PLoS ONE: Personlig Cirkulerende Tumor DNA Biomarkører dynamisk Forudsige behandlingsrespons og overlevelse I Gynækologiske Kræft

Abstrakt

Baggrund

High-Grade serøse æggestokkene og livmoderkræft er de mest dødbringende kvindelige reproduktive tarmkanalen maligniteter verdensplan. Til dels, at manglende behandle disse to aggressive kræftformer held centre på det faktum, at mens de fleste patienter er diagnosticeret baseret på nuværende strategier overvågning som at have en komplet klinisk respons på deres primære terapi, næsten halvdelen vil udvikle sygdommen tilbagefald inden for 18 måneder og den størstedelen vil dø af sygdommen tilbagefald inden for 5 år. Desuden ingen i øjeblikket anvendes biomarkører eller billeddiagnostiske undersøgelser kan forudsige udfaldet efter indledende behandling. Cirkulerende tumor-DNA (ctDNA) repræsenterer en teoretisk stærk biomarkør til detektering ellers okkult sygdom. Vi udforskede derfor brugen af ​​personlige ctDNA markører som både en overvågning og prognostisk biomarkør i gynækologiske kræftformer og sammenlignet dette med de nuværende FDA-godkendte overvågningsværktøjer.

Metoder og Resultater

Tumor og serumprøver var indsamlet på tidspunktet for kirurgi og derefter under hele behandlingen kursus for 44 patienter med gynækologiske kræftformer, der repræsenterer 22 æggestokkene kræfttilfælde, 17 livmoderkræft sager, en peritoneale, tre æggeleder, og én patient med synkron æggeleder og livmoderkræft. Patient /tumorspecifikke mutationer blev identificeret under anvendelse hel-exome og målrettet gen sekventering og ctDNA niveauer kvantificeres ved anvendelse dråbe digital PCR. CtDNA blev påvist i 93,8% af patienter, for hvem sonder blev designet og niveauer blev stærkt korreleret med CA-125 serum og computertomografi (CT) scanning resultater. I seks patienter, ctDNA opdaget tilstedeværelsen af ​​kræft, selv når CT-scanning var negativ og i gennemsnit havde en prædiktiv leveringstid på syv måneder i CT billeddannelse. Mest bemærkelsesværdigt var ikke-detekterbare niveauer af ctDNA på seks måneder efter initial behandling forbundet med markant forbedret progressionsfri og samlet overlevelse.

Konklusioner

Påvisning af residual sygdom i gynækologisk, og faktisk alle kræftformer, repræsenterer en diagnostisk dilemma og et potentielt kritisk vendepunkt i præcision medicin. Denne undersøgelse tyder på, at anvendelsen af ​​individualiserede ctDNA biomarkører i gynækologiske cancere kan identificere tilstedeværelsen af ​​resterende tumor samtidig mere dynamisk forudsige respons på behandlingen i forhold til for tiden anvendte serum- og billeddannende undersøgelser. Af særlig interesse, ctDNA var en uafhængig forudsiger af overlevelse hos patienter med ovarie- og livmoderkræft. Tidligere anerkendelse af sygdommens vedholdenhed og /eller fornyet og evnen til at stratificere i bedre og dårligere resultat grupper gennem ctDNA overvågning kan åbne vinduet for forbedret overlevelse og kvalitet og liv i disse kræftformer

Henvisning:. Pereira E, Camacho -Vanegas O, Anand S, Sebra R, Catalina Camacho S, Garnar-Wortzel L, et al. (2015) Personlig Cirkulerende Tumor DNA Biomarkører dynamisk Forudsige behandlingsrespons og overlevelse I Gynækologiske kræftformer. PLoS ONE 10 (12): e0145754. doi: 10,1371 /journal.pone.0145754

Redaktør: Goli Samimi, National Cancer Institute, UNITED STATES

Modtaget: Oktober 27, 2015; Accepteret: 8. december 2015; Udgivet: December 30, 2015

