PLoS ONE: Inddragelse af trpC Kanaler i Lung Cancer Cell Differentiering og korrelationsanalysen i Human Ikke-småcellet lungekræft

Abstrakt

Den kanoniske forbigående receptor potentiale (trpC) kanaler er Ca

2 + -permeable kationiske kanaler kontrollerer Ca

2+ tilstrømning fremkaldt af G-protein-koblet receptor-aktivering og /eller af Ca

2+ butik udtynding. Her undersøger vi inddragelse af TRPCs i celledifferentiering for lungekræft. Ekspressionen af ​​TRPCs og korrelationen til kræft differentiering grad i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) blev analyseret ved real-time PCR og immunfarvning under anvendelse af væv microarrays fra 28 patientprøver lungekræft prøver. Associeringen af ​​TRPCs med celledifferentiering blev også undersøgt i lungecancer-cellelinie A549 ved PCR og Western blotting. Kanalen blev overvåget af Ca

2+ billedbehandling og patch-optagelse efter behandling med alle-

trans

retinoinsyre (ATRA). Ekspressionen af ​​TRPC1, 3, 4 og 6 blev korreleret til differentiering kvalitet af NSCLC patienter, men der var ingen korrelation til alder, køn, rygning historie og lungekræft celletype. ATRA opreguleres TRPC3, TRPC4 og TRPC6 udtryk og forbedret Ca

2+ tilstrømning i A549 celler, dog viste ATRA nogen direkte indvirkning på trpC kanaler. Inhibering af trpC kanaler ved pore-blokerende antistoffer reducerede cellemitose, der blev modvirket af kronisk behandling med ATRA. Blokade af trpC kanaler hæmmede A549 celleproliferation, mens overekspression af TRPCs øget spredning. Vi konkluderer, at trpC udtryk korrelerer til lungekræft differentiering. TRPCs mægle den farmakologiske effekt af ATRA og spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​lungekræft celledifferentiering og spredning, hvilket giver en ny forståelse af lungekræft biologi og potentielle anti-cancer terapi

Henvisning:. Jiang HN, Zeng B, Zhang Y, Daskoulidou N, Fan H, Qu JM, et al. (2013) Inddragelse af trpC Kanaler i Lung Cancer Cell Differentiering og korrelationsanalysen i Human Ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 8 (6): e67637. doi: 10,1371 /journal.pone.0067637

Redaktør: Peiwen Fei, University of Hawaii Cancer Center, USA

Modtaget: Januar 25, 2013; Accepteret: 20 maj 2013; Udgivet: 28 juni 2013

Copyright: © 2013 Jiang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Shanghai Leading talent Projekter (nr 036, 2010) og Shuguang Tracking projekt af Shanghai uddannelsesudvalg (01SG06) (til JMQ); Leverhulme Trust Fellowship Award (til S.Z.X.); Natural Science Foundation of Shanghai (nr 09ZR1406100) og Shanghai Førende akademisk disciplin Project (nr B115) (til H.N.J.). B.Z. blev støttet af Kina Scholarship Rådet og universitetet studentship. N.D. modtog 80 års jubilæum Ph.d. studentship fra University of Hull. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Selv overlevelsesraten er blevet forbedret efter indførelsen af ​​tredje generation anti-neoplastiske midler og epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) tyrosinkinaseinhibitorer, lungecancer er stadig den førende årsag til kræft dødsfald i verden [ ,,,0],1], [2], [3], [4], [5]. Derfor forstå patogenesen af ​​lungekræft udvikling og identifikation af nye potentielle mål er vigtige for terapeutisk udviklingsstrategi.

Ca

2+ er vigtigt i signalering kaskader af tumorigenese. Den forbigående receptor potentiale (TRP) ion-kanal familie har været impliceret i reguleringen af ​​vækst kræft og progression via modulering af Ca

2+ tilstrømning og downstream signaler herunder gentranskription [6], [7], [8] . Blandt de seks underfamilier (trpC, TRPM, TRPV, TRPP, TRPML og trpA) af TRP kanaler, har de kanoniske TRP (TRPCs) blevet foreslået som proteintyrosinkinase eller G-protein-koblede receptorer betjente Ca

