PLoS ONE: Imatinib og Nilotinib Reverse multiresistens i kræftceller ved at hæmme udstrømning aktivitet af MRP7 (ABCC10)

Abstrakt

Baggrund

En af de store mekanismer, der kunne producere modstand til antineoplastiske lægemidler i cancerceller er ATP bindende kassette (ABC) transportere. ABC transportører kan væsentligt reducere den intracellulære koncentration af antineoplastiske lægemidler ved at øge deres efflux og derved mindske den cytotoksiske aktivitet af antineoplastiske lægemidler. En af disse transportere har multiresistent protein 7 (MRP7, ABCC10), for nylig blevet vist at fremkalde resistens over for antineoplastiske lægemidler ved at forøge udstrømningen af ​​paclitaxel. I denne undersøgelse, vi undersøgt virkningerne af BCR-Abl tyrosinkinasehæmmere imatinib, nilotinib og dasatinib på aktiviteten og ekspressionen af ​​MRP7 i HEK293 celler transficeret med MRP7, betegnet HEK-MRP7-2.

Metode og /eller Principal Fund

Vi rapporterer for første gang, at imatinib og nilotinib omvendt MRP7-medieret multiresistens. Vores MTT analyseresultater viste, at MRP7 udtryk i HEK-MRP7-2 cellerne ikke var signifikant ændret ved inkubation med 5 pM imatinib eller nilotinib i op til 72 timer. Desuden imatinib og nilotinib (1-5 uM) producerede en signifikant koncentrationsafhængig tilbageførsel af MRP7-medieret multiresistens ved at øge følsomheden af ​​HEK-MRP7-2 celler til paclitaxel og vincristin. Imatinib og nilotinib, ved 5 uM, steg markant ophobning af [

3H] -paclitaxel i HEK-MRP7-2 celler. Den inkubation af HEK-MRP7-2 celler med imatinib eller nilotinib (5 uM) også hæmmet betydeligt udstrømningen af ​​paclitaxel.

Konklusioner

Imatinib og nilotinib omvendt MRP7-medieret paclitaxel modstand, de fleste sandsynligvis på grund af deres hæmning af udstrømningen af ​​paclitaxel via MRP7. Disse resultater antyder, at imatinib eller nilotinib, i kombination med andre antineoplastiske lægemidler, kan være nyttige til behandling af visse kræftformer resistente

Henvisning:. Shen T, Kuang YH, Ashby CR Jr, Lei Y, Chen A, Zhou Y, et al. (2009) Imatinib og Nilotinib Reverse multiresistens i kræftceller ved at hæmme udstrømning aktivitet af MRP7 (ABCC10). PLoS ONE 4 (10): E7520. doi: 10,1371 /journal.pone.0007520

Redaktør: Debbie Fox, The Research Institute for børn på Børnehospital New Orleans, USA

Modtaget: Juni 11, 2009; Accepteret: September 2, 2009; Udgivet: Oktober 20, 2009

Copyright: © 2009 Shen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra St. Johns University Research Seed Grant No. 579-1110-7002 (Z.-S. Chen) og Primary Care Medicine Associates, PC (Flushing, NY) tilskud nr 582-2082-7601 (Z. -S. Chen). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Selv om den kliniske anvendelse af kirurgi, stråling og kemoterapi er faldet gentagelsesindstillingerne af kræft, cellulær resistens over for kemoterapeutiske lægemidler er en væsentlig hindring ved behandling af cancer [1], [2]. Effekten af ​​kemoterapi kan være begrænset på grund erhvervet resistens fra tidligere behandling. Følgelig at forskningsstrategier omgå sådan resistens i cancerceller er blevet en nuværende fokus for udviklingen af ​​hidtil ukendte kombinatoriske kemoterapeutiske strategier. Både iboende og erhvervet resistens kan producere flere ændringer i forskellige cellulære veje, der fører til et fald i cytotoksicitet, og dermed effekten, af antineoplastiske lægemidler [3]. Derfor kan cancerpatienter, der modtager flere behandlinger blive stadig ufølsomme for kemoterapeutiske midler.

En af de primære cellulære mekanismer, der kan producere resistens mod antineoplastisk terapi indebærer udstrømningen af ​​narkotika fra cancercellerne ved specifikke transmembrane transportører eller pumper [4]. Disse transportproteiner stammer fra superfamilien af ​​ATP-bindende kassette (ABC) transportere, der deler fælles strukturelle og funktionelle egenskaber [5]. En række undersøgelser har vist, at flertallet af medlemmerne af C-familien af ​​ABC transportører er multilægemiddelresistens proteiner (MRPs), som er karakteriseret ved krydsresistens over for mange strukturelt ubeslægtede lægemidler [2], [4].

