PLoS ONE: Long Term Effekt af curcumin i forordning af glykolytisk Pathway og angiogenese via Graduering af Stress Aktiveret gener i forebyggelse af kræft

abstrakt

Oxidativ stress, en vigtig faktor i modulering af glycolytiske vej og induktion af stress aktiverede gener, forøges yderligere på grund af reduceret antioxidantforsvarssystem, som fremmer udviklingen af ​​kræft via inducere angiogenese. Curcumin, et naturligt forekommende kemoforebyggende fytokemiske, er rapporteret at inhibere carcinogenese i forskellige eksperimentelle dyremodeller. Men den underliggende mekanisme er involveret i anticarcinogenic virkning af curcumin på grund af sin langsigtede virkning er stadig rapporteres på grund af dens hurtige metabolisme, selvom metabolitter akkumuleres i væv og forblive i længere tid. Derfor er den langsigtede effekt af curcumin brug grundig undersøgelse. Den foreliggende undersøgelse har til formål at analysere anticarcinogen virkning af curcumin i leveren, selv efter tilbagetrækningen af ​​behandling i Dalton lymfom bærer mus. Oxidativt stress observeret under lymfom progression reduceret antioxidant enzymaktiviteter og induceret angiogenese samt aktivering af tidlige stress aktiverede gener og glycolytiske vej. Curcumin behandling resulterede i aktivering af antioxidant enzym superoxiddismutase og nedregulering af ROS niveau samt aktiviteten af ​​ROS producerer enzymet NADPH: oxidase, udtryk for stress aktiverede gener HIF-1α, cMyc og LDH aktivitet over normalt niveau. Endvidere det føre til signifikant inhibering af angiogenese, observeret via MMP’er aktivitet, PKCa og VEGF-niveau, såvel som af matrigel plug assay. Således resultaterne af denne undersøgelse konkludere, at den langsigtede effekt af curcumin viser anticarcinogenic potentiale via induktion af antioxidant forsvarssystem og hæmning af angiogenese via nedregulering af stress aktiverede gener og glycolytiske vej i lever af lymfom bærende mus.

Henvisning : Das L, Vinayak M (2014) Long Term Effekt af curcumin i forordning af glykolytisk Pathway og angiogenese via Graduering af stress Aktiveret gener i forebyggelse af kræft. PLoS ONE 9 (6): e99583. doi: 10,1371 /journal.pone.0099583

Redaktør: Gautam Sethi, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, Singapore

Modtaget: Marts 25, 2014 Accepteret: 15. maj 2014 Udgivet 16. juni, 2014

Copyright: © 2014 Das, Vinayak. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle data er inkluderet i papiret

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af tilskud fra Institut for Videnskab og Teknologi (Grant nr-SR /S0 /AS-97/2007), Indiens regering til MV . Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Forhøjede reaktive ilt arter (ROS), såsom superoxid radikaler og H