2 + kanaler ( ROC) eller interne Ca

2 + butik betjente kanaler (SOCs), der formidler de Ca

2+ post fremkaldt af mange hormoner og vækstfaktorer. Derfor er hæmning af disse kanalaktivitet eller ekspression fører til funktionelle ændringer i cancercelleproliferation, migration, kolonidannelse og tumorvækst [6], [9]. For nylig har flere undersøgelser vist, at der findes trpC i forskellige typer af cancerceller eller kræft væv, såsom TRPC1, 3, 6 i brystkræft MCF7-celler [10], [11] og leverkræft HepG2-celler [12], TRPC1, 3, 4 i prostata cancer LNCaP celler [13], [14], TRPC1, 4, 6, 7 i renalcellecarcinom [15], TRPC1, 3, 5, 6 i humane maligne gliomer [16], TRPC1, 3- 7 i neuroblastom IMR-32 celler [17], TRPC3 i human astrocytoma 1321N1 celler [18], TRPC6 i spiserøret og mavekræft [19], TRPC1, 3, 4, 6, og deres splejsede varianter i ovariecancer [9], [ ,,,0],20], og TRPC1, 4 i basalcellekræft [21]. Desuden beviser fra

in vitro Salg forsøg har vist, at overekspression af trpC kanaler eller stilhed af genekspression med siRNA kan regulere celleproliferation eller celleoverlevelse, hvilket antyder disse gener er vigtige i cancerbiologi [6], [9] , [20].

er blevet detekteret ekspressionen af ​​TRPC1, 3, 4, 6 i lungekræft [22], [23] og sammenslutningen af ​​TRPC3 udtryk med prognosen for lungeadenocarcinom er blevet beskrevet [ ,,,0],23]. Men korrelationen mellem trpC udtryk med differentiering kvalitet af lungekræft og den underliggende mekanisme er stort set ukendt. Her sigter vi til at identificere ekspressionen af ​​TRPCs i human lungekræft og bestemme roller TRPCs i reguleringen af ​​kræft celledifferentiering og proliferation via bestemte trpC kanal blokerende antistoffer. Vi undersøgte også potentialet korrelation af trpC udtryk med kræft differentiering kvalitet, celletype og rygning ved real-time PCR og immunohistokemi på lungekræft væv microarrays. For yderligere at undersøge forholdet af trpC udtryk med celledifferentiering, ATRA, en potent celledifferentiering inducer for mange celletyper, blev brugt i en

in vitro

lungekræft celle model.

Materialer og metoder

patienter og lungevæv prøver

Tyve-otte patienter (17 mænd og 11 kvinder) i alderen på 61,1 ± 1,7 år med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) blev rekrutteret mellem november 2008 og december 2009. Alle patienter med NSCLC blev diagnosticeret som klinisk iscenesat i eller II lungekræft og modtog operation i thorax kirurgisk Zhongshan Hospital. De støtteberettigede patienter havde tidligere ubehandlede, histologisk eller cytologisk bevist NSCLC. Patienterne fik enten præoperativ kemoterapi eller strålebehandling blev udelukket fra denne undersøgelse. Lungekræft væv og den normale lungevæv omgiver tumoren ud over 2 cm i afstand blev opnået fra samme patient. Snap-frosset væv blev anvendt til mRNA-analyse og formalin-fikserede væv til immuocytochemistry undersøgelse. Projektet blev godkendt af den etiske komité i Zhongshan Hospital Fudan University, og patienterne gav skriftligt samtykke i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen.

Lung Cancer Tissue microarrays

Lungekræft væv microarrays var fremstillet under anvendelse af formalin-fikserede cancervæv [24]. Vævskerner med 2 mm i diameter blev opsamlet baseret på visuel opretning med den tilsvarende hematoxylin og eosin (HE) -farvning. En kerne af normale lungevæv og to kerner af tumorvæv blev taget fra hver patient og anbragt i modtagerens paraffinblokke. Vævssnit med 5-um tykkelse blev anvendt til immunfarvning. Alle prøver på vævet mikroarrays blev undersøgt af en patolog med histologisk klassifikation og differentiering lønklasse ifølge WHO klassifikationen [25].