Copyright: © 2015 Pereira et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Disse undersøgelser blev finansieret delvist af donationer fra Varadi æggestokkene initiativet i Cancer Education (VOICE), den Derald H. Ruttenberg Foundation og MS Gordon familie. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Gynækologiske maligniteter vil blive diagnosticeret i løbet af 94.000 kvinder i USA og vil resultere i tæt på 29.000 dødsfald alene i år [1]. Udviklingen af ​​mere følsomme og nøjagtige biomarkører vil være afgørende for både tidligere påvisning af sygdomme og mere effektiv overvågning i indstillingen efterbehandlingen. For eksempel i epitelial kræft i æggestokkene, den mest dødbringende tarmkanalen malignitet kvindelige reproduktive verdensplan, de fleste kvinder vil præsentere med fremskreden sygdom, som vil blive forvaltet af kirurgisk resektion efterfulgt af kombination platin- og taxan kemoterapi. Misvisende, med de nuværende detektionsteknologier, vil 80% af disse patienter synes at have en komplet klinisk respons til primær terapi. Faktisk vil mere end halvdelen udvikle sygdommen tilbagefald inden for 18 måneder. Således er en kritisk periode for at indlede mere aggressiv behandling tidligere og forbedre overlevelse potentielt tabt for evigt. Det eneste i øjeblikket tilgængelig serum biomarkør i gynækologiske maligniteter, CA-125, mangler sensitivitet og specificitet for overvågning behandlingsrespons og tidlig påvisning af recidiv [2,3]. Billeddiagnostiske metoder, herunder computertomografi (CT) scanning er almindeligt anvendt til sygdomsovervågning, men også mangler følsomhed og ofte forbliver ufyldestgørende eller forsinket i at demonstrere progression af sygdom [4,5].

Den absolutte mængde celle-fri DNA (cfDNA) i patientens serum som en markør for tilstedeværelse sygdom i gynækologisk maligniteter først blev udforsket mere end 10 år siden [6,7]. Med fremkomsten af ​​nye sekventering teknologier og analytiske teknikker, evnen til at detektere cirkulerende tumor-specifikt DNA (ctDNA), der ofte omtales som den “flydende biopsi”, har udviklet sig. Målingen af ​​ctDNA har vist sig at være en nøjagtig afspejling af sygdom tilstedeværelse og tumor udvikling i flere cancertyper inklusiv bryst-, lunge-, tyktarms-, og mavekræft [8-12]. Tidligere undersøgelser i gynækologiske maligniteter har primært evalueret tilstedeværelsen af ​​ctDNA på et enkelt tidspunkt under anvendelse bækken vaske, ascites, serum og plasma [13-15]. Som en proof-of-principle undersøgelse for at demonstrere evnen til serielt spore sygdommen, vi for nylig brugt en tumor-specifikke fusion begivenhed for at demonstrere den fortsatte tilstedeværelse af ctDNA, og dermed minimal residual sygdom, i en enkelt patient i løbet af en periode på fire år i lyset af gentagne normale CA125 målinger [16]. Bortset fra dette, er longitudinelle studier korrelerer ctDNA niveauer med tumor byrde og kliniske forløb i gynækologiske kræftformer mangler. Ikke desto mindre, den teoretiske dynamik, følsom og særlige karakter ctDNA som biomarkør tyder stort potentiale for at revolutionere vores tilgang til tumor overvågning i gynækologiske kræftformer.

Her beskriver vi en hurtig og effektiv pipeline, at par tumor-specifikke punktmutation identifikation med dråbe digital PCR-baseret ctDNA detektion. Vi har testet denne rørledning til at registrere og overvåge tumorstatus i 44 kvinder med gynækologiske cancere. Konkret ved hjælp af en kombination af hel exome sekventering (WES) og instrueret gen sekventering panel, har vi samlet tumor mutation profiler til en kohorte af æggestokkene og endometrie kræftpatienter. Patient-afledte paneler af ctDNA biomarkører blev dannet og testet under anvendelse af dråber digital PCR, som vi valideret til at kunne detektere enkelte eksemplarer ctDNA pr serumprøve. De ctDNA resultater blev sammenlignet med den nuværende FDA-godkendt serum biomarkør, CA125, CT scanning og det kendte kirurgiske /klinisk status hos patienter. Dette er den første undersøgelse i gynækologiske kræftformer at vise, at ctDNA kan påvise tilstedeværelsen af ​​kræft tidligere end andre for tiden anbefalede test modaliteter og at ctDNA niveauer på færdiggørelsen af ​​primær terapi er en uafhængig prædiktor for både progressionsfri (PFS) og samlet overlevelse ( OS).