2O

2 fungerer som signalmolekyler i forskellige aspekter af vækstfaktor-medierede reaktioner herunder angiogenese under kræft progression. Den største kilde til ROS produktion reguleres af NADPH-oxidase. Det vaskulære endotel vækstfaktor (VEGF) er en stor angiogenese inducer, som stimulerer proliferation, migration og rør-dannelse af endotelceller (EC’er) gennem VEGF-receptor type2. VEGF-induceret angiogenese er medieret af protein kinase C (PKC), som PKC er involveret i signalvejen af ​​VEGF-medieret tumorudvikling og angiogenese [1]. PKCa fremmer angiogen aktivitet af endotelceller via induktion af VEGF og VEGF øger sin egen ekspression via PKCa-afhængig positiv feedback mekanisme [2]. Endvidere er VEGF reguleres på transkriptionelt niveau ved hypoxi-inducerbar faktor 1-α (HIF-1α) som respons på hypoxi [3], [4]. HIF-1 regulerer ikke blot ilttilførsel (angiogenese), men oxygenforbruget (glykolytisk metabolisme) også i hypoxisk tumormikromiljøet [5]. Ekspression af en række gener, der starter med onkogen-medieret efterfulgt af HIF-1 medierede gener induceres der fremmer metaboliske ændringer under carcinogenese. Det resulterer i den meget glykolytisk “Warburg” fænotype og undertrykkelse af mitokondrie biogenese [6]. Opreguleringen af ​​lactat dehydrogenase A (LDH-A) er en større molekylær mediator af Warburg virkning, som forekommer selv i aerob tilstand som følge af hypoxisk tumormikromiljøet og ændringer i visse onkogener eller tumorsuppressorgener [7]. Desuden er overekspressionen af ​​LDH-A reguleret af HIF-1 samarbejde med deregulerede c-Myc. Det er blevet observeret, at onkogen aktivering via dereguleret ekspression af c-Myc bidrager til tumorigenese i forskellige væv i transgene mus og mange typer af humane cancere herunder lymfomer [8]. Således er deregulering i ekspression af onkogener, tumorsuppressorgener og stabilitet gener involveret i carcinogenese, der resulterer i et reduceret niveau af antioxidant forsvar i tumormikromiljøet og cancerceller [9]. Endvidere matrixmetalloproteinase (MMP’er) er zink-afhængige proteolytiske enzymer, spalter ekstracellulær matrix såvel som ikke-matrix substrater (vækstfaktorer, celleoverfladereceptorer, osv) og regulere signalveje, der kontrollerer cellevækst, inflammation, eller angiogenese. Det fungerer som modulator af tumormikromiljøet og kan endda arbejde i et proteolytisk måde. Dereguleringen af ​​MMP’er er involveret i mange sygdomme, såsom tumormetastase, rheumatoid arthritis og periodontal sygdom [10], [11]. Desuden MMP’er genaktivere angiogene aktivitet af VEGF ved selektiv nedbrydning af bindevæv vækstfaktor (CTGF), som en af ​​isoformerne af VEGF binder CTGF og angiogen aktivitet af VEGF inhiberes i VEGF-CTGF-komplekset [12]. Således kan inhibering af angiogene aktiviteter via modulering af glycolytiske vej, aktivering af endogen antioxidant forsvarssystem og hæmning af ROS-dannelse være et skridt til at forhindre carcinogenese. Under udviklingen af ​​Daltons lymfom (en murin transplanterbar non-Hodgkins T-cellelymfom), er forskellige dele påvirkes herunder lever og knoglemarv uden lymfesystemet. Lever er den væsentligste metaboliske og afgiftende organ i kroppen er stærkt påvirket under lymfom progression. Derudover har metastase og malignitet blevet bekræftet tidligere i leveren for Dalton lymfom lejet (DL) mus, som er kendetegn for non-Hodgkins lymfom [13], [14].

bred vifte af naturligt forekommende fytokemikalier kan giver optimale sundhedsmæssige fordele for mennesker. Anvendelsen af ​​hele ekstrakt eller enkeltstrenget isoleret bestanddel eller en metabolit af en isoleret bestanddel til at opnå ønskelige sundhedsmæssige fordele har været et problem for de sidste mange år. Curcumin, et naturligt forekommende kemoforebyggende phytochemical stammer fra gurkemeje (

Curcuma longa

), er rapporteret at hæmme kemisk induceret carcinogenese på flere orgel websteder i forskellige eksperimentelle dyremodeller. Curcumin undertrykker aktivering af flere transkriptionsfaktorer, som er impliceret i onkogene aktiviteter, blokke transformation, proliferation og invasion samt inducerer apoptose i tumorceller. curcumin viser således enorme lovende for behandling af cancer [15]. Det er dog stadig rapporteres om anticarcinogen virkning af curcumin skyldes den samlede virkning af dets metabolitter eller på grund af selve curcumin, som metabolisme af curcumin er meget hurtig, men metabolitter forbliver i længere tid i forskellige væv [16]. Endvidere akkumulerende beviser tyder på, at forbruget af hele eller delvist oprensede fødevareekstrakter er mere fordelagtig i single-isoleret bestanddel på grund af eksistensen af ​​synergistiske interaktioner blandt fytokemikalier i hele fødevarer [17], [18]. Derfor blev denne undersøgelse designet til at undersøge den mekanisme er involveret i anticarcinogenic virkning af curcumin selv efter tilbagetrækningen af ​​administration. Undersøgelsen fokuserer på glykolytisk vej og angiogenese, samvirkende reguleret af c-myc og HIF-1 under oxidativ tumor mikromiljø i metastatisk lever af lymfom bærende mus.