Celler Kultur og Gene transfektion

A549-cellelinje, et almindeligt anvendt lungecancer celle model afledt fra adenocarcinomic humane alveolære basale epitelceller blev dyrket i DMEM /F12-medium (Invitrogen, Paisley, UK) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin, og holdt ved 37 ° C under 95% luft og 5% CO

2. Human TRPC1 blev TRPC3 og TRPC6 amplificeret fra cDNA’et af human ovarie cancerceller og human TRPC4 blev amplificeret fra cDNA’et af humane aortaendotelceller med 100% identitet med sekvenserne i Genbank (tiltrædelsesforhandlinger numre: X89066 (TRPC1); U47050 ( TRPC3), NM_016179 (TRPC4α) og BC093660 (TRPC6). trpC cDNA’er blev subklonet i pcDNA3.1 eller pEGFP-C1-vektorer og deres funktionelle ekspression er blevet bekræftet som vi rapporteret [9]. A549-celler blev transficeret med TRPC1, 3, 4, og 6 plasmid cDNA’er i pcDNA3-vektoren under anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen). De transficerede celler blev udpladet i 48-brønds plade til eksperimentet.

Giemsa-farvning mitose og celleproliferation assays Salg

A549-celler blev udpladet i 3,5 cm skåle med en endelig densitet på 4 x 10

4 celler pr skål. cellerne blev behandlet med 1 uM ATRA eller vehikel. dyrkningsmediet blev genopfyldes hver 24 h. cellerne blev fikseret med methanol i 10 min og farvet med en 1:09 fortyndet arbejder Giemsa-opløsning (Sigma) i PBS ved pH 6,5 i 45 minutter, og vasket ved vand og lufttørret. De samlede celle nummer og mitotiske celler blev talt på billederne fotograferet under 200 × forstørrelse. Celleproliferation blev også bestemt under anvendelse af WST-1 assay (Roche, UK) [9].

RT-PCR og Real-time PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra human lunge og lungekræft væv eller A549-celler ved anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, UK). RNA blev kvantificeret med en nanophotometer (Implen, tysk). MRNA’et (1 ug) blev revers-transkriberet til cDNA under anvendelse Multiscribe Revers transkriptase (Applied Biosystems, USA) og vilkårlige primere (Promega, UK). Kvantitativ RT-PCR blev udført under anvendelse StepOne ™ Real-Time PCR systemet eller ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, UK). Primersættet designet tværs intron og sekvenserne blev givet i tabellen S1. Hver reaktion indeholdt 1 x SYBR Universal Master Mix (Applied Biosystems) 10 pi, cDNA 1 pi, og forward og reverse primere 1,5 pi hver. Det humane housekeeping-gen glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase GAPDH blev anvendt som en intern standard. Ikke-template eller ikke-RT blev sat som negativ kontrol. Den PCR-cyklus bestod af en initial cyklus på 50 ° C i 2 minutter efterfulgt af 95 ° C i 10 minutter, derefter 50 gentagne cykler af 95 ° C i 15 s, 54 ° C annealing temperatur i 30 s, og primerforlængelse ved 72 ° C i 30 s.

antistoffer, Western blotting og immunohistokemi

Kanin polyklonalt anti-trpC antistoffer (T1E3, T5E3, T367E3 og T45E3) blev dannet mod det ekstracellulære tredje sløjfe (E3) regionen nær kanalen pore [26]. Specificiteten af ​​antistoffer E3-målretning blev testet ved ELISA, Western blotting og funktionelle assays, og fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) [9], [26]. Proceduren for Western blotting er tidligere [26] blevet beskrevet. Kort fortalt blev celler lyseret i RIPA-puffer (Sigma-Aldrich, Poole, UK) og proteiner blev separeret på 10% SDS-PAGE-gel før overførsel til nitrocellulose membran. Blottet blev inkuberet med kanin-anti-trpC antistoffer (1:200) natten over ved 4 ° C, vaskes med phosphatbufret saltvand (PBS) og inkuberet med gede anti-kanin IgG-HRP ved 1:2000 fortynding (Sigma). Kanin-anti-β-actin (Santa Cruz Biotech, USA) ved 1:400 fortynding blev anvendt som en intern standard for protein kvantificering. Visualisering blev udført ved hjælp af ECLPIus detektionsreagenser (GE Healthcare, UK) og udsættelse for X-ray film. Kvantificeringen blev analyseret under anvendelse Billede J software (NIH, USA). Proceduren for immunfarvning var magen til vores rapporter [9], [27] og Vectastain ABC-systemet (Vector Laboratories, Peterborough, UK) blev anvendt. Kanin-anti-TRPC1, 3, 4 og 6-antistoffer købt hos Abcam (Cambridge, UK) blev anvendt til humant lungevæv og lungekræft sektion farvning. Farvningen kvantificering blev vurderet ved at lave positive farvede celler og farvningsintensitet klassificeret som 0 (negativ), 1 (svag), 2 (mellemliggende) og 3 (stærk) [28].

