PLoS ONE: ZEB1 medierer resistens til epidermal vækstfaktor receptor-tyrosinkinaseinhibitorer i ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Epithelial-mesenkymale overgang (EMT) er en mekanisme af erhvervet resistens over for inhibitorer af de epidermal vækstfaktor receptor-tyrosinkinaser (EGFR-TKI’er) i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). De præcise mekanismer i EMT-relaterede erhvervet resistens til EGFR-TKI’er i NSCLC fortsat uklare. Vi genererede erlotinib-resistente HCC4006 celler (HCC4006ER) ved kronisk eksponering af

EGFR

-mutant HCC4006 celler til stigende koncentrationer af erlotinib. HCC4006ER celler erhvervet en EMT fænotype og aktivering af TGF-β /SMAD vej, mens der mangler både T790M sekundære

EGFR

mutation og

MET

genamplifikation. Vi ansat genekspression microarrays i HCC4006 og HCC4006ER celler til bedre at forstå den mekanisme af erhvervet EGFR-TKI modstand med EMT. På mRNA niveau,

ZEB1 (TCF8)

, en kendt regulator af EMT, var 20 gange højere i HCC4006ER celler end i HCC4006 celler, og øget ZEB1 proteinniveau blev også påvist. Desuden talrige

ZEB1

responsive gener, såsom

CDH1 (E-cadherin)

,

ST14

, og

vimentin

blev koordineret reguleret sammen med øget

ZEB1

i HCC4006ER celler. Vi identificerede også ZEB1 overekspression og en EMT fænotype i flere NSCLC celler og humane NSCLC prøver med erhvervet EGFR-TKI modstand. Short-interfererende RNA mod

ZEB1

vendt EMT fænotype og, vigtigst, restaureret erlotinib følsomhed i HCC4006ER celler. Niveauet af mikro-RNA-200C, som kan have en negativ regulere ZEB1, blev signifikant reduceret i HCC4006ER celler. Vores resultater tyder på, at øget

ZEB1

kan køre EMT-relaterede erhvervet resistens til EGFR-TKI’er i NSCLC. Man bør forsøge at udforske målretning

ZEB1

at resensitize TKI-resistente tumorer

Henvisning:. Yoshida T, Song L, Bai Y, Kinose F, Li J, Ohaegbulam KC, et al. (2016) ZEB1 formidler resistens til epidermal vækstfaktor receptor-tyrosinkinaseinhibitorer i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 11 (1): e0147344. doi: 10,1371 /journal.pone.0147344

Redaktør: Pier Giorgio Petronini, University of Parma, Italien

Modtaget: 23. marts 2015; Accepteret: 1. januar 2016 Udgivet: 20 januar 2016

Copyright: © 2016 Yoshida et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer. Den microarray datasæt blev forelagt Gene Expression Omnibus (GEO) med tiltrædelse nummer GSE71587

Finansiering:. Arbejdet blev delvist finansieret af tilskud fra Moffitt Cancer Center SPORE i lungekræft (P50-CA119997), NCI 1R01 CA121182, og Colorado Lung Cancer SPORE NCI-CA58187 (HD, PN, RMG). Dette arbejde er også blevet delvist understøttet af den Molekylærbiologi og sekventering Core, det Tissue Core, og Microarray Core på H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, en NCI udpeget Comprehensive Cancer Center (P30-CA076292). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

på trods gavn for epidermal vækstfaktor receptor-tyrosinkinaseinhibitorer (EGFR-TKI’er) i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) patienter med

EGFR

mutation [1], erhvervet resistens over for disse behandlinger er en kritisk klinisk problem. Selvom T790M sekundære

EGFR

mutation [2] og

MET

genamplifikation [3], kan tilsammen tegner sig for 70% af denne modstand, mekanismer for de resterende 30% er uklare. Den epitel-mesenkymale overgang (EMT) er blevet negativt forbundet med EGFR-TKI følsomhed i NSCLC [4-7]. I overensstemmelse med disse resultater, rapporterede de seneste undersøgelser EMT som en mulig mekanisme af erhvervet EGFR-TKI resistens i NSCLC cellelinje modeller [8,9]. Desuden EMT blev observeret i en undergruppe af NSCLC patienter, som udviklede EGFR-TKI modstand [10,11]. Men detaljerede mekanismer i EMT-relaterede erhvervet resistens over for EGFR-TKI’er i NSCLC, samt strategier for at overvinde det, fortsat uklare [8,9]. Adskillige signalveje, såsom FGFR [6,12], TGF-p [8,9], og WNT [13], samt transkriptionsfaktorer, såsom zink finger E-box-bindende homeobox 1 (ZEB1) [ ,,,0],14], er blevet impliceret i EMT-processen.