Materialer og metoder

Reagenser

Alle kemikalier var af analytisk og molekylærbiologisk kvalitet samt endotoksinfrit og anvendt uden yderligere oprensning. Curcumin, reagenser til RNA-isolering og Taq-polymerase, ikke-fluorescerende 2 ‘, 7’-dichlorfluorescein-diacetat (H2DCFDA) og HRP konjugeret anti-β actin blev indkøbt fra Sigma-Aldrich. Revers transkriptase, ribonucleaseinhibitor, tilfældige primere og 100 bp Plus DNA-stige fra Fermentase Life Science og gen specifikke primere til RT-PCR blev syntetiseret fra Metabion. Anti-muse PKCa og VEGF-A antistof blev indkøbt fra Santacruz bioteknologi og Biolegend hhv. HRP-konjugeret gede-anti-kanin og kanin-anti-rotte-sekundært antistof fra Bangalore Genei. Matrigel basalmembran matrix fra BD Biosciences, gelatine fra Amresco og ECL (Super signal Kit) blev købt fra PIERCE Biotechnology.

Dyr og induktion T-celle lymfom (Dalton lymfom)

Mus (AKR stamme) blev avlet og opretholdt under standard laboratorieforhold med ordentlig menneskelig omsorg, som pr retningslinjerne i den institutionelle dyr etisk komité, ved 25 ± 2 ° C under en 12 timer lys /12 timer mørke tidsplan forsynet med standard mus foder og drikkevand

ad libitum

. Alle forsøgene dyr blev udført med godkendelse af Institutional Animal Etisk Udvalg, Banaras Hindu University. Sunde voksne hanmus (16-20 uger gamle og 30 ± 2 g) blev anvendt i det eksperimentelle arbejde. Dalton lymfom (transplanterbar non-Hodgkins T-celle lymfom) ascites-celler blev transplanteret til voksne hanmus gennem intraperitoneal (ip) seriel transplantation af ca. 1 × 10

6 levedygtige ascites tumorceller i 1 ml phosphatbuffer saltvand (PBS) per mus som tidligere beskrevet [19]. Dalton lymfom ascites celler blev begavet af prof Ajit Sodhi, School of Biotechnology, Banaras Hindu University, Varanasi, Indien. Dalton lymfom er en transplanterbar murine T-celle lymfekræft opstod i thymus af et DBA /2 mus på National Cancer Institute, Bethesda, MD, i 1947. [20].

Udvikling af DL blev bekræftet af unormal abdominal hævelse og øget kropsvægt, som var synlige tydeligt på 10-11 dage efter transplantation og DL mus overlevede i 20 ± 2 dage. Første 7-9 dage startende fra næste dag i DL transplantation, var væksten i Daltons lymfom ikke nogen større ændring i kropsvægt og ascites væskeophobning. Således første 7-9 dage kan sammenlignes med nølefase /forberedende fase af S-formede kurve for vækst ascites cellepopulation. Derfor tidsplan for curcumin behandling til DL-mus blev valgt i overensstemmelse hermed i 9 dage startende fra næste dag efter DL transplantation og mus blev aflivet på dag 18 af post DL transplantation (før DL mus dør naturligt) for at få den langsigtede effekt af curcumin, som curcumin skal være helt metaboliseres til dets metabolitter inden 9 dage fra sidste behandlingsdag. Derfor ville effekten være ikke skyldes den direkte virkning af curcumin, men kan være på grund af de metabolitter af curcumin.

Tidsplan for curcumin behandling til DL mus og væv samling

En gruppe af normal mus blev anvendt som kontrol, uden nogen behandling (N). DL-mus blev tilfældigt inddelt i fem grupper med 6 mus i hver gruppe (n = 6). Tre grupper blev behandlet med forskellige doser af curcumin: 1,5 mg [Daltons lymfom bærende mus behandlet med 50 mg curcumin /kg legemsvægt (DLT50)], 3 mg [Daltons lymfom bærende mus behandlet med 100 mg curcumin /kg legemsvægt (DLT100) ], og 4,5 mg [Daltons lymfom bærende mus behandlet med 150 mg curcumin /kg legemsvægt (DLT150)], opløst i 50 pi DMSO til hver mus per dag gennem ip i 9 dage i træk, startende fra den næste dag efter DL transplantation. En gruppe DL mus modtog 50 pi DMSO som bærer (DL + DMSO) på tilsvarende måde og anden gruppe af DL-mus blev anvendt uden nogen behandling (DL). Alle musene fra hver gruppe blev aflivet på dag 18 af post DL transplantation ved cervikal dislokation. Leveren blev udskåret umiddelbart efter aflivning af dyret og vasket i afkølet normal saltopløsning. Lever af alle dyr (n = 6) af den ene gruppe blev poolet og blandet ved snitning aseptisk ved 4 ° C i gennemsnit resultat. Indsamlet væv blev anvendt øjeblikkeligt eller opbevaret ved -80 ° C til yderligere undersøgelse.