Whole-celle Patch Clamp

De hele celle strømme blev registreret ved hjælp Axoclamp 2B eller Axopatch B200 patch clamp forstærker og kontrolleres med pClamp 10 software. Procedurerne for optagelse trpC strømme lignede vores tidligere rapporter [29], [30]. En 1-s rampe spændingsprotokol fra -100 mV til +100 mV blev påført ved en frekvens på 0,2 Hz fra en holdepotentiale på 0 mV. Signaler blev udtaget ved 3 kHz og filtreres ved 1 kHz. Glasset mikroelektrode med en modstand på 3-5 MQ blev anvendt. 200 nM Ca

2+ pipette-opløsning (115 CsCl, 10 EGTA, 2 MgCl

2, 10 HEPES og 5,7 CaCl

2 i mM, pH justeret til 7,2 med CsOH og osmolariteten blev indstillet at ~290 mOsm med mannitol). Den beregnede frie Ca

2+ var 200 nm med EQCAL (Biosoft, Cambridge, UK). Standarden bad opløsningen indeholdt (mM): 130 NaCl, 5 KCI, 8 D-glucose, 10 HEPES, 1,2 MgCl

2 og 1,5 CaCl

2. PH blev justeret til 7,4 med NaOH. Forsøget blev udført ved stuetemperatur (23-25 ​​° C).

Ca

2 + Imaging

A549 celler blev fyldt med 2 uM Fura-PE3 AM ved 37 ° C i 30 min i Ca

2 + -fri badopløsningen, efterfulgt af en 20-min vask i standard bad opløsning ved stuetemperatur. Fura-PE3 fluorescens blev overvåget med et omvendt epifluorescensmikroskop (Nikon Ti-E, Japan). En xenonbuelampe billede excitationslys, blev bølgelængden af ​​hvilke udvalgt af et Nikon afbildningssystem kontrolleres af NIS Elements 3.0 software. Dual bølgelængde ophidset ved 340 nm og 380 nm blev anvendt til Fura-PE3 fluorescens, og emission blev opsamlet via en 510-nm filter og fotograferet af Orca-R2 CCD-kamera (Hamamatsu, Japan). Forholdet mellem Ca

2+ farvestof fluorescens ved F

340 /F

380 bølgelængde blev målt [30]. Alle forsøgene blev udført ved stuetemperatur.

Reagenser og kemikalier

Alle generelle salte blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (Poole, UK). Gadolinium-chlorid (Gd

3+), 2-aminoethoxydiphenyl borat (2-APB), trypsin, all

trans

retinsyre (ATRA), og PCR-primere blev indkøbt fra Sigma-Aldrich, og Fura -PE3 AM var fra Invitrogen (Paisley, UK).

Statistik

data er udtrykt som gennemsnit ± SEM Den statistiske signifikans blev analyseret ved anvendelse af ANOVA og forskellen mellem grupperne blev vurderet med Dunnetts

t

-test i SPSS software. Studerendes

t

test blev anvendt til to gruppe sammenligning. Den Ridit analyse blev anvendt til de semikvantitative data for immunfarvning eksperiment.

P Drømmeholdet værdi. 0,05 blev betragtet betydning

Resultater

Angivelse af TRPCs i lungekræft

udtryk for TRPCs i normalt humant lunge og lung cancer væv blev undersøgt ved immunfarvning (fig. 1A). I normale lunge vævssnit blev de alveolære epitelceller farvet med anti-TRPC1 og anti-TRPC6 antistoffer, men farvning for TRPC3 og TRPC4 var negative eller meget svag. I lung pladecellekarcinom sektioner blev pladeepitelceller stærkt farvet med anti-TRPC1, anti-TRPC3, anti-TRPC4 og anti-TRPC6 antistoffer. Tilsvarende blev positiv farvning for TRPC1, TRPC3, TRPC4 og TRPC6 også ses i lunge adenocardionoma sektioner. Brug real-time PCR, kvantificeret vi udtryk for TRPCs i normale lunge og kræft væv. MRNA’erne i TRPC1, 3, 4 og 6 blev påvist i både normale lunge- og lungekræft væv. Udtrykket niveau TRPC1 og TRPC6 var meget højere end for TRPC3 og TRPC4. MRNA’erne for TRPC5 og TRPC7 kunne ikke påvises i normale og lungekræft væv (fig. 1B-C). Disse data tyder eksistensen af ​​TRPC1, 3, 4, 6 isoformer i NSCLC.