Metoder

patientoptagning og Sample Collection

Fyrre-fire patienter med gynækologisk blev maligniteter tilmeldt og godkendt til deltagelse efter at have indhentet relevant skriftligt informeret samtykke som en del af vores Institutional Review Board (IRB) -godkendte gynækologisk cancer genomics program på Icahn School of Medicine på Mount Sinai (tabel 1). Tumorprøver blev indsamlet på tidspunktet for kirurgi. Blodprøver blev opsamlet på tidspunktet for kirurgi og igen med hver blodprøve i hele patientens kliniske forløb. Kirurgisk tumorvæv blev straks lynfrosset i flydende nitrogen efter høst, og serum blev opsamlet i BD Vacutainer SST II Advance Tubes (BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ). Inden for fire timer efter indsamling blev blodprøver centrifugeret i 10 minutter ved 12.000 g). Serum blev overført til et 15 ml Falcon-rør og centrifugeret ved 1,200g i yderligere 10 minutter for at fjerne resterende cellerester. Kliniske data blev udtrukket fra patient journaler og omfattede demografiske variabler, indledende tumorsted, histologi, kvalitet, scene, CA-125 niveauer og kemoterapeutiske regimer. Data for kirurgiske indgreb, steder af metastatisk sygdom, og tumor gentagelser blev også indsamlet. Alle patienter med endometrie eller ovariecancer var berettiget til indskrivning, hvis de nødvendige prøver ifølge undersøgelsen protokol og relevante kliniske data var tilgængelige:. CA-125 niveauer, computertomografi (CT) resultater, kirurgiske resultater og kemoterapi

DNA ekstraktionsprotokoller

Genomisk tumor-DNA blev ekstraheret fra ca. 25-50 mg af væv ved hjælp af DNeasy blod og væv Kit (Qiagen, GmbH, Hilden) ifølge producentens instruktioner. Germlinie DNA blev ekstraheret fra helblod ved brug af ArchivePure DNA Kit (5 Prime) ifølge den DNA oprensning protokol for fuldblod, leveret af producenten. Kvantificering af genomisk DNA blev udført ved anvendelse af qubit fluorometri. Cirkulerende frie (cfDNA) blev ekstraheret fra 1 ml serum ved anvendelse af cirkulerende Nucleic Acid Kit (Qiagen, GmbH, Hilden) og elueret med 105 ul af DNase- og RNAse-frit vand.

Identifikation af somatiske mutationer

Personlig tumor mutation profiler blev identificeret for hver patients tumor ved enten hele exome sekventering (WES), eller en målrettet gen sekventering tilgang. I begge assays blev genomisk DNA (gDNA) fra tumorvæv og normal kontrol sekventeret for at identificere genetiske varianter (SNVs og små indels) specifikke for tumoren kun (somatiske mutationer). Alle sekventering blev udført i Institut for Genetik og Genomforskning på Icahn School of Medicine på Mount Sinai. Whole-genom-biblioteker blev fremstillet ud fra gDNA hjælp af NEBNext DNA Library Prep kit (New England Biolabs, Ipswich, MA), beriget til hele exome biblioteker under anvendelse af SeqCap EZ Humant Exome Bibliotek v3.0 capture-system (Roche NimbleGen, Madison, WI) , der dækker ca. 64 Mb af genomet, hvor varianter kan kaldes; parret ende sekventering (2×100 nt læser) blev udført på Illumina HiSeq 2500 (Illumina, San Diego, CA) i enten High Output eller Rapid Run mode. Målgenet sekventering blev udført under anvendelse Ion AmpliSeq

TM Cancer Hotspot Panel v2 (Life Technologies, Carlsbad, CA) under anvendelse af Ion Torrent PGM sekventering teknologi til ~ 1000 til 3000X dækning. Den Ion AmpliSeq

TM Cancer Hotspot Panel v2 afhører 50 onkogener og tumorsuppressorgener tværs 207 amplikoner (dækker 21.820 nt hvor varianter kan kaldes). Baseret på erfaringer, blev kandidat somatiske mutationer visiteres til Taqman sonde udvikling, hvis mutant allel fraktion var ≥ 8% og bestået manuel gennemgang ved at inspicere rå læse alignments i IGV genom browser værktøj, derefter valideret til endelig generation af sonden ved direkte Sanger sekventering af tumor DNA og dets parrede perifert blod mononukleære celle (PBMC) genomisk DNA. Da WES data forudsat et større antal kandidat somatiske mutationer end var praktisk at validere, blev kandidater med højere allel fraktion og bedre variant kvaliteten af ​​opkaldet prioriteres.