In vivo

angiogenese assay

Et andet sæt af seks grupper med tre mus pr grupper blev taget at studere

in vivo

angiogenese. Alle behandlinger var samme som ovenfor bortset fra, at, på tidspunktet for DL ​​transplantation, blev hver mus fra alle grupper subkutant injiceret med 500 pi BD Matrigel basalmembranmatrix (Matrigel stik). Lige efter at ofre blev Matrigel plugs fjernet. Stik blev straks fotograferet og vejet. At kvantificere vaskularisering af proppen blev mængden af ​​hæmoglobin (Hb) akkumuleret i proppen målt under anvendelse HEMOCOR-D kit (Crest Biosystems, Tulip Gruppen, Indien) ved at følge fabrikantens protokol og absorbansen af ​​prøverne blev målt ved 540 nm.

RT-PCR

Samlet RNA blev isoleret ved hjælp af TRI Reagent (Sigma-Aldrich) som i dens brugermanual. DNase-behandling blev udført på totalt RNA ved anvendelse TURBO DNA-Free ™ Kit I for at fjerne enhver genomisk DNA-kontaminering. RNA blev kvantificeret ved 260 nm og integriteten blev kontrolleret ved 1% formaldehyd-agarose-gelelektroforese. CDNA’et blev syntetiseret fra isolerede totalt RNA under anvendelse af en standard blanding indeholdende hver dNTP’er, tilfældig hexamer, M-MuLV revers transkriptase, RNase inhibitor og reaktionspuffer ifølge standardprotokollen af ​​Fermentas Life Science, og cDNA blev anvendt øjeblikkeligt eller opbevaret ved -80 ° C. Ekspression af isozymer af SOD og NOX, HIF-1α, cMyc, LDH-A, PKCa, VEGF-A og MMP 9 2-gener blev undersøgt ved semi-kvantitativ RT-PCR under anvendelse af syntetiseret cDNA. Taq-polymerase og passende primerpar (tabel 1) blev anvendt til PCR-reaktioner ved anvendelse Termocycler (Applied Biosystem). PCR blev startet med 3 minutter ved 95 ° C til denaturering efterfulgt af tretrins temperaturcyklus (tabel-1). En endelig ekstension ved 72 ° C i 7 min var inkluderet efter den sidste cyklus for at fuldføre polymerisationen. Antal cykler blev optimeret i den eksponentielle fase af amplifikationen. Størrelsen af ​​amplificerede produkter blev undersøgt ved agarosegelelektroforese under anvendelse af 100 bp stigen. Bandet intensitet af amplificerede produkter i agarosegelen blev visualiseret, fotograferet og analyseret ved hjælp af Gel Doc System (Alpha Innotech

EF). Endvidere blev båndintensitet normaliseret med tilsvarende bane af β-actin som intern kontrol.

Ikke-denaturerende PAGE og specifik aktivitet farvning

Aktivitetsgel assays blev anvendt til at måle enzymaktiviteten og isozymerne mønster af antioxidant enzym SOD samt NOX og LDH. Som ændringer af enzymatisk aktivitet er associeret med metaboliske ændringer, ikke-denaturerende PAGE-analyse og aktivitet gel assay blev foretrukket frem immunodetektion, fordi den fremgangsmåde anvender substratspecificitet baseret detektion af kun aktiv del af proteinet. Således anses det yderst relevant til at korrelere en ændring i niveauet af et specifikt isozym med den for stofskifteforandringer på celleniveau.

superoxiddismutase (SOD)