En række undersøgelser tyder på, at kræftceller, der udtrykker ABC C familien transporter MRP7 /ABCC10 kan udvikle resistens over for forskellige kemoterapeutiske stoffer. For eksempel human spytkirtel adenocarcinom (SGA) celler, der overudtrykker MRP7 mRNA og MRP7 protein display betydelig modstand mod vincristin [6]. MRP7 ekspression er også blevet immunhistokemisk identificeret i tumorbærende mus xenotransplanteret med human SGA efter behandling med vincristin [6]. Desuden E

217βG, en kompetitiv inhibitor af MRP7 transport, faldt betydeligt docetaxel ophobning i humane SGA celler [6]. Samlet set forbindelser, der er inhibitorer for MRP7 transport aktivitet dæmpe eller vende modstand i celler kræft, der udtrykker MRP7 protein.

De MRP7-overekspression celler giver resistens over for flere lægemidler mod cancer, herunder paclitaxel, vincristin og vinblastin [7]. Nylige papirer rapporterede også, at MRP7-overexpresssing celler giver resistens over for nukleosidanaloger og epithilone [8] B. Tidligere i vores laboratorium har vi vist, at cepharanthine, en biscoclaurine-afledt alkaloid, omvendt MRP7-medieret paclitaxel resistens [9].

tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er) kan vende modstanden af ​​cancerceller for antineoplastiske lægemidler via flere mekanismer. For eksempel i humane SGA celler, MRP7, P-gp, og MRP1 blev alle detekteret efter langvarig udsættelse for vincristin [6]. For nylig har vi og andre rapporterede, at nogle af TKI’er er potente modulatorer af ABC transportører, herunder P-gp og BCRP /ABCG2 [10], [11]. Nylige resultater fra vores laboratorium foreslog, at nilotinib væsentligt vender P-gp- og BCRP-medieret MDR [12].

I denne undersøgelse, en af ​​de vigtigste mål var at identificere TKI forbindelser, der ville vende MRP7-medieret lægemiddel modstand. Det er derfor muligt, at TKI’er, i kombination med andre antineoplastiske lægemidler, kan være nyttige til behandling af cancere, der udtrykker MDR proteiner, herunder ABC transportører. En vigtig opdagelse om TKI’er var, at visse såkaldte “small molecule” stoffer kunne inhibere TK-aktivitet ved at konkurrere med ATP om binding til det intracellulære katalytiske domæne af receptor TKS som producerede inhibition af forskellige downstream signalleringskaskader ved autophosphorylering [13]. Interessant, imatinib, nilotinib og dasatinib er inhibitorer af TK breakpoint cluster region- Abelson (BCR-Abl) og KIT, en kvalitetsklasse III receptor TK [14] – [18]. BCR-ABL-genet er associeret med en dysregulering af TK-funktion og efterfølgende fører til malign transformation i kronisk myeloid leukæmi (CML) [19], [20]. Anerkendelse af BCR-ABL-genet og dets tilsvarende protein har ført til udviklingen af ​​små molekyler lægemidler designet til at blokere aktiveringen af ​​BCR-ABL TKI’er gennem kompetitiv binding ved ATP-bindingsstedet [19]. Samlet set det primære formål med denne undersøgelse var at bestemme, om BCR-Abl TKI’er kunne vende MRP7-medieret MDR.

Materialer og metoder

2.1. Cellelinjer

HEK293 celler og MRP7 cDNA blev generøst tilvejebragt af Dr. Gary Kruh (University of Illinois i Chicago, Chicago, IL). De transficerede HEK-MRP7-2 celler og tomme vektor transficerede HEK293-pcDNA3.1 celler blev etableret fra HEK293 celler gennem elektroporering [9]. Det parenterale medikament-sensitive humane epidermoide carcinom cellelinie KB-3-1 og dens tilsvarende P-gp-overudtrykkende cellelinje KB-C2 blev venligst leveret af Drs. Gottesman (NCI, Bethesda, MD) og Akiyama (Kagoshima University, Japan), hhv. De KB-C2-celler blev etableret fra KB-3-1-celler ved at udsætte dem for stigende koncentrationer af colchicin i en gradvis trinvis måde (op til 2 ug /ml) og høst af cellerne, der var resistente [20]. Alle disse cellelinier blev dyrket som adhærente monolag i kolber med Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% bovint serum, 2 mM glutamin, 100 enheder /ml penicillin, og 100 ug /ml streptomycin under standard celle dyrkningsbetingelser i et fugtig inkubator indeholdende 5% CO

2 ved 37 ° C.