PCR Assay Design og validering

Brugerdefinerede TaqMan Analyser blev designet ved hjælp af Life Technologies web-baseret design værktøj (www.lifetechnologies.com/order/custom-genomic-products). Assays indeholdt umærkede PCR-primere (fremad og tilbage) foruden VIC, TET eller FAM mærkede prober, som probet for vildtype og mutant varianter hhv. Assays blev derefter valideres ved kvantitativ PCR (qPCR) under anvendelse TaqMan® Genotypebestemmelse Master Mix (Life Technologies, Foster City, CA) på en ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Først specificitet blev etableret ved at teste assays på tumor og matchet PBMC genomisk DNA. Linearitet af hvert assay blev derefter fastsat ved at sammenligne hver analyse mod en standardkurve fremstillet ud fra en række serielle fortyndinger af tumor-DNA, der spænder fra 400-4000 genomækvivalent kopier specifikke for den pågældende assay.

Mutation Kvantificering i cirkulerende Free DNA (cfDNA)

for yderligere at etablere følsomhed, linearitet og de lavere detektionsgrænser, udviklede analyser blev derefter testet ved dråbe digital PCR (Raindance Technologies, Billerica, MA), som pr fabrikantens protokol. Til dette formål blev serielle fortyndinger af tumor-DNA, fremstillet for hver analyse, og i området fra 2-24 kopier tilsat til en baggrund af 100.000 kopier af genomisk vildtype-DNA. Når den nedre detektionsgrænse blev fastsat for hver assay blev ddPCR udført på cfDNA ekstraheret fra patient serum og /eller plasma. Tyve pi af elueret cfDNA blev anvendt til hver PCR-reaktion, der repræsenterer 200 pi serum. Det samlede PCR-reaktion volumen var 50 ul (genererer 10 ^ 6 dråber). PCR-betingelser var som følger: 95 ° C i 10 minutter for én cyklus; 95C (15 sekunder) og 58C (et minut) med et trin til 45 cykler hver; og 98C (10 minutter). PCR-produktet blev derefter indført i Raindrop Sense instrument til kvantificering af vildtype og mutant kopiantal. Hver cfDNA prøve blev analyseret ved mindst to replikater. At etablere assay reproducerbarhed og effektivitet cfDNA ekstraktion, vi spiket hver patient blodprøve med en kendt koncentration af lambda-DNA fordøjet med Hindlll fag (Qiagen, GmbH, Hilden) før cfDNA isolation. qPCR blev anvendt til at kvantificere de 125 og 535 bp DNA-fragmenter af de λ- Hindlll. Baseret på λ DNA Centrifugeringsevne, inddrivelse effektivitet for cfDNA ekstraktioner, der anvendes i disse studier var mellem 60 og 90%.

Statistisk analyse

For at vurdere evnen af ​​ctDNA og CA125 at forudsige tilstedeværelsen af tumor på CT billeddannelse og på tidspunktet for kirurgi, blev parametrene for sensitivitet og specificitet samt tilsvarende 95% konfidensintervaller estimeres ved hjælp log-binomial modeller, der tog hensyn til de sammenhænge, ​​der opstod derfra bliver flere målinger på den samme patient i løbet af tid. Forventede sandsynligheder fra disse monteret modeller blev derefter brugt i logistiske regressionsmodeller til at estimere og sammenligne arealerne under Receiver Operating Karakteristiske (ROC) kurver (AUC) for både ctDNA og CA125. Samlet overlevelse (OS) og progressionsfri overlevelse (PFS) blev estimeret ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge Kaplan-Meier og sammenlignes med log-rank test, mellem patienter med niveauer af ctDNA der var enten til stede eller fraværende efter kirurgisk resektion og adjuverende terapi. Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af SAS-version 9.3 (SAS Institute, Inc., Cary, NC). Hypotese test var tosidede og udført på 5% signifikansniveau.