Aktiviteten gel assay af SOD blev udført ved ikke-denaturerende PAGE, efterfulgt af aktivitet farvning som pr metoden ifølge Beauchamp og Fridovich [21]. Samme mængde protein fra hver prøve blev separeret ved 10% ikke-denaturerende PAGE ved 4 ° C. Efter elektroforese blev gelen gennemvædet i 1,23 mM NBT-opløsning i 20 minutter under mørke. Gelen blev kortvarigt vasket i destilleret vand og inkuberet i 15-20 minutter under mørke i 100 mM phosphatbuffer (pH-7,0) indeholdende 28 mM TEMED og 0,28 mM riboflavin. Derefter blev gelen udsat for et fluorescerende lys, indtil fremkomsten af ​​klare zoner af aromatiske aktivitet bånd med blå baggrund. Intensiteten af ​​båndene blev analyseret ved densitometrisk scanning med en Alpha Image Analyser System (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA)

Aktivitet farvning af NADPH:. Oxidase

Niveauet af enzymaktivitet NOX-isozymer blev identificeret i ikke-denaturerende PAGE, efterfulgt af aktivitet farvning med NBT reduktion beskrevet af Sagi og Fluhr [22]. Samme mængde protein fra hver prøve blev separeret ved 10% ikke-denaturerende PAGE ved 4 ° C. Efter elektroforese blev gelen farvet i 50 mM Tris-CI (pH-7,4) 0,2 mM NBT, 0,1 mM MgCI2 og 1 mM CaCl2, i mørke i 20 min. Derefter 0,2 mM NADPH blev tilsat til farvningsopløsning og blev observeret forekomsten af ​​blå formazan bands. Reaktionen blev stoppet ved nedsænkning af gelerne i destilleret vand. Intensiteten af ​​båndene blev analyseret ved densitometrisk scanning med en Alpha Image Analyser System (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).

Aktivitet farvning af lactatdehydrogenase (LDH)

I gel enzymatisk aktivitetsassay af lactatdehydrogenase blev udført ved ikke-denaturerende PAGE efterfulgt af specifik aktivitet farvning som beskrevet af Dietz og Lubrano [23]. Samme mængde protein fra hver prøve blev separeret med 8% ikke-denaturerende PAGE ved 4 ° C. Efter elektroforese blev gelen underkastet specifikke LDH aktivitet farvning i farvningsopløsning indeholdende 125 mM Tris-CI (pH-7,4), 0,5 mM magnesiumchlorid, 0,1 mM lithium-lactat, 1 mg /ml NAD, 10 mM NaCl, 0,25 mg /ml NBT og 0,025 mg /ml PMS under forsigtig omrystning i 5-10 min ved stuetemperatur, efter udvikling af LDH bands gelen blev vasket. Intensiteten af ​​båndene blev analyseret ved densitometrisk scanning under anvendelse af en Alpha Image Analyser System (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).

Hydrogenperoxid assay

Hydrogenperoxid niveau i levervævet var målt spektrofotometrisk ved at tage absorbansen ved 570 nm som beskrevet tidligere [24]. Koncentrationen af ​​H

2O

2 i hver prøve blev bestemt ved hjælp af standardkurven, der genereres ved at tage kendte mængder af H

2O

2, og udtrykt i pmol /mg protein.

ROS Assay

Total ROS-niveauet blev bestemt ved den oxidative omdannelse af ikke-fluorescerende 2 ‘, 7′-dichlorfluorescein-diacetat (H2DCFDA) til højt fluorescerende 2′, 7’-dichlorfluorescein (DCF) som tidligere beskrevet [25 ]. Lever ekstrakter af beløb 100 pi blev inkuberet ved 37 ° C i 60 min med 100 pi 2 mM H2DCFDA (Invitrogen) i PBS. Fluorescens blev registreret ved 485 nm (excitation) og 527 nm (emission) med HITACHI F-3000 fluorescensspektrofotometer. Niveauet af ROS i hver prøve blev bestemt ved at observere fluorescensen (absorbans) /mg protein.