A, Eksempler på humant normalt lunge (

n

= 20) og lungekræft vævssnit (

n

= 28) inklusive adenocarcinom (AC) og pladecellecarcinom (SCC) blev farvet med anti-TRPC1, anti-TRPC3, anti-TRPC4 og anti-TRPC6 antistoffer ved anvendelse Vectastain ABC-system. Den positive farvning blev vist som brun farve. Kernerne blev counter-plettet af hæmatoxylin. B, The mRNA blev detekteret ved real-time PCR i normale lungevæv under anvendelse af primerne i tabel S1. Den GAPDH blev anvendt som intern hus-føring gen kontrol for kvantificering (

n

= 25 patienter til TRPC1, 4, 5 og 6 grupper;

n

= 24 til TRPC3, og

n =

9 for TRPC7). C, The mRNA niveauer i lungekræft væv (AC:

n

= 9-15; SCC:

n

= 8-11)

Korrelation af. trpC Expression til cancer Differentiering Grade

forskellen i mRNA niveauer mellem kræft differentiering kvaliteter, celletyper, ryger og ikke-ryger blev opdaget af real-time PCR. Ekspressionen af ​​TRPC1, 3, 4 og 6 kanaler var signifikant lavere i dårligt differentieret lungekræft end i det godt moderat differentieret gruppe (fig. 2A, også se tabel S2). Der var imidlertid ingen signifikant forskel mellem de ryger og ikke-ryger-grupper (fig. 2B). Lineær multivariance regressionsanalyse viste også en negativ korrelation af mRNA ekspressionen af ​​TRPC1, TRPC3, TRPC4 og TRPC6 lungekræft differentiering kvalitet med standardiseret β koefficienten sekvens af TRPC1 (-0,563) TRPC4 (-0,360) TRPC6 (0,271 ) og TRPC3 (-0,057), hhv. Trinvis regression viste, at TRPC1 var en betydelig variabel (P 0,01)., Men korrelationen af ​​kræft differentiering lønklasse til køn, alder, rygning og kræft celletype ikke var signifikant

A, mRNA udtryk for TRPCs i lungekræft væv med godt moderat (grad II (

n

= 17) og grad III (

n

= 6)) eller dårlig (grad IV,

n

= 5) differentiering klasse blev påvist ved real-time PCR. GAPDH blev anvendt som housekeeping-gen kontrol. B, mRNA udtryk TRPCs i lungekræft væv fra rygeren (20 cigaretter om dagen i mere end 10 år,

n

= 11) og ikke-ryger (

n

= 17 ). C, eksempel af to væv microarrays med normal lunge (N) og lungecancer (C) etiketter blev farvet med anti-TRPC1 antistof. Celletypen og differentiering kvalitet af hver sektion blev karakteriseret ved HE-farvning. De to eksempler (11c og 9C) med veldifferentieret adenocarcinom blev vist i indsatsene. Korrelationen af ​​farvning intensitet til andre faktorer blev vist i tabellen og signifikans blev vurderet ved Ridit analyse. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

. 0,001

Vi har også undersøgte korrelationen af ​​lungekræft differentiering kvalitet til trpC protein udtryk niveauer ved hjælp af semikvantitativ immunfarvning. To væv microarrays med 20 normale lungevæv og 28 NSCLC prøver, herunder 15 tilfælde med adenocarcinom, 11 tilfælde med pladecellecarcinom og 2 tilfælde med blandede celletyper adenosquamøst carcinom blev konstrueret (fig. 2C). Lungekræft celletype blev bekræftet ved HE-farvning. Den TRPC1, TRPC3, og TRPC6 i de tilstødende microarray vævssnit var stærkt farvet med anti-TRPC1, 3, og 6-antistoffer med en procentdel af positivt farvede cancer sektioner af 71,4%, 75,0% og 71,4%, henholdsvis, mens mild farvning var ses for TRPC4 med en positiv farvning procentdel på 32,1%. For normale lunge sektioner på mikroarrayene, den positive farvning procentdel for TRPC1, 3, 4 og 6 var 70%, 70%, 45% og 85%, hhv. Den Ridit analyse viste, at farvningen intensitet TRPC1 var forbundet med differentieringen bedømmelse (fig. 2C). Imidlertid viste ingen signifikant korrelation af proteinfarvning snesevis af trpC til lungekræft differentiering kvalitet, celletype, rygning, alder og køn, lineær multivariance regressionsanalyse.

