er betydelige. For sammenligninger af tidsforløb eller koncentration data, vi udført gentagne foranstaltninger tovejs ANOVA efterfulgt af Tukey-Kramer test. Forskelle blandt midler betragtes statistisk signifikant, når den

s

værdien er mindre end 0,05. LC

50 (50% dødelig koncentration) af forbindelser blev bestemt ved hjælp af statistisk software (GraphPad Prism 6) som en generel indikator for et kemisk toksicitet. I

in vivo

hjernesvulst model, blev data tumor volumen opsummeres som middelværdierne med standardfejl. Musene overlevelse blev sammenlignet mellem grupperne ved hjælp Kaplan-Meier overlevelsesanalyse med logrank test.

Resultater

Identifikation af en cytotoksisk forbindelse mod TMZ resistente astrocytomceller

Vores screening tilgang identificeret en thiobarbitursyre-analog og givet identifikationsetikette ifølge kemotype forbindelse-i (CC-i). Strukturen af ​​CC-I er vist i figur 1A. CC-I var cytotoksisk for både TMZ-resistente humane astrocytoma cellelinjer CCF-STTG1 og TMZ-følsomme SW1088 (figur 1B). LC

50 af CC-I til SW1088, U87-MG og CCF-STTG1 cellelinjer er 13,6 uM, 23.6 uM og 25,4 uM henholdsvis.

(A) Strukturen af ​​CC-I. (B) Cytotoksicitet af CC-I i

in vitro

. Humane astrocytom-cellelinier blev dyrket med forskellige doser af CC-I i 3 dage og derefter cytotoksiciteten blev bestemt ved SRB-assay. LC

50 af CC-I til SW1088 cellelinier (13,6 uM) er signifikant forskellige med LC

50 af CC-I til U87-MG og CCF-STTG1 cellelinjer (23,6 uM og 25,4 uM) ( p. 0,001)

Akut toksicitet CC-i i nøgne mus

injektioner af CC-i en gang om ugen ved 50 eller 75 mg /kg legemsvægt var livsfarlige inden 7 dage. En gang om ugen injektion på 35 mg /kg legemsvægt blev tolereret. Derfor brugte vi ca. 70% af den tolererede dosis (25 mg /kg legemsvægt) i CC-I koncentration for

in vivo

tumor model undersøgelse.

Anti-tumor effekt af CC -Jeg i det subkutane mus tumor model

at etablere den anti-tumor effekt af CC-i på astrocytomceller, vi brugte den immundefekte nøgne mus subkutant tumor model injiceres med enten TMZ følsomme SW1088 eller TMZ resistente CCF-STTG1 cellelinier. Musene med tumorer fra CCF-STTG1 cellelinje viste ingen tegn på tumor progression efter CC-I indsprøjtninger selv efter injektionerne sluttede (figur 2A), hvorimod i den ubehandlede kontrolgruppe tumor volumen steget voldsomt over 7 uger (p 0,0001) . De tumorer i mus fra SW1088 cellelinje mislykkedes også til fremskridt under injektionen periode, men tumoren skred når CC-I-injektioner blev indstillet (figur 2A). Vi tog ikke billeder af tumorer. Vi vil overveje at tage billeder for kommende eksperimenter. Det kropsvægten for kontrol eller CC-I behandlede mus ikke falde i løbet af undersøgelsen (figur 2B).

(A) Musene blev implanteret med ti millioner celler med SW1088 eller CCF-STTG1 celler. Udgangsmaterialet tumorstørrelse for CCF-STTG1 celler varierede 80-100 mm

3. De SW1088 celler voksede langsommere så CC-I behandlingen blev startet, da tumorerne nåede 30 mm

3. CC-I blev injiceret intraperitonealt i en koncentration på 25 mg /kg legemsvægt en gang om ugen i 7 uger (n = 7~10). Kontrolgruppen blev givet PBS i det samme volumen og behandlingsregime (n = 3-8). Tumoren langsomt reoccurred i TMZ-følsomme SW1088 astrocytom injicerede nøgne mus, men ikke opstå igen i TMZ resistente CCF-STTG1 injicerede nøgne mus, når CC-I blev afbrudt (ud over 7 uger). CC-I inhiberede tumorvækst og var ikke dødelig i nogen af ​​behandlingsgrupperne. Nogle fejlsøjler er for små til at være synlige. (B) Mean legemsvægt hos mus er vist i gram. Nogle fejl barer er for små til at være synlige.