gelatinezymografi

Aktivitet af MMP’er i vævsprøve blev analyseret for at studere gelatine nedbrydende aktivitet ved anvendelse af zymografi som beskrevet tidligere [26]. Samme mængde protein fra hver prøve blandet med tilsvarende volumen af ​​2X ikke-reducerende puffer (0,125 M Tris-CI pH-6,8, 20% glycerol, 4% SDS, 0,003% bromphenolblåt) blev separeret ved 4 ° C med 8% løse og 5% stacking SDS-PAGE indeholdende 0,1% gelatine. Efter elektroforese blev gelen vasket to gange i 2,5% Triton X-100 i 20 minutter hver for at fjerne SDS og renaturere enzymerne. Gelen blev derefter inkuberet i 20 h ved 37 ° C i buffer indeholdende 21 mM Tris-CI (pH-7,6), 10 mM CaCl2, og 0,04% NaN3. Derefter blev gelen vasket i destilleret vand, farvet med CBB og affarvet i methanol og eddikesyre. Protease-aktivitet blev observeret som en klar bånd af spaltet gelatine. Intensiteten af ​​båndene blev analyseret ved densitometrisk scanning under anvendelse af en Alpha Image Analyser System (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved SPSS software ved hjælp af en way ANOVA efterfulgt af Tucky test. Værdier blev udtrykt som middel ± S.E.M. opnået fra tre forskellige sæt af eksperimenter, s 0,05 blev taget som statistisk signifikant (95% konfidensinterval). # P 0,05 og ## 0,01 i forhold til N, * p 0,05 og ** p. 0,01 sammenlignet DL + DMSO gruppe henholdsvis

Resultater

Expression og enzymatiske aktivitet af SOD

ekspressionen af ​​SOD i leveren hos DL og DL + DMSO-mus viste sig at være nedreguleret væsentligt i forhold til det normale. Udtrykkene for både Mn-SOD og Cu /Zn-SOD i DL-mus var 75% og 78% af normale mus henholdsvis og 82% og 69% af normale henholdsvis i DL + DMSO. Signifikant opregulering af ekspressionen af ​​både de isozymer af SOD blev fundet i retning normale niveau af curcumin behandling; Mn-SOD blev opreguleret op 1,21 gange og 1,22 gange DL + DMSO mus med 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt henholdsvis og Cu /Zn-SOD op 1,15 gange, 1,42 gange og 1,1 gange af DL + DMSO med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt henholdsvis [fig. 1 (A)]. Tilsvarende aktivitet SOD følger også lignende tendens variation i udtrykket. Aktiviteten af ​​Mn-SOD i DL og DL + DMSO-mus viste sig at være 65% og 63% af normale mus hhv. Curcumin behandling forhøjet aktivitet i dosisafhængig måde, som var omtrent op 1,3 gange, 1,39 gange og 1,58 gange af DL + DMSO i 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt henholdsvis. Tilsvarende blev aktiviteten af ​​Cu /Zn-SOD faldt i DL og DL + DMSO-mus op 61% og 61,5% af normale mus hhv. Curcumin behandling var i stand til at øge aktiviteten af ​​Cu /Zn-SOD i lignende dosisafhængig måde, omtrent op 1,24 gange, 1,35 gange, 1,5 gange af DL + DMSO-mus med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt henholdsvis [Fig. 1 (C)].

Virkning af curcumin på mRNA-ekspression og enzymatisk aktivitet af SOD isozymer i leveren af ​​lymfom bærende mus (A) RT-PCR af Mn-SOD, Cu /Zn-SOD og β-actin gen, (B) densitometrisk scanning af Mn-SOD og Cu /Zn-SOD-gener efter normalisering med β-actin, (C) specifik farvning viser aktiviteten af ​​SOD isozymer, (D) densitometrisk scanning af aktiviteten bånd af SOD isozymer. Lever fra alle seks dyr i hver gruppe blev samlet separat og anvendes til ekstraktion af total RNA og proteiner til ikke denaturerende tilstand. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. # P 0,05 i forhold til N-gruppen og * p 0,05 sammenlignet med DL + DMSO gruppe hhv. Cur er curcumin, M er 100 bp markør og bw er kropsvægt. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 betegner normal, Dalton lymfom bærende, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Daltons lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt opløst i DMSO hhv.