2.2. Materialer

DMEM, bovint serum og penicillin /streptomycin blev indkøbt fra Hyclone (Logan, UT). Nilotinib (Tasigna®) (fig. 1B) blev opnået som en gave fra Novartis Pharmaceuticals (Basel, Schweiz). Imatinib (fig. 1A) og dasatinib (fig. 1C) blev indkøbt fra ChemieTeck Inc. (Indianapolis, IN). Paclitaxel, vincristin, doxorubicin, colchicin, p-aminophenylmethylsulfonyl fluorid, bovint serumalbumin, dimethylsulfoxid (DMSO) og 1- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -3,5-diphenylformazan (MTT), det polyklonale gede-antistof mod MRP7 (C-19), det monoklonale muse-antistof mod P-gp (P7965), den sekundære peberrodsperoxidase-mærket anti-ged eller anti-mus IgG blev indkøbt fra Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO) . Et polyklonalt antistof mod human MRP1 /ABCC1 blev venligst leveret af Dr. Akiyama (Kagoshima University, Japan) [21]. Et monoklonalt antistof BXP-34 mod BCRP blev erhvervet fra Signet Laboratories Inc. (Dedham, MA). [

3H] -paclitaxel (45 uCi /mmol) blev købt fra Morávek Biochemicals (Brea, CA).

2.3. Fremstilling af cellelysater

konfluent monolag celler i T-25-kolbe blev høstet og skyllet to gange med kold PBS. Celleekstrakterne blev fremstillet under anvendelse af radioimmunfældningsassays assaybuffer [1 × PBS, 1% Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 100 pM p-APMSF, 10 uM leupeptin, og 10 uM aprotinin] i 30 minutter på is med lejlighedsvis rokkende efterfulgt af centrifugering ved 12.000 rpm ved 4 ° C i 15 min. Proteinkoncentrationerne af cellelysater blev bestemt ved Bradford-proteinassay [22]. Supernatanten indeholdende totale cellelysater blev opsamlet og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse.

2.4. Immunoblotting

samme mængde totale cellelysater (40 ug) blev opløst ved 4-12% natriumdodecylsulfat polycrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) og overført elektroforetisk på nitrocellulosemembraner [23]. Cellelysaterne blev denatureret i et 100 ° C varmt bægerglas i 5 minutter før de anbringes på den 4-12% SDS-PAGE. Gelen blev kørt i SDS-elektroforese-buffer (25 mM Tris-base, 0,192 M glycin, 1% SDS) ved 170 V i 2 timer. Overførslen blev udført i en transfer-buffer (25 mM Tris-base, 0,192 M glycin, pH 8,3) ved 30 V i 2 timer. Nitrocellulosemembranen blev derefter nedsænket i 5% skummetmælk for at blokere ikke-specifik binding i 1 time ved stuetemperatur. Membranen blev derefter immunblottet natten over med primære antistoffer (polyklonale eller monoklonale MRP7 P-gp og BCRP antistoffer ved 1:500 og polyklonale MRP1 på 1:3,000) ved 4 ° C. Den følgende dag blev membranen vasket tre gange med TBST-buffer (0,3% Tris, 0,8% NaCl, 0,02% KCI, 0,05% Tween 20), efterfulgt af en tre-timers inkubation med sekundære antistoffer af polyklonale anti-MRP7 eller monoklonale anti- P-gp ved 1:1000. Proteinet-antistof-komplekset blev målt ved anvendelse af en forøget kemiluminescens påvisningssystem (Amersham, NJ). Membranen blev derefter eksponeret for filmen for udvikling. Den konventionelt anvendte loading kontrol actin blev anvendt til at detektere samme belastning i hver bane i prøverne fremstillet fra cellelysater.

2.5. Analyse af narkotika følsomhed

Drug følsomhed blev analyseret ved hjælp af en let modificeret MTT kolorimetrisk assay [23]. Tom vektor transficerede HEK293-pcDNA3.1 celler og MRP7-transficerede HEK293-MRP7-2 celler blev podet i plader med 96 brønde i tre eksemplarer ved 5000 celler /brønd. Efter inkubering i DMEM suppleret med 10% bovint serum ved 37 ° C i 24 timer blev antineoplastiske lægemidler fortyndet til forskellige koncentrationer og inkuberet med cellerne kontinuerligt i 72 timer. De potentielle inhibitorer blev tilsat 1 time før tilsætning af lægemidler mod cancer.