EMT muliggør epitelceller at opnå en mesenchymal fænotype associeret med øget migration (for reviews [15-20]). Det er en vigtig mekanisme til plasticitet under udviklingen og væv reparation. Det er involveret i sårheling, fibrose og stamcellebiologi og bidrager til progression af sygdomme-lignende organ fibrose og cancer. EMT aktiveres i cancerceller og er involveret i invasion, metastase, stamceller-lignende egenskaber, og modstandsdygtighed over for traditionelle antineoplastiske behandlinger [15,21,22]. EMT induceres af TGFp, andre vækstfaktorer, og hypoxi og involverer transkriptionsfaktorer som sneglen, Twist, ZEB1 /ZEB2, og E12 /E47 at modificere det transkriptionelle maskineri, ændring af translation og proteinstabilitet, ekspression af ikke-kodende RNA, og alternativ splejsning [16,23,24]. Klassiske funktioner i EMT er tab af celle-celle-adhæsion og cytoskelet omprogrammering. Low E-cadherin og høj vimentin og N-cadherin udtryk er klassiske EMT markører. På E-cadherin promotor, de histon demethylase LSD1 associerede virksomheder med Snail, transskription faktor involveret i de tidlige trin i EMT induktion, hvilket tyder på epigenetiske modifikationer under EMT [25,26]. Faktisk blev H3K27 acetylering faldt i ZEB1-induceret EMT i lungekræft celler [27]. For nylig blev molekylære træk forbundet med EMT defineret af en integreret tilgang i lungeadenocarcinom og pegede på en associering mellem cytoskelet og actin-bindende proteiner, EMT fænotype og invasive egenskaber [28]. Interessant, EMT er forbigående og reversible, og nye kliniske lægemidler rettet mod EMT er under udvikling [29].

Vi har etableret HCC4006ER (erlotinib-resistent) celler som en model af EMT-relaterede erhvervet resistens til EGFR-TKI’er af kronisk eksponering af følsomme HCC4006 NSCLC celler indeholder et

EGFR

mutation (exon 19; L747-A750del Insp) til stigende koncentrationer af erlotinib. Vi undersøgte globale ændringer i genekspression for at identificere molekyler og veje, der kan bidrage til EMT-relaterede erhvervet EGFR-TKI modstand i NSCLC. Desuden blev ekspressionsniveauet af mikro-RNA-200C (MIR-200C) undersøgt baseret på rapporter om, at MIR-200C negativt regulerer ZEB1 og EMT-processen [30-32].

Materialer og metoder

Reagenser

LBH589, erlotinib blev BIBW2992, WZ4002, BEZ235, og AZD6244 købt fra Chemie Tek (Indianapolis, IN). PD173074, LY364947, salinomycin, og IWP2 blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). CNTO328 blev leveret af Centocor, Inc. (Horsham, PA). CL-387.785 blev købt fra AXXORA (San Diego, CA). Stamopløsninger af disse reagenser i 100% DMSO blev fortyndet direkte i mediet til angivne koncentrationer. Menneskelig TGF-β1 blev købt fra R . D Systems (Minneapolis, MN)

Cell kultur

HCC4006, H1975 og H358 celler blev opnået fra ATCC (American Type Culture Collection). Celle identitet blev verificeret ved STR-analyse (ACGT, Inc., Wheeling, IL), og cellerne blev bekræftet at være mycoplasma-negative ved PlasmoTest Mycoplasma Detection (InvivoGen, San Diego, CA). Celler blev opretholdt i RPMI 1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA) ved 37 ° C og 5% CO

2

Generering af EGFR-TKI-resistente celler.