Resultater

Clinicopathologic Karakteristik af patienter og deres Tumorer

Fyrre-fire patienter i behandling for gynækologisk cancer blev indrulleret til denne undersøgelse og deres cancer type og clinicopathologic oplysninger vises i tabel 1. tumorafledte DNA, germlinie DNA, ctDNA og kliniske data var tilgængelige for alle patienter. Alle ovarietumorer var høj kvalitet serøs histologi med undtagelse af en malign blandet mesodermal tumor. Selv om hovedparten af ​​endometriale cancere var høj kvalitet, de histologiske undertyper blev varieret. Med henblik på vores analyse high-grade serøse tumorer i æggelederen, bughinden og æggestok blev grupperet sammen som bækken high-grade serøse carcinomer (HGSC). De fleste tumorer sekventerede blev indsamlet på tidspunktet for primær kirurgi (n = 40), mens fire tumor prøver var fra gentagelser.

Identifikation af somatiske genomiske Varianter og Udvikling af Personlig ddPCR Analyser

En oversigt af vores personlige ctDNA analyse rørledning er vist i S1 fig. Ved hjælp af en kombination af WES og målrettet panel sekventering, vi først havde til formål at identificere væsentlige tumor-specifikke mutationer for at udvikle dråbe digitale PCR (ddPCR) -baserede analyser. Otte tumorer blev sekventeret ved hjælp WES data fra Illumina parrede ende sekventering indsamlet på HiSeq 2500 og 36 blev sekventeret ved hjælp af den målrettede Ion AmpliSeq ™ Cancer Hotspot Panel v2 bruge Ion Torrent PGM sequencer. Alle tumorer sekventeret hjælp WES var ovarietumorer. Serumprøver var tilgængelige fra enten primær eller sekundær operation for alle patienter. Langsgående sera var tilgængelige for 23 patienter. ctDNA blev ekstraheret fra i alt 228 individuelle tidspunkter med et gennemsnit på 7,8 tidspunkter per patient (fig 1).

Kandidat mutationer blev identificeret i 36 patienter (S1 tabel). Af mutationerne opdaget ved hjælp af den målrettede panel, det mest almindeligt muterede gen var TP53 (23/36 patienter; 66%), der altid forekom i high-grade serøs histologi af både ovarie- og endometriale tumorer. Mutationer blev også identificeret, om end på lavere frekvenser, i PTEN, PIK3CA, MET, KRAS, FBXW7 og BRAF. Multiple kandidat mutationer blev identificeret i 16 patienter. Alle kandidat mutationer blev bekræftet ved Sanger-sekventering af de respektive tumorer.

I alt 52 unikke assays, ud af 55 udformet, blev valideret for følsomhed, specificitet og linearitet ved brug af kvantitativ PCR (qPCR), som repræsenterer 32 patienter til som ctDNA kvantitative undersøgelser kunne udføres. Robustheden af ​​de forskellige assays genereret for hver af patienterne blev påvist ved en række forskellige målinger. For alle 52 analyser, korrelationskoefficienten for linearitet, R

2, var større end 0,99 (gennemsnit, 0,9988, S2A Fig). De lavere detektionsgrænser blev fastlagt for hver personlig assay under anvendelse spiked tumor DNA fra den respektive patient med kendte mutationer og testet ved hjælp af 2-24 mutant eksemplarer i en baggrund af 100.000 vildtype kopier af deres germlinie DNA. Baseret på disse tests, at følsomheden diskriminere mellem vildtype og mutant sekvens for alle prober anvendt i denne undersøgelse varierede mellem 0,01% og 0,002%. Kvantificering af specifik tumor mutant eksemplarer i cfDNA var stærkt korreleret i ddPCR gentagelser (Pearson r: 0,9938, S2C Fig). Der var også en høj lineær korrelation mellem allel fraktion som bestemt af ddPCR og målrettet sekventering (Pearson r: 0,95)., Og denne sammenhæng var statistisk signifikant p = 4.47E-15 (S2D Fig)

Estimering af følsomhed og Specificitet af ctDNA at forudsige tumor Presence

Vi derefter evaluerede evne serielt-indsamlede ctDNA at screene for klinisk tilstedeværelse af tumor. Samtidig sammenlignede vi også i øjeblikket anvendes FDA-godkendte test, CA-125. At etablere en relativ sandhed for tumor tilstedeværelse, brugte vi CT billeddannelse og resultater på tidspunktet for operationen. Mens relativt upræcis, gjorde dette muligt for os at identificere en række vigtige resultater. Data, der sammenligner ctDNA og CA-125 niveauer af tilstedeværelsen af ​​tumor på CT-scanning var tilgængelige på tværs 53 tidspunkter for 23 patienter.