ekspression og enzymatisk aktivitet af NOX

iagttoges ekspressionen af ​​NOX1 og NOX2 sig at være signifikant opreguleret i DL og DL + DMSO-mus i sammenligning med normale mus, som blev moduleret i retning normalt niveau ved curcumin behandling [fig. 2 (A)]. Ekspressionen af ​​NOX1 viste sig at være cirka 1,75 gange og 1,44 gange den normale mus i leveren af ​​DL og DL + DMSO-mus hhv. Curcumin behandling reducerede ekspressionen, som var ca. 83%, 86% og 72% af DL + DMSO-mus med en dosis på 50, 100 og 150 mg /kg legemsvægt henholdsvis. Tilsvarende forhold til normal, var ekspression af NOX2 sig at være ca. 2,7 gange og 2,38 gange i leveren af ​​DL og DL + DMSO-mus henholdsvis som ned blev reguleret efter curcumin behandling som observeret at være ca. 60%, 86% og 87% af DL + DMSO mus med en dosis på 50, 100 og 150 mg /kg legemsvægt hhv. Tilsvarende blev der observeret aktivitet af NOX at være forhøjet som dens mRNA-ekspression. NOX regulerer dannelsen af ​​ROS; derfor aktiviteten af ​​NOX kan måles som en indikator for ROS niveau. Sammenlignet med normale mus, aktivitet af NOX1 var ca. 1,6 gange og 1,45 gange hvor som aktiviteten af ​​NOX2 var 1,37 gange og 1,3 gange i leveren af ​​DL og DL + DMSO-mus hhv. Forskellige doser af curcumin behandling signifikant moduleret aktiviteten mod normale niveau. Aktivitet af NOX1 viste sig at være ca. 86%, 70% og 80% af DL + DMSO-mus, mens aktiviteten af ​​NOX2 fandtes at være ca. 78%, 84% og 84% af DL + DMSO mus med en dosis på 50, 100 og 150 mg /kg legemsvægt henholdsvis [fig. 2 (C)].

Virkning af curcumin på mRNA-ekspression og enzymatisk aktivitet af NOX isozymer i leveren af ​​lymfom bærende mus (A) RT-PCR af NOX2, NOX1 og p-actin-gener, (B) Densitometrisk scanning af NOX2 og NOX1 gener efter normalisering med β-actin, (C) specifik farvning viser aktiviteten af ​​NOX isozymer, (D) Densitometrisk scanning af aktiviteten bånd af NOX isozymer. Lever fra alle seks dyr i hver gruppe blev samlet separat og anvendes til ekstraktion af total RNA og proteiner til ikke denaturerende tilstand. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. # P 0,05 og ## 0,01 i forhold til N-gruppe, * p 0,05 og ** p 0,01 i forhold til DL + DMSO gruppe hhv. Cur er curcumin, M er 100 bp markør og bw er kropsvægt. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 betegner normal, Dalton lymfom bærende, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Daltons lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt opløst i DMSO hhv.

niveau af H

2O

2 og total ROS i levervæv

niveauet af H2O2, at være en indikator for oxidativ stress afspejler oxidative status af væv. Niveauet af hydrogenperoxid i leveren af ​​DL og DL + DMSO-mus var forhøjet betydeligt, op til ca. 1,47 gange og 1,39 gange den normale mus hhv. Curcumin behandling reducerede signifikant niveau op 82% af DL + DMSO mus med 100 mg curcumin /kg legemsvægt mus, og 96% og 90% af DL + DMSO mus med 50 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt mus henholdsvis [Fig. 3 (A)]. ROS syntetiseret af NOX samt fra andre kilder fungerer som en vigtig signalmolekyle i oxidativ tumor mikromiljø at fremkalde onkogen transformation. Samlet ROS niveau i form af fluorescens (absorbans) /mg protein var signifikant forhøjet i DL og DL + DMSO mus op ca. 2,59 gange og 2,64 gange af normale mus. Behandling af curcumin undertrykt ROS niveau væsentligt, som blev observeret at være ca. 62%, 51% og 67% af DL + DMSO-mus med en dosis på 50, 100 og 150 mg /kg legemsvægt henholdsvis [Fig. 3 (B)].

Effekt af curcumin på oxidativt stress i form af total H2O2 niveau og total ROS niveau i lever af lymfom bærende mus (A) Histogram viser total H2O2 niveauet i forskellige grupper, (B) Histogram viser den samlede ROS niveau i forskellige grupper. Lever fra alle seks dyr i hver gruppe blev samlet separat og homogenat blev fremstillet til bestemmelse af H2O2 og ROS niveau. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. # P 0,05 i forhold til N-gruppe, * p 0,05 sammenlignet med DL + DMSO gruppe hhv. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 betegner normal, Dalton lymfom bærende, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Daltons lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt opløst i DMSO hhv.