Efter lægemiddel inkubering af 72 timer, 20 pi MTT (4 mg /ml) blev tilsat til hver brønd, og pladen blev yderligere inkuberet i 4 timer, hvilket giver levedygtige celler til at udvikle sig fra den gulfarvet MTT i mørkeblå formazankrystaller. Efterfølgende blev mediet forsigtigt fjernes uden omrøring af klæbende monolag af celler, og 100 pi DMSO blev tilsat til hver brønd for at opløse formazan-krystallerne. Pladerne blev godt rystet i 5 minutter, og en OPSYS mikropladelæser læse absorbansen ved 570 nm fra DYNEX Technologies Inc. (Chantilly, VA). Graden af ​​resistens blev beregnet ved at dividere IC

50 for MDR celler ved den af ​​de parentale celler, hvorimod graden af ​​MDR reversering blev beregnet ved at dividere IC

50 af cellerne med anticancer lægemiddel i fravær af inhibitor ved den opnået i nærvær af inhibitoren. Koncentrationerne kræves for at inhibere væksten med 50% af kontrolcellerne blev beregnet ud fra overlevelseskurverne vha Bliss metoden [23].

antineoplastiske lægemidler anvendt inkluderet paclitaxel, vincristin og doxorubicin ved varierende koncentrationer op til en slutkoncentration 10, 1, og 1 uM. BCR-Abl TKI’er, såsom nilotinib og imatinib, blev efterfølgende anvendt ved ikke-toksiske koncentrationer på 1, 2,5 og 5 uM til screening mod vincristin og doxorubicin. I denne undersøgelse, første valgte vi en enkelt ugiftig dosis (5 uM) for at undersøge effekten af ​​TKI’er på MRP7-medieret resistens over for paclitaxel. Når vi bestemt som TKI’er havde den mest signifikant vending virkning, såsom imatinib og nilotinib, derefter valgte vi tre koncentrationer (1, 2,5 eller 5 pM) for hver TKI at afgøre, om deres vending effekter var koncentrationsafhængig til paclitaxel, vincristin og doxorubicin .

2.6. Akkumulering og efflux

HEK293-pcDNA3.1 parentale celler og HEK-MRP7-2 transficerede celler blev podet i to T75 kolber og inkuberet med DMEM suppleret med 10% bovint serum ved 37 ° C. Efter at cellerne er 60 til 95% sammenflydende, blev hver inhibitor tilsat til separate kolber, og cellerne blev inkuberet i 1 time. Cellerne blev derefter trypsiniseret og to alikvoter (48 × 10

6 celler) fra hver cellelinje blev suspenderet i mediet. Efterfølgende blev cellerne suspenderet i medium indeholdende [

3H] -paclitaxel ved en koncentration på 0,1 uM med eller uden TKI’er nilotinib og imatinib (5 uM) i 1 time ved 37 ° C. En time senere blev inkubationsmediet erstattet med mediet indeholdende TKI’er uden paclitaxel. Prøver (1 × 10

6 celler) blev opsamlet på forskellige tidspunkter (0, 20, 60 og 120 min). Cellerne blev derefter vasket med iskold PBS, og hver prøve blev anbragt i scintillationsvæske for at måle radioaktiviteten i en Packard TRI-CARB 1900CA væskescintillationstæller fra Packard Instrument Inc. (Downers Grove, IL).

2.7. Statistisk analyse

Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange, og de forskelle, blev bestemt ved to-halet t-test. Den a priori statistisk signifikans blev sat til

P

. 0,05

Resultater

3.1. Ekspression af MRP7 i HEK293-pcDNA3.1 og HEK-MRP7-2 celler

I denne undersøgelse de to cellelinier anvendte var HEK293-celler transficeret med enten MRP7 ekspressionsvektoren eller tom vektor kontrol (pcDNA3.1 ). Immunoblotanalyse blev udført for at detektere ekspressionsniveauet af MRP7 protein i de førnævnte linier. MRP7 protein (MW 171 kD) blev udtrykt i HEK-MRP7-2 celler, men ikke i HEK293-pcDNA3.1-celler (Fig. 2A). P-gp, med en molekylvægt på 170 kD, blev påvist i de positive kontrol KB-C2-cellelinjer, men ikke i den negative kontrol KB-3-1, HEK293-pcDNA3.1 eller HEK-MRP7-2 cellelinjer ( fig. 2B). Vi har også udført Western blot eksperimenter for at afgøre, om MRP1 og BCRP blev udtrykt i HEK293-pcDNA3.1 og HEK-MRP7-2 celler. Niveauerne af MRP1 og BCRP i både HEK-MRP7-2 celler og HEK293-pcDNA3.1 celler målbart. Disse resultater er vigtige, da eventuelle virkninger observeret med inhibitorer er usandsynligt, at være på grund af deres interaktion med P-gp, MRP1 og /eller BCRP.