Følsomheden og specificiteten af ​​ctDNA at forudsige forekomsten af ​​tumor på den parrede CT-scanning var 0,91 [0,73-0,97] og 0,60 [0,31 til 0,83], (tabel 2). Lignende resultater blev opnået for CA-125 og CT-scanning (tabel 2). Den lave specificitet ctDNA var overraskende for os, og så vi undersøgte dette nærmere. Forskellen viste sig at være resultatet af en mangel på overensstemmelse mellem test i seks patienter. Konkret alle seks patienter havde påviselige niveauer af ctDNA men negative CT imaging resultater inden for to uger efter ctDNA blod uafgjort. Afhøring af deres fuldstændige historie viste, at alle seks patienter senere viste sig at have kirurgi bevist tumorer, som ikke var blevet opdaget af CT-scanning. Desuden analyse af patientdata viste, at i gennemsnit ctDNA forudsagde gentagelse cirka 7 måneder. (Interval: 1-11 måneder) tidligere end CT billeddannelse (figur 2)

I dette repræsentativt eksempel, stigninger i ctDNA niveauer i Patient 137 niveauer forud en stigning i CA-125 niveauer med seks måneder og pre-date positiv identifikation af tumorvækst kræver tarm resektion syv måneder senere. CT-scanning var ikke-specifik og patient blev bragt til operationsstuen for sonderende kirurgi, som afslørede tilstedeværelsen af ​​tumor.

CA-125 og ctDNA niveauer blev derefter sammenlignet med tilstedeværelsen af tumor på tidspunktet for kirurgi i banen 30 tidspunkter i 21 patienter. Sammenlignet med tilstedeværelsen af ​​tumor ved operation, ctDNA havde en følsomhed på 0,81 [0,60-0,92], og en specificitet på 0,99 [0,81-0,99]. Til sammenligning følsomheden og specificiteten af ​​CA-125 var 0,82 [0,61-0,93] og 0,64 [0,17-0,94], hhv. Områder under ROC kurver blev beregnet for ctDNA og CA-125 og var 0,91 [0,83-0,99] og 0,70 [0,44-0,95], hhv. Selv om disse resultater antyder, at ctDNA kunne være en mere præcis diagnostisk test end CA-125, forskellen i ROC kurver var ikke statistisk signifikant (p = 0.3575) [Tabel 2].

ctDNA Niveauer efter Initial behandling Predictive af Survival Forskelle

Vi næste vurderet, om ctDNA niveauer efter kirurgisk resektion og adjuverende behandling havde prognostisk betydning. Før og efter behandling ctDNA niveauer blev analyseret for 10 patienter og sammenlignet med PFS og OS. Aktuel klinisk status, døde af sygdom (DOD), live med sygdom (AWD) og ingen tegn på sygdom (NED), var til rådighed for alle 10 patienter (tabel 3). Detekterbare niveauer af ctDNA følgende indledende adjuverende behandling var associeret med både forbedret PFS (p = 0,0011 Kaplan Meier) og OS (p = 0,0194, Fig 3). Den mediane PFS forskel var lidt over 2 år (seks måneder versus 32 måneder). Alle fire patienter med gennemsnitlig efter behandling ctDNA niveauer ≥ 10 kopier /ml er DOD, mens én patient med ctDNA = 5 kopier /ml, som også intriguingly havde meget lave niveauer af ctDNA forbehandling, er AWD. Af de fem patienter med ikke-detekterbare ctDNA niveauer efter behandling, er ingen døde af deres sygdom, tre er AWD og to er NED. To af patienterne har allerede overlevet ud over 5 år. Vi bemærkede ingen overlevelse forskelle baseret på ctDNA forbehandling værdier

Kaplan-Meier analyse af progressionsfri (venstre panel) og samlet overlevelse (højre panel) mellem individer med målbart. (CtDNA = 0; blå linjer) og påviselige ctDNA (≥ 1, røde linjer). Væsentlige forskelle i progressionsfri overlevelse (p = 0,001) og samlet overlevelse (p = 0,0194) mellem upåviselige og påviselige grupper.