Anti-tumor effekt af CC-I i intrakraniel hjernesvulst model

Efter oprettelse af

in vivo

effekt og sikkerheden af ​​CC-i mod både TMZ følsomme og resistente cellelinjer i det subkutane hjernetumor model undersøgte vi intrakraniel xenograft hjernetumor model. U87-MG eller CCF-STTG1 astrocytomceller blev injiceret i mus hjernen og dannet tumorer (verificeres af MRI) -3 uger efter implantation (figur 3A). Ingen af ​​de ubehandlede kontrol musene overlevede mere end 30 dage, og den mediane overlevelse var 20 dage. Hvis musene var behandles med CC-I, men 64% (7/11) af U87-MG tumorbærende mus stadig var i live efter 60 dage og 89% (8/9) af CCF-STTG1 tumorbærende mus stadig bor 60 dage (p 0,0001) (figur 3B) og ingen tumor var synlig på MRI (figur 3A). Fem mus i U87-MG tumor gruppe og seks i CCF-STTG1 tumor gruppe modtager CC-I injektioner var i live 200 dage efter tumor injektion (137 dage efter den sidste CC-I-injektion). Som med den systemiske tumor model, var der ingen tegn på lever eller nyre toksicitet fra CC-I i intrakranielle xenograft mus (figur 3C). Kropsvægten af ​​dyrene faldt ikke i dyr, der modtog CC-I (figur 3D).

(A) repræsentant MRI-billeder taget med T1-vægtede MRI-kontrastmiddel (7T MR imaging system) efter intrakraniel tumordannelse (en tredje uge efter implantation af astrocytomceller) eller efter tumordannelse efterfulgt af injektion af CC-i (25 mg /kg legemsvægt) i 7 uger. CC-I helt hæmmede tumorvækst i både astrocytom cellelinier. (B) Kaplan-Meier overlevelse graf af intrakranielle hjerne tumor mus efter administration af CC-I. CC-I strækker overlevelsen af ​​musene sammenlignet med de ubehandlede mus (n = 9 eller 11) (P 0,0001). Ingen af ​​de mus, som modtog PBS (kontrol) overlevede efter 30 dage og median overlevelse alle disse dyr var 20 dage (n = 3 eller 4). (C) lever og nyre toksicitet CC-I. Den lever og nyre toksicitet (total bilirubin, blod urea nitrogen (BUN), kreatin, aspartat aminotransferase (AST), alaninaminotransferase (ALT) og alkalisk fosfatase) blev bestemt ved hjælp af en automatiseret kemianalysator maskine (Roche Cobase MIRA) og kits fremstillet af Thermo Electron. Disse data indikerer ingen lever eller nyre toksicitet ved CC-I i nøgne mus. Toksicitetsdata vist som middelværdi ± SEM. (D) Mean kropsvægt af mus i gram.

Apoptose af CC-I i TMZ resistente astrocytomceller

Næste vi spurgte, om celledød ved CC-I til TMZ resistent CCF-STTG1 astrocytomceller medieres gennem en apoptotisk pathway. CC-I inducerede apoptose i en dosisafhængig måde i CCF-STTG1 cellelinjer (figur 4A). Mængden af ​​CCF-STTG1 apoptotisk celledød ved 36 uM var sammenlignelig med den positive kontrol apoptoseinducer, actinomycin D. Der er tegn på nekrotisk celledød i CCF-STTG1 efter udsættelse for CC-I, men færre celler blev mærket og betydning var ikke opnået indtil to gange den koncentration, hvor apoptose først blev observeret (figur 4B).