opregulering af trpC ekspression ved kronisk behandling med ATRA

TRPC1, 3, 4 og 6 blev påvist i A549-celler, men TRPC5 og TRPC7 kunne ikke påvises selv om primersæt for TRPC5 og TRPC7 kan forstærke mRNA isoleret fra hjerne- eller HepG2-celler (fig. 3A). De to TRPC1 bånd i gelen var a- og p-isoformer, og båndene for TRPC4 var α, β, γ og A isoformer henholdsvis som vi beskrev i ovariecancerceller [9]. De mRNA og protein niveauer for TRPC3 blev TRPC4 og TRPC6 steget betydeligt ved kronisk behandling med 1 pM ATRA i 96 timer (fig. 3B-C), men forordningen om TRPC1 udtryk var ikke signifikant. Disse data tyder endvidere, at ekspressionen af ​​visse trpC isoformer er associeret med celledifferentiering.

A blev mRNA’erne i TRPC1, 3, 4 og 6 detekteret i A549-celler ved hjælp af RT-PCR under anvendelse af primersæt i tabel S1. PCR bånd for TRPC5 og TRPC7 var negative i A549 celler, men positiv i menneskets hjerne eller HepG2. B, blev mRNA detekteret ved real-time PCR i A549-celler behandlet med alle-

trans

retinsyre (ATRA, 1 uM) i 96 timer. Den β-actin blev anvendt som en husholdning gen for relativ kvantificering. De 2

(- ΔΔCt) metode blev anvendt til beregningen. C, trpC proteiner blev kvantificeret ved Western blotting ved anvendelse af anti-TRPC1 (T1E3), anti-TRPC3, anti-TRPC4 (T45E3) og anti-TRPC6 antistoffer. Anti-β-actin antistof blev anvendt til relativ protein kvantificering (

n

= 3 uafhængige eksperimenter og hvert forsøg med tredobbelte prøver).

Effekter af ATRA på Ca

2 + udledning og Tilstrømning i A549 celler og trpC Channel Aktivitet

A549 celler blev kronisk behandlet med ATRA (1 uM) i 4 dage med hver 24 timers forfriskning af cellekulturmedium. Dynamikken i intracellulær Ca

2+ blev overvåget af Fura-PE3 /AM. Trypsin på 0,2 nM inducerede en robust Ca

2+ udgivelse i Ca

2 + gratis løsning, som blev efterfulgt af en anden Ca

2+ højdepunkt i A549 celler. Perfusion med 1,5 mM Ca

2+ efter store-depletion med trypsin forøgede Ca

2+ tilstrømning i ATRA-behandlede celler (fig. 4A-B), hvilket tyder på kronisk behandling med ATRA forøgede Ca

2+ tilstrømning, men havde ingen effekt på Ca

2+ release signal. Brug af helcelle-patch-optagelse, blev strømmen i A549-celler ikke ændret ved akut perfusion med ATRA (fig. 4C-E). For at undersøge den potentielle direkte virkning af ATRA på trpC kanaler blev HEK-293-celler inducerbart udtrykker TRPCs anvendes til helcelle patch optagelse. Strømmene af TRPC3, 6 og TRPC4 strømme blev aktiveret ved trypsin eller Gd henholdsvis

3+ (100 uM). Den nuværende spænding forhold (

IV

) kurver for disse strømninger var magen til vores tidligere rapport [29]. ATRA ved 1 uM og 10 uM havde ingen stimulerende eller blokerende effekt på disse kanaler, men alle disse strømninger blev blokeret af trpC blocker 2-APB, tyder på, at ATRA havde nogen akut direkte effekt på Ca

2+ strøm eller Ca

2+ tilstrømning gennem trpC kanaler (fig. 4F-I). Den kroniske forøgelse af Ca

2+ tilstrømning i ATRA behandlede A549 celler kunne alene bidraget med trpC gen opregulering.