Diskussion

Vi viser, at seriel måling af ctDNA er en overvågning biomarkør i gynækologiske kræftformer, der er så følsom og specifik som FDA-godkendte serum biomarkør CA-125 og kan afsløre sygdomstilbagefald måneder tidligere end CT-scanning. Desuden målingen af ​​ctDNA niveauer på tidspunktet for afslutningen af ​​indledende behandling, debulking kirurgi og kombinationen platin /taxan dublet kemoterapi, giver en ny indikator for overlevelse forskelle i patienter. Konkret blev ikke-detekterbare niveauer af ctDNA forbundet med både forbedret progressionsfri og samlet overlevelse. I vores undersøgelse befolkning, forskellen i PFS var lidt over to år mellem kvinder med påviselige og ikke-detekterbare niveauer af ctDNA. Disse forskelle, tidligere påvisning end CT billeddannelse og adskillelse af kvinder med værre og bedre overlevelse, er slående, da det teoretiske grundlag for kræft kontrollen er, at tidligere afsløring resulterer i bedre terapeutiske muligheder og resultater. Hvad er i øjeblikket kendt er, at på nuværende tidspunkt, og stole på den kliniske undersøgelse, CA-125 målinger og billeddannelse, er de fleste af kræft i æggestokkene patienter efter initial behandling diagnosticeret med en komplet klinisk respons. På trods af dette, vil mere end halvdelen af ​​disse kvinder udvikler recidiv inden for 18 måneder.

CA-125 og CT-scanning er de mest anvendte overvågning modaliteter i æggestokkene og livmoderkræft. Alligevel er CA-125 anses for valgfri og CT-scanning anbefales kun som indikeret klinisk ved National Comprehensive Cancer Network (NCCN) retningslinjer [17]. Op mod 50% af patienter med kræft i æggestokkene med normale CA125 niveauer efter kemoterapi alligevel har vedvarende sygdom, men skelne mellem patienter udelukkende på denne biomarkør er i øjeblikket ikke muligt [18]. For ~ 50% af patienter med vedvarende sygdom, den forøgede sensitivitet og specificitet ydes af en genomics tilgang kan tillade yderligere sub-kategorisering af patienter til at hjælpe med at differentiere sygdom og terapeutiske undertyper. CA-125 er også i vid udstrækning til udtryk i andre væv og er forhøjet i godartede processer såsom endometriose, uterin leiomyomata, godartede adnexal masserne, tubal inflammation, leversygdom, hjerteinsufficiens, menses, og graviditet, begrænser dens anvendelighed i overvågning af ovariecancer [ ,,,0],19]. Endelig med en halveringstid skønnes at ligge mellem 9-44 dage [20], CA-125 kan ikke tilbyde så hurtig en reaktion på ændringer tumor volumen som ctDNA. På den anden side, mens CT scanning er den standard tilgang i evalueringen af ​​tilbagefald af sygdom, i vores kohorte var der seks tilfælde af negativ CT billeddannelse med påviselig ctDNA i ansigtet af residual sygdom. Desuden og som nævnt ovenfor, en stigning i ctDNA forud radiologisk tegn på tumor tilbagefald, i gennemsnit med 7 måneder.

I en række andre typer kræft, ctDNA niveauer er blevet påvist, at tættere korrelere med ændringer i tumor volumen end i øjeblikket tilgængelige biomarkører [8], men langsgående humane undersøgelser korrelerer ctDNA niveauer med tumor byrde i gynækologiske maligniteter havde manglet. Tidligere vores gruppe rapporterede om påvisning af genetiske omrokeringer, specielt fusion begivenheder og deres anvendelse som ctDNA assays til med tilbagevirkende kraft at overvåge en patient med fremskreden ovariecancer [16]. Begrundelsen for at indlede vores undersøgelse var, at hun på trods af dette patients historie tilsyneladende klinisk remission baseret på flere negative kliniske, biokemiske og radiologiske undersøgelser havde flere gentagelser. I en periode på fire år, at patienten gennemgik primære debulking kirurgi og kemoterapi, tumor gentagelser, og flere kemoterapeutiske regimer. Blodprøver blev på langs indsamles og lagres i vores Biobank som en del af et forskningsprogram. Henviser postkirurgiske CA125-niveauer var forhøjet kun tre gange i 28 målinger af den specifikke fusion ctDNA biomarkør var let påviselig i alle disse samme blodprøver og i tumoren gentagelser. Selvom vi ikke direkte korrelerer ctDNA mængde med tumor byrde, tumor-specifikke fusion ctDNA fortsatte med at være påviselig i tider med tilsyneladende klinisk remission, viser evnen til ctDNA at opdage okkult sygdom i kræft i æggestokkene.