(A) Ekspression af MRP7 i HEK293-pcDNA3.1 ( bane 1) og MRP7-transficerede celler (bane 2). (B) Ekspression af P-gp i HEK293-pcDNA3.1 (bane 1), HEK-MRP7-2 (bane 2), KB-3-1 (bane 3) og KB-C2-celler (bane 4). (C) Effekt af 5 uM imatinib om ekspressionsniveauet af MRP7 (HEK-MRP7-2) i 36 og 72 timer, hhv. (D) Virkning af 5 uM nilotinibs om ekspressionsniveauet af MRP7 (HEK-MRP7-2) i 36 og 72 timer, hhv. Lige store mængder (40 ug protein) af total cellelysat blev anvendt til hver prøve. Nitrocellulosemembranerne blev immunblottet med primært antistof mod MRP7 eller actin på 1:500 fortynding, eller P-gp ved 1:500 fortynding ved 4 ° C natten over, og derefter inkuberet med HRP-konjugeret sekundært antistof ved 1:1000 fortyndinger ved stuetemperatur i 3 timer.

for at vurdere effekten af ​​imatinib /nilotinibs på ekspressionen af ​​MRP7 blev HEK-MRP7-2 celler inkuberet med 5 uM imatinib eller nilotinib for 36 og 72 timer, henholdsvis . Den inkubation af HEK-MRP7-2 celler med imatinib eller nilotinib ændrede ikke signifikant udtryk for protein niveauer af MRP7 på forskellige tidspunkter (Fig. 2C og D). Dette tyder på, at effekten af ​​inhibitorer på respons af celler til de lægemidler mod cancer ikke skyldes reguleringen af ​​MRP7 udtryk.

3.2. Analyse af lægemidlet følsomhed MRP7-transficerede HEK293-celler

For at bestemme lægemiddelresistens profil MRP7, følsomheden af ​​HEK-MRP7-2 transficerede celler til specifikke antineoplastiske lægemidler blev sammenlignet med den af ​​vektoren kun kontrol celler, HEK293-pcDNA3.1. De HEK-MRP7-2 celler udviste en signifikant højere grad af resistens over for paclitaxel og vincristin (9.5- og 6.7-fold resistens sammenlign kontrolcellerne, henholdsvis) (tabel 1). Disse resultater viste, at HEK-MRP7-2 cellelinie var i stand til at give resistens over for forskellige antineoplastiske stoffer, der er i overensstemmelse med vores tidligere rapport [9].

3.3. Virkningen af ​​TKI’er på følsomhed MRP7-transficerede HEK293-celler til anticancerlægemidler

Vi testede adskillige BCR-Abl TKI’er at bestemme, om de kunne vende modstanden af ​​HEK293-celler, der overudtrykker MRP7 til det antineoplastiske lægemiddel paclitaxel og vincristin. Størrelsen af ​​tilbageførsel produceret af TKI’er til paclitaxel var variabel (tabel 1, fig. Figur 3). Præinkubation af celler med imatinib eller nilotinib, ved 2,5 uM, vendte markant modstand HEK-MRP7-2 celler til paclitaxel (tabel 1, fig. 3A og 3B). Imatinib og nilotinib produceret en henholdsvis 6.9- og 13,0 gange vending, henholdsvis af modstanden til paclitaxel. IC