A blev A549 celler fyldt med 2 uM Fura-PE3 /AM og Ca

2+ blev målt som forholdet (F

340 /F

380) af Ca

2+ farvestof fluorescens. Ca

2+ frigivelse blev fremkaldt af trypsin (0,2 nM) og Ca

2+ tilstrømning blev introduceret med 1,5 mM Ca

2+ i perfusion løsning. Cellerne blev inkuberet med 1 uM ATRA i 96 timer og styre- celler blev inkuberet med samme volumen bærer. B, gennemsnit ± S.E.M. data for Ca

2+ entry efter butikken tømt af trypsin som vist i (A).

n

= 21-32 for hver gruppe, ***

P

0,001. C, helcelle strømme i stikprøven ved kommando spænding på ± 80 mV i A549-celler før og efter perfusion med ATRA (1 uM), trypsin (0,2 nM) og 2-APB (100 uM). D,

IV

kurver for (C). E, Mean data for effekten af ​​ATRA. F-H, Virkning af ATRA på hel-celle-strømninger TRPC3, TRPC4 og TRPC6 i HEK293-celler, der overudtrykker individuelle trpC isoformer. Jeg, Mean ± s.e.m. data målt ved -80 mV, og

n =

4-6 for hver gruppe.

Cell Differentiering Reguleret af trpC Channel Activity

differentiering af A549 lunge cancerceller blev vurderet ved Giemsa-farvning, der kan visualisere kromosomer. Cell med nukleare mitose viste mørkeblå kerne eller to kerner farvning (fig. 5). ATRA (1 uM) signifikant inhiberede celle mitose ved 24 timer og 48 timer cellekultur. Procentdelen af ​​mitotiske celler blev mindre ved 72 timer og 96 timer cellekultur og forskellen mellem de to grupper viste ingen signifikans (fig. 5B). Tabet af statistisk forskel efter 72 timer cellekultur kan skyldes kontakt celle inhibition der fandt sted i de konfluente celler efter 3 til 4 dage cellekultur. Derfor vurderede vi effekten af ​​trpC kanal blokkere på mitose inden 48-timers kultur. Specificiteten og funktion trpC pore blokerende antistoffer er blevet påvist i de tidligere undersøgelser [9], [31], [32], [33]. Hæmning af TRPC1, TRPC3 og TRPC6 kanaler ved T1E3 og T367E3 antistoffer hæmmede signifikant mitose, mens virkningerne af T1E3 og T367E3 viste mindre effektiv efter behandling med ATRA sammenligne med de grupper, der blev behandlet med den kogte antistof eller gruppen uden tilsætning af antistof.

A, Eksempel på Giemsa farvning af A549-celler og behandlingen med eller uden ATRA for 0-96 timer. De mitotiske celler blev angivet ved pilen. B, Procent af mitotiske celler i kontrol og ATRA-behandlede grupper (

n

= 32-40 mikroskopiske felter for hver gruppe, der indeholder 6 kultur retter, ***

P

0,001). C, Effekt af trpC kanal blokerende antistoffer på celle mitose. Mediet uden antistof (No-Ab) og kogt antistof (Kogt-Ab) som kontroller (

n

= 18 mikroskopiske felter fra 6 kultur brønde til hver gruppe, NS: ikke signifikant, *

P

0,05, og **

P

0,01). De delta (Δ) ændringer af ATRA-induceret hæmning blev også sammenlignet blandt de kogte-Ab (kontrol) og blokerende antistof behandlede grupper.

trpC Kanal og A549 Cell Proliferation

Cell differentiering og proliferation er to tæt beslægtede cellulære processer, derfor har vi også observeret effekt af trpC kanalaktivitet på A549 celleproliferation. Celleantallet steg med ~ 8-folds efter 96 timers cellekultur. ATRA (1 uM) hæmmede signifikant celleproliferation efter 72-timers og 96-timers cellekultur (fig. 6A), hvilket tyder på virkningen af ​​ATRA på celleproliferation er en langsom-debut proces. Men den anti-proliferative virkning ved at blokere trpC kanalaktivitet var meget hurtigere og signifikant forskel blev opnået inden for 24 timer efter inkubation med 2-APB, en ikke-selektiv trpC-blokker. EF