I denne nærværende undersøgelse, vi nu demonstrere evnen til følsomt opdage enkelt punktmutationer ved digital PCR på særlige selv ud over 0,01% fra en kompleks prøve. Ved hjælp af denne rørledning, når patientspecifikke ctDNA sonder er blevet genereret og valideret, kan afprøvning af serumprøver være afsluttet inden for timer og er let integreres i et overvågningsprogram (S3 Fig). Vores tilgang kræver forudgående kendskab til tumorspecifikke genetiske ændringer i patientens tumor. I denne undersøgelse anvendte vi en kombination af WES og en målrettet panel, som er rettet mod 50 almindeligt muterede onkogener og tumor suppressorer. Denne kombinerede tilgang gav os mulighed for at generere ctDNA sonder for 82% af kvinderne i vores undersøgelse. Som forventet, WES identificeret mutationer i 8/8 af tumor prøver. Kræften panel, som vi brugte tilladt os at afhøre 207 amplikoner tværs 50 onkogener og tumorsuppressorgener på et meget højt dækning og resulterede i identifikationen af ​​mutationer i 28/36 (78%) prøver. I fremtiden brug af sekventering paneler specifikt fokuseret på æggestokkene og livmoderkræft bør give mulighed for en endnu mere robust og effektiv identifikation platform.

Målet med disse næste generation overvågningsundersøgelser er at opdage sygdommen tilbagefald tidligere, så at patienter vil være mere optimale kirurgiske kandidater, deres behandlinger mere effektivt personlig og, hvis og når det er nødvendigt, visiteres til terapeutiske forsøg. Omvendt for nogle kvinder, kan brugen af ​​ctDNA-baserede biomarkører reducere antallet af unødvendige indgreb, resultere i mindre over behandling og omgå de økonomiske omkostninger og stråling i forbindelse med CT billeddiagnostiske undersøgelser. I sidste ende, nu hvor ctDNA har vist sig at påvise residual sygdom tidligere og kan skelne mellem kvinder med værre og forbedret overlevelse i ovarie- og endometriale cancere, kliniske undersøgelser, der definerer nytten af ​​ctDNA som overvågning redskab i gynækologiske cancere kan nu konstrueret.

Støtte Information

S1 fig. Oversigt over ctDNA analyse rørledning

doi:. 10,1371 /journal.pone.0145754.s001

(TIF)

S2 Fig. Nøjagtighed og reproducerbarhed ddPCR assay i PT208. (TP53 mutation; CHR17: 7.577.539; G A) for ctDNA detektion og kvantificering

(A) Indhold linearitet blev bestemt ved at analysere serielle fold tumor allel fraktion fortyndinger. Mutant eksemplarer opdaget af ddPCR systemet blev støttet af en R

2 af 0,99. (B) Den nedre detektionsgrænse for dette assay blev etableret ved at tilsætte serielle tumor DNA fortyndinger i en base af 100000 kopier af genom-ækvivalenter fra patientens germlinie DNA. Fractional mutation koncentration procenter varierede fra 0,025 til 0,002 og blev analyseret ved ddPCR. Mutation fraktion blev detekteret så lavt som 0,002%. (C) Gentagne reproducerbarhed for ctDNA detektion. Pearson korrelation mellem de enkelte replikater beregnes og vises (Pearson r = 0,99) (D) Aftale af mutant allel fraktion beslutsomhed mellem sekventering og ddPCR (p = 4.47E-15)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0145754. S002

(TIF)

S3 fig. Nuværende og foreslåede gynækologisk overvågning algoritme

doi:. 10,1371 /journal.pone.0145754.s003

(TIF)

S1 Table. Kandidat tumor specifikke mutationer identificeret af WES og målrettet sekventering.

Prøver forhørt af WES er fremhævet med en stjerne.