50 af paclitaxel i HEK-MRP7-2 celler co-dyrket med 2,5 uM af nilotinib blev signifikant reduceret fra 207,0 ± 19,7 nM til 15,9 ± 0,9 nM, og dette var signifikant lavere end den for paclitaxel i kontrolgruppen (21,9 ± 1,9 nM). Modstanden mod paclitaxel blev fuldstændig vendt når imatinib blev co-inkuberet med paclitaxel i HEK-MRP7-2 celler. En signifikant større vending blev opnået på de 5 uM (12,4 gange) sammenlignet med koncentrationen 1 uM (4,7 gange). Imatinib, ved 5 uM, også øget følsomhed af celler til paclitaxel i HEK293-pcDNA3.1 celler ved 2,2 gange, selv om denne effekt i HEK293-pcDNA3.1 var signifikant lavere end i de MRP7 transficerede celler (12,5 gange) (tabel 1). Disse resultater indikerede, at BCR-Abl TKI’er imatinib og nilotinib betydeligt svækkede modstandsdygtigheden over for paclitaxel medieret af MRP7. Selvom co-inkubering af HEK293-pcDNA3.1 (kontrol celler) med nilotinib og paclitaxel også øget følsomhed over for paclitaxel (en 2,5 gange skift i HEK293-pcDNA3.1 celler), denne øgede følsomhed var signifikant lavere end fast besluttet for de MRP7 transfekterede celler (tabel 1;. figur 3C). I modsætning hertil har en anden BCR-Abl TKI, dasatinib på 2,5 uM, ikke signifikant forbedre paclitaxel følsomhed i enten HEK293-pcDNA3.1 eller HEK-MRP7-2 celler (tabel 1, fig. 3C).

To cellelinjer, HEK293-pcDNA3.1 og HEK-MRP7-2, er repræsenteret som HEK293- og MRP7 hhv. Efter podning og dyrkning af celler i 24 timer, ens mængder af PBS eller tilbageførslen midler blev tilsat til HEK293-pcDNA3.1-celler (vist som og henholdsvis) og HEK-MRP7-2 celler (vist som og henholdsvis) 1 time, før tilsætningen af ​​paclitaxel. De forskellige koncentrationer af paclitaxel blev angivet i figuren. Den endelige koncentration for imatinib, nilotinib eller dasatinib var 2,5 uM. Ovenstående figur viser et repræsentativt resultat for imatinib, nilotinib eller dasatinib.

Udover paclitaxel, vi også undersøgt effekten af ​​den valgte TKI’er at bevidstgøre celler til en anden anticancer narkotika, vincristin. Svarende til resultaterne med paclitaxel, nilotinib og imatinib (1, 2,5 og 5 uM) vendte markant MRP7-medieret vincristin modstand (2.1-, 6.8- og 9.0 gange, henholdsvis for nilotinib, 2.4-, henholdsvis 6.9- og 8.2-fold henholdsvis for imatinib) i en koncentrationsafhængig måde (tabel 1). Vi undersøgte også responset af MRP7-transficerede celler til et andet anticancerlægemiddel, doxorubicin, i nærvær af imatinib, som doxorubicin er ikke et substrat af MRP7 [23]. Vores resultater indikerede, at imatinib (1, 2,5 og 5 uM) ikke signifikant sensibiliserer responset af kontrol- parental HEK293-pcDNA3.1 celler, eller omvendt modstand i HEK-MRP7-2 transficerede celler, (tabel 1) over for doxorubicin. Dette betyder, at reaktionen på disse TKI’er var specifik for MRP7, som doxorubicin er ikke et substrat for MRP7 og vil således ikke mediere doxorubicin efflux. Doxorubicin er et substrat af P-gp, MRP1 og BCRP, men hverken imatinib eller nilotinib signifikant øget doxorubicin følsomhed HEK-MRP7-2 celler, hvilket antyder, at P-gp, MRP og BCRP ikke bidrage væsentligt til det stof modstand HEK- MRP7-2.

Samlet set imatinib og nilotinib vendte markant MRP7-medieret resistens over for paclitaxel og vincristin, men ikke doxorubicin. Desuden er denne vending var koncentrationsafhængig (tabel 1, fig. Figur 3). Selv om en stigning i sensibilisering af HEK293-pcDNA3.1 kontrol celler forekom ved eksponering for nilotinib eller imatinib, denne effekt var signifikant lavere end fastlagt for HEK-MRP7-2 transfekterede celler (tabel 1;. Figur 3).

3.4. Virkningerne af imatinib og nilotinib på den intracellulære akkumulering og udstrømning af [

3H] -paclitaxel

For at bestemme den mekanisme, hvormed imatinib og nilotinib Surmount eller omvendt MRP7-medieret paclitaxel modstand, deres effekt på akkumulering af [

3H] -paclitaxel i MRP7-transficerede celler blev undersøgt. Den intracellulære koncentration af [

3H] -paclitaxel i HEK-MRP7-2 celler var 30% af det akkumulerede af HEK293-pcDNA3.1 celler (Fig. 4). Ophobningen af ​​paclitaxel var signifikant forøget (1,9 gange) i HEK-MRP7-2 celler (P 0,05) efter inkubering af celler med enten imatinib eller nilotinib ved en koncentration på 5 uM. I HEK293-pcDNA3.1 celler, imatinib, men ikke nilotinib, havde resulteret i en mindre stigning i den intracellulære koncentration af [