Celledød overvågedes med apoptotiske og nekrotiske cellemarkører efter 48 timer CC-i eksponering i CCF-STTG1 celler. Celledød blev bestemt med den rekombinante annexin V konjugeret til fluorescein, efterfulgt af flowcytometrisk analyse. Apoptotisk celledød er vist i panel A. Panel B er nekrotisk celledød. Actinomycin D blev anvendt som en positiv kontrol til at inducere apoptotisk celledød. Procentdelen af ​​apoptotiske celler efter CC-I-behandling blev forøget på en dosis-afhængig måde i CCF-STTG1 celler. Der var ikke en udtalt dosisafhængig forøgelse af nekrotisk celledød i de CCF-STTG1 celler indtil den højere koncentration. Data, vurderet ved hjælp Student

t

test og vises som betyder ± SEM. Nogle fejlsøjler er for små til at være synlige. Symbolerne indikerer en signifikant forskel sammenlignet med kontrollen. (*** P 0,001)

Apoptose gen array i CC-I behandlede TMZ resistente CCF-STTG1 celler

For at afgøre, hvilke apoptosecyklus blev aktiveret ved CC-I behandling. udførte vi genekspressionsprofiler anvendes målrettede arrays for apoptose. The Human Apoptose Microarray afslørede, at tumornekrosefaktor (TNF) pathway gener har de største ændringer i genekspression i CC-I behandlede celler sammenlignet med bærerbehandlede celler. CC-I (36 pM) steg TNF superfamilien 1, 2, 5, 6, og 9 samt TNF-receptor-superfamilien 5, 9, 10a 30-700 fold. Blandt caspase pathwaygener, kun caspase 10 og caspase 14 blev induceret. Den fold forhold af de ændrede gener er opsummeret i tabel 1.

Effekt af CC-I på den celle cyklus af TMZ resistente astrocytomceller

For bedre at forstå den cytotoksiske effekt af CC -I, udførte vi en cellecyklusanalyse i CCF-STTG1 celler efter CC-i-behandling. CC-I-behandling af CCF-STTG1 celler resulterede i et signifikant fald i G0 /G1-fasen, og en stigning i S og G2 /M-fase i sammenligning med ubehandlede celler (figur 5A B).

CCF-STTG1 celler blev behandlet med 18 eller 36 uM CC-i i 24 eller 48 timer. Cellerne blev farvet med propidiumiodid og analyseres derefter for cellecyklusfordeling under anvendelse af en FACScan analyzer. CC-I-behandling forøgede signifikant S og G2 /M-cellepopulation, men faldt i G0 /G1-fasen. Symbolerne indikerer en signifikant forskel sammenlignet med kontrollen. (* P 0,05; ** p 0,01; *** p 0,001).

Topoisomerase IIα hæmning af CC-I

Vi afgøres, om CC-I kan binde human topoisomerase IIα i en molekylær modellering undersøgelse. De molekylære modellering af data mellem human topoisomerase IIα og CC-I foreslog, at CC-I passer ind i hulrummet af humane topoisomerase IIα hvor det kunne fungere som en inhibitor (figur 6A). Derfor udførte vi DNA afslapning og kDNA decatenation assays til bestemmelse af evnen hos CC-I til at inhibere topoisomerase IIα enzymaktivitet. CC-I inhiberede topoisomerase IIα aktivitet på en dosisafhængig måde. Ved koncentrationer større end 23 uM, CC-I hæmmede topoisomerase IIα katalyseret kDNA decatenation (figur 6B). Etoposid (VP16), en kendt topoisomerase Il-gift, inhiberede topoisomerase IIα på 1 mm, men ikke ved 0,1 mM koncentration (figur 6B). Dernæst vi fastslået, om CC-I er en specifik hæmmer af topoisomerase IIα bruge en supersnoet DNA afslapning assay. CC-jeg ikke øge topoisomerase I-medieret lempelse af supercoiled pHOT1 DNA (figur 6C). Camptothecin, en topoisomerase I-inhibitor, blev anvendt som en positiv kontrol for assayet og viste den forventede inhibering af topoisomerase I-medieret DNA afslapning. I modsætning hertil CC-I udviste en kraftig inhiberende virkning på topoisomerase IIα-medieret lempelse af supersnoet pHOT1 DNA (figur 6D). Den effektive koncentration af CC-I på topoisomerase IIα medieret DNA afslapning blev først set ved 11 uM.

(A) Struktur af CC-I docket i topoisomerase IIα (PDB kode 1ZXM). Topoisomerase er vist som den brune-farvet bånd med rester på bindingsstedet.