50 for 2-APB var 87,9 pM (Fig. 6B). Under anvendelse af de blokerende antistoffer T1E3 og T367E3 til specifikt at blokere TRPC1 og TRPC3 /6 i A549-celler inhiberede også proliferationen af ​​cellerne uden ATRA behandling, men den inhiberende virkning var mere udtalt, når cellerne blev behandlet med 1 pM ATRA i 48 timer (Fig . 6C), hvilket antyder aktiviteten af ​​trpC kanal kan udvides med ATRA. For yderligere at demonstrere involveringen af ​​trpC kanaler i lungekræft celleproliferation blev A549-celler transficeret med TRPC1, 3, 4, og 6 plasmid cDNA’er. Celleproliferationen blev forøget i A549-celler, der overudtrykker TRPC1 og TRPC6, men ikke signifikant for de celler, der overudtrykker TRPC3 og TRPC4 (fig. 6D). Disse resultater viser, at lungekræft celleproliferation reguleres af aktiviteten af ​​trpC kanaler.

A, tidsforløbet for virkningen af ​​ATRA på A549 celleproliferation. B, blev A549-celler inkuberet med 2-APB ved forskellige koncentrationer i 24 timer (

n Salg = 8 brønde til hver gruppe) og celleproliferation blev analyseret ved WST-1-celleproliferation assaykit. C, A549-celler behandlet med specifikke E3-targeting trpC blokerende antistoffer eller kombination med ATRA i 48 timer (

n

= 6-7 for hver gruppe; sammenligning med kontrolgruppen (

#) * eller

#

P

0,05, ** eller

##

P

0,01). D, A549 celleproliferation blev bedømt ved WST-1 efter transfektion med TRPC1, 3, 4, og 6 plasmid cDNA’er for 48 timer (

n

= 8 for hver gruppe, **

P Salg . 0,01)

diskussion

i denne undersøgelse har vi vist, at TRPC1, TRPC3, TRPC4 og TRPC6 findes i human lungecancer, herunder adenocarcinom, pladecellekræft og adenocarcinom-cellelinie A549. Ekspressionsniveauet af trpC kanaler er korreleret til differentiering kvalitet af lungekræft. ATRA opregulerer trpC genekspression i A549-celler. Inhibering af trpC kanalaktivitet viser antiproliferativ virkning. Disse resultater er vigtige for at forstå de roller trpC kanaler i lungekræft celledifferentiering og proliferation.

trpC kanaler er blevet påvist i mange væv [32], [34], [35], [36], herunder kræft væv, såsom brystcancer [37], ovariecancer [9], [20], hepatom [12], prostatacancer [13], basalcellecarcinom [21], renalcellecarcinom [15], maligne gliomer [16] , glioblastom [8], og gastriske tumorer [19]. Ekspressionsniveauet af hvert trpC isoform i forskellige typer af cancerceller eller væv er variable, hvilket antyder bidrag til eller biologiske betydning af hver trpC isoform i forskellige cancer type kunne være anderledes. For eksempel ekspressionen af ​​TRPC7 er negativ i A549 og SKOV-3, men positiv i HepG2-celler i denne undersøgelse og i de differentierede neuroblastomceller [17]. Desuden kan de alternative splejset varianter også bidrage til funktionaliteten af ​​trpC kanaler, såsom TRPC1 og TRPC4 splejset isoformer i kræft i æggestokkene SKOV3 celler [9]. Desuden kan ekspressionsniveauet af trpC kanaler afhænger af differentiering status kræftcellerne, fordi vi fandt mRNA ekspression af TRPC1, TRPC3, TRPC4 og TRPC6 i lav differentiering kvalitet lungekræft var lavere end i brønden differentieret kræft , hvilket er i overensstemmelse med vores observation i ovariecancer [9] og den lave udtryk for TRPC4 niveau og TRPC6 i umodne stamceller [38]. Selvom vores data viste, at mRNA-niveauer af TRPCs i normal lunge var højere end den, lungekræft, er det vanskeligt at gøre sådan sammenligning på grund af variation af celletyper, fordi de normale lunge prøver indeholder langt flere ikke-epitel celler end i den faste tumor prøver, såsom vaskulære celler, alveolære makrofager, fibroblaster, og blodlegemer. Den immunfarvning på lungekræft væv microarrays viste mindre betydningsfuld, hvilket kan skyldes den lave følsomhed metodologi sammenligning af den høje følsomhed af real-time PCR.