3H] -paclitaxel, men denne sensibilisering var beskedent i forhold til effekten af ​​imatinib i HEK-MRP7- 2 celler.

de intracellulære paclitaxel ophobninger i HEK293-pcDNA3.1 og HEK-MRP7-2 celler blev målt efter inkubation med 0,1 pM paclitaxel. Intracellulær akkumulering af paclitaxel i HEK293-pcDNA3.1 celler i fravær af imatinib og nilotinib blev vist i de venstre barer (▪). Intracellulær akkumulering af paclitaxel i nærvær af 5 pM af imatinib i HEK293-pcDNA3.1 celler blev vist til højre (□). Intracellulær akkumulering af paclitaxel i HEK-MRP7-2 celler i nærvær af 5 pM af nilotinib blev vist til højre (). Hver søjle repræsenterer middel (± SD). Alle eksperimenter blev udført tre gange. * P 0,05, Student t-test

Baseret på de ovenstående resultater er det muligt, at stigningen i intracellulært paclitaxel produceres af imatinib og nilotinib kan skyldes: (1) et fald i. udstrømning af paclitaxel og /eller, (2) en stigning i optagelsen af ​​paclitaxel. Derfor blev den næste eksperiment udført for at bestemme, om stigningen i paclitaxel akkumulering produceret af imatinib og nilotinib skyldtes en inhibering af paclitaxel efflux. HEK-MRP7-2 celler og HEK293-pcDNA3.1 celler blev inkuberet med paclitaxel og et tidsforløb til intracellulær akkumulering af lægemidlet blev bestemt (fig. 5). Som forventet, HEK-MRP7-2 celler frigivet en signifikant højere procentdel af akkumuleret paclitaxel sammenlignet med HEK293-pcDNA3.1 celler, og mængden af ​​paclitaxel, der blev effluxed forøget med tiden. Den paclitaxel ophobning ved 0 min af narkotika efflux blev sat som 1. På 60 min, i celler inkuberet i stoffri medium blev -60% af den akkumulerede paclitaxel eksporteres fra HEK-MRP7-2 celler i fravær af imatinib eller nilotinib . I modsætning hertil næsten alle af paclitaxel var til stede inde i HEK-MRP7-2 celler inkuberet med imatinib eller nilotinib ved en endelig koncentration på 5 uM over forskellige tidsperioder. For kontrolcellerne er koncentrationen af ​​paclitaxel underkastes udstrømning steg også med tiden, men niveauet af efflux var kun lidt mindre end den observeret i celler transficeret med MRP7. I modsætning hertil i HE293-pcDNA3.1 celler, blev -30% af paclitaxel frigivet efter 60 min i fravær af forsøgsforbindelserne. Den inkubation af HEK293-pcDNA3.1 celler med imatinib eller nilotinib (5 uM) hæmmede også udstrømningen af ​​paclitaxel, men omfanget af effekten var signifikant lavere end observeret for HEK-MRP7-2 celler.

den procentdel af paclitaxel frigivet blev afbildet som en funktion af tid. Efter 1 h inkubation af TKI’er, [

3H] -paclitaxel blev co-inkuberet i HEK293-pcDNA3.1 med TKI () eller uden TKI (), og i mellemtiden i HEK-MRP7-2 celler med TKI () eller uden TKI (). Celler blev vasket og inkuberet igen i paclitaxel-frit medium. På tidspunkter af 0 min, 20 min, 60 min og 120 min blev cellerne opsamlet og niveauerne af [

3H] -paclitaxel blev bestemt ved scintillationstælling. Værdierne ved 0 min af lægemiddel efflux blev fastsat som 1 til sammenligning med værdier målt fra andre tidspunkter. Hvert punkt repræsenterer midler (± SD) af tre adskilte forsøg gøres ved hjælp af tredobbelte prøver.

Diskussion

Denne undersøgelse var den første til at identificere, at BCR-Abl TKI’er imatinib og nilotinib , men ikke dasatinib, kunne ændre MRP7-medieret MDR i en koncentrationsafhængig måde.