Angivelse af HIF-1α og cMyc

mRNA ekspressionen af ​​HIF-1α og cMyc blev undersøgt som en tidlig reaktion stress-gen og onkogen henholdsvis hypoxisk tumor mikromiljø. Ekspressionen af ​​både HIF-1α og cMyc blev opreguleret i DL og DL + DMSO-mus i sammenligning med normale mus, som var væsentligt sænket ved curcumin behandling [Fig. 4 (A)]. Ekspressionen af ​​HIF-1α i leveren hos DL og DL + DMSO-mus viste sig at være ca. 1,85 gange og 1,51 gange den normale mus hhv. Expression niveau efter curcumin behandling var ca. 93%, 91% og 78% af DL + DMSO mus med en dosis på 50, 100 og 150 mg /kg legemsvægt hhv. Tilsvarende ekspression af cMyc viste sig at være ca. 2,03 gange og 1,45 gange den normale mus i leveren af ​​DL og DL + DMSO-mus henholdsvis og efter curcumin behandling ekspressionen blev reduceret til ca. 95%, 83% og 78% af DL + DMSO mus med en dosis på 50, 100 og 150 mg /kg legemsvægt hhv.

Effekt af curcumin på mRNA ekspressionen af ​​stress aktiverede gen HIF-1α og cMyc i lever af lymfom bærende mus (A) RT -PCR af HIF-1α, cMyc og p-actin-gener, (B) densitometrisk scanning af HIF-1α og cMyc gener efter normalisering med β-actin. Lever fra alle seks dyr i hver gruppe blev samlet separat og anvendes til ekstraktion af total RNA. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. # P 0,05 og ## 0,01 i forhold til N-gruppe, * p 0,05 sammenlignet med DL + DMSO gruppe hhv. Cur er curcumin, M er 100 bp markør og bw er kropsvægt. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 betegner normal, Dalton lymfom bærende, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Daltons lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt opløst i DMSO hhv.

Expression og enzymatiske aktivitet af LDH-A

mRNA ekspressionen af ​​LDH-A i lever af DL og DL + DMSO mus opreguleret op til ca. 1,4 gange og 1,4 fold af normale mus hhv. Alle doser af curcumin væsentligt ned reguleret udtrykket. Ekspressionen efter curcumin behandling viste sig at være ca. 90%, 79% og 80% af DL + DMSO-mus med en dosis på 50, 100 og 150 mg /kg legemsvægt henholdsvis [Fig. 5 (A)]. Pyruvat kan ikke metaboliseres aerobt men omdannes til lactat af LDH-A i hypoxisk tumormikromiljøet. Derfor kan glycolytiske metabolisme overvåges med hensyn til aktiviteten af ​​LDH-A. Aktiviteten af ​​LDH-A viste sig at være forhøjet op ca. 1,76 gange og 1,64 gange den normale mus i leveren af ​​DL og DL + DMSO-mus hhv. Behandling af curcumin signifikant reduceret aktivitet LDH-A, hvilket var næsten 75%, 67% og 85% af DL + DMSO-mus med doser på 50, 100 og 150 mg /kg legemsvægt henholdsvis [Fig. 5 (C)].

Virkning af curcumin på mRNA-ekspression og enzymatisk aktivitet af LDH-A i leveren af ​​lymfom bærende mus (A) RT-PCR af LDH-A og p-actin-gener, (B) densitometrisk scanning af LDH-A, efter normalisering med β-actin, (C) specifik farvning viser aktiviteten af ​​LDH-A, (D) densitometrisk scanning af aktiviteten bånd af LDH-A. Lever fra alle seks dyr i hver gruppe blev samlet separat og anvendes til ekstraktion af total RNA og totale proteiner ved ikke denaturerende tilstand. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. # P 0,05 og ## 0,01 i forhold til N-gruppe, * p 0,05 og ** p 0,01 i forhold til DL + DMSO gruppe hhv. Cur er curcumin, M er 100 bp markør og bw er kropsvægt. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 betegner normal, Dalton lymfom bærende, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Daltons lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt opløst i DMSO hhv.

Expression og protein niveau PKCa

mRNA ekspressionen af ​​PKCa viste sig at være op reguleret i DL og DL + DMSO mus op ca. 1,75 gange og 1,65 gange normal mus. Alle tre doser af curcumin reducerede ekspressionen af ​​PKCa betydeligt.