HEK293 celler transficeret med MRP7 rekombinante gen HEK-MRP7-2 og HEK293-pcDNA3.1-celler transficeret med tom vektor, blev anvendt til test af MRP7 efflux funktion. Disse transficerede cellelinjer er tidligere blevet anvendt i undersøgelser for at afgøre virkningerne af cepharanthine om omvendt MRP7-medieret resistens over for paclitaxel [9]. I denne undersøgelse Western blot-analyse bekræftede, at transfektion af celler med MRP7 lykkedes, som MRP7 proteiner blev kun udtrykt i HEK-MRP7-2 celler, og ikke i HEK293-pcDNA3.1 celler (Fig. 2). Cellelinierne blev udsat for præcis de samme eksperimentelle betingelser og procedurer, og blev dyrket med de samme antineoplastiske lægemidler til samme inkubationstid. Det kan fremføres, at MRP7-transficerede celler udtrykte andre proteiner, udover MRP7, såsom P-gp, der kan have bidraget til MDR. Imidlertid Western blot-analyse viste, at hverken HEK293-pcDNA3.1 kontrol cellelinie, eller HEK-MRP7-2 transficeret cellelinie, udtrykt detekterbare niveauer af P-gp (fig. 2), som også kan mediere MDR. Desuden MRP1 og BCRP kunne ikke påvises i både kontrol- HEK293-pcDNA3.1 og transficerede HEK-MRP7-2 celler gennem Western blot-analyse (data ikke vist). Derfor er disse resultater viser, at HEK-MRP7-2 transficeret cellelinie specifikt udtrykkes MRP7, men ikke P-gp, MRP, eller BCRP.

Tidligere er det blevet rapporteret, at cepharanthine og nilotinib vendte markant P- gp-medieret MDR i HEK-MRP7-2 celler [9] og BCRP-overekspression cellelinjer [24], hhv. Da MRP7 og P-gp er ens i struktur og funktionel aktivitet, vi designet eksperimenter for at bestemme, om nilotinib kunne ændre MRP7-medieret lægemiddelresistens til paclitaxel. På grund af den strukturelle lighed mellem MRP7 og P-gp, en tidligere undersøgelse viste, at nogle P-gp-hæmmere var i stand til væsentligt vende paclitaxel modstand i HEK-MRP7-2 celler overudtrykker MRP7 [9]. Vi fandt, at nilotinib (2,5 uM) signifikant sensibiliserede MRP7-transficerede HEK293-celler til paclitaxel som det markant nedsat IC

50 af paclitaxel i MRP7-trasnfected celler, sammenlignet med kontrolceller. Selvom nilotinib er en hæmmer af P-gp [24], er dette ikke en confounding faktor i vores eksperimenter, da P-gp protein ikke udtrykkes i enten HEK293-pcDNA3.1 eller HEK-MRP7-2 celler (Fig. 2) .

i denne undersøgelse fandt vi, at specifikke TKI’er: 1) signifikant nedsat resistens over for paclitaxel i MRP7-overudtrykkende celler (tabel 1, fig 3), 2) havde signifikant sensibilisere respons på paclitaxel i det tomme. vektor transficerede celler, men effekten var signifikant lavere end i de MRP7 transficerede celler (fig. 3), og 3) ikke signifikant hæmmer eller inducerer MRP7 ekspression (fig. 2C og D). Samlet set har disse resultater forsøgsvis tyder på, at af de TKI’er anvendt i denne undersøgelse, imatinib og nilotinib er i stand til at vende MRP7-medieret resistens ved at inhibere funktionen af ​​MRP7. Blandt de TKI’er der blev testet mod paclitaxel, BCR-Abl TKI’er imatinib og nilotinib ved 5 uM fuldstændigt reverserede MRP7-medieret paclitaxel resistens ved en størrelsesorden af ​​12.5- og 21.0-fold (tabel 1). I modsætning hertil en anden BCR-Abl TKI, dasatinib, produceret ingen signifikant vending af MRP7-medieret paclitaxel modstand (tabel 1. Figur 3C). I øjeblikket forklaringen på forskellen mellem dasatinib forhold til nilotinib eller imatinib er endnu ikke fastslået. Et potentielt tilgang, der kan give indsigt i dette spørgsmål ville være, at strukturelle-aktivitet relationer (SAR). Baseret på deres kemiske strukturer (fig. 1), mangler dasatinib en 2-phenylaminopyrimidine ring, der er til stede i strukturerne af nilotinib og imatinib. Det er muligt, at fraværet af denne ring i dasatinib kunne være en vigtig faktor, der adskiller dasatinib aktivitet fra enten nilotinib eller imatinib. Detaljeret struktur og funktion undersøgelser vil være forpligtet til at afgrænse SAR til vekselvirkningen mellem disse TKI’er med MRP7-overekspression celler. Desuden blev det foreslået, at HEK293-pcDNA3.1 celler også blev sensibiliseret ved co-administration af nilotinib eller imatinib (tabel 1, fig. Figur 5).