HCC4006ER (erlotinib-resistent) celler blev genereret ved eksponering af HCC4006 celler indeholder et

EGFR

mutation (exon 19; L747-A750del Insp) til gradvist stigende koncentrationer af erlotinib, der begynder ved 3 nM , i 3 måneder. Efter første tilpasning blev erlotinib koncentrationen gradvist øges til 4 uM. H1975 BIBW-R og H1975 WZ-R-celler blev genereret ved eksponering af H1975 celler indeholder et

EGFR

mutation (exon 21; L858R og exon 20, T790M) til gradvist stigende koncentrationer af BIBW2992 (irreversibel EGFR-TKI afatinib ) eller WZ4002 (T790M selektiv EGFR-TKI), der begynder ved 3 nM, i 3 måneder. Efter første tilvænning blev BIBW2992 eller WZ4002 koncentration gradvist øges til 3 uM eller 15 uM. Enkelte celle kloner af disse celler blev opnået ved såning ved meget lav densitet.

Status på

EGFR

KRAS

mutationer

Total genomisk DNA fra forældrenes og resistente celler blev fremstillet under anvendelse af DNeasy Blood Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) i overensstemmelse med det produkt manual. Direkte DNA-sekventering blev anvendt til at detektere

EGFR

KRAS

mutationer som beskrevet tidligere [33]. Vi anvendte også PCR-invader assay til at søge mindre populationer af T790M mutantceller, som tidligere beskrevet [34].

Cellelevedygtighed assay

Cellelevedygtighed blev bestemt under anvendelse af CellTiter-Glo

® Selvlysende Cell levedygtighed Assay (Promega, Madison, WI) i overensstemmelse med producentens anbefalinger. Kort beskrevet blev celler udpladet ved 3×10

3 celler per brønd i sorte væg 96-brønds plader (NUNC, katalog nr 165.305,. Rochester, NY) og inkuberet natten over i RPMI med 5% FBS. Celler blev derefter udsat for serielle fortyndinger af inhibitorer til 72 timer. Halvtreds mikroliter Cell-Titer Glo Reagens blev tilsat til hver brønd, og luminescens blev registreret ved anvendelse af en Victor-pladelæser (PerkinElmer, Waltham, MA). Resultater blev konverteret til procent cellelevedygtighed ved at sammenligne behandlet med ubehandlede (100% levedygtige) kulturer fra tre uafhængige forsøg udført in triplo. Kombination Index (CI) ved IC50 dosis af kombinationsbehandlingen blev beregnet ved CompuSyn software (https://www.combosyn.com/; ComboSyn, Paramus, NJ). CI 1, CI = 1, og CI. 1 angiver antagonistiske, additive og synergistiske virkninger, henholdsvis [35]

RTK-array

HCC4006 og HCC4006ER celler blev inkuberet i RPMI medium med 5 % FBS i 24 timer, indtil ~ 80-90% af celle konfluens. Phosphorylering niveauer af flere receptor (RTK’er), herunder EGF, FGF, PDGF, insulin, VEGF, EPH, AXL, og MER familier (blandt andre), blev undersøgt ved hjælp af Proteome Profiler menneskelige Phospho-RTK-array kit ( R 25 ug protein blev fremstillet for hver prøver. Primære antistoffer mod EGFR (# 2232), MET (# 3127), pY1234/Y1235-MET (# 3129), Y1289-Her3 (# 4791), pT705-STAT3 (# 9131), pS536-NFKB-p65 (# 3031) , pS465 /467-SMAD2 (# 3101), Akt (# 9272), pS473-Akt (# 9271), Erk (# 9102), pT202 /T204-Erk (# 4377), og PARP (# 9542) blev opnået fra Cell Signaling (Beverly, MA). Primære antistoffer mod pY1068-EGFR (# 44-788G) blev opnået fra Invitrogen. Primære antistoffer mod vimentin (BDB550513) blev indkøbt fra BD Biosciences (San Diego, CA). Primære antistoffer mod ZEB1 (sc25388), fibronektin (sc29011), Her3 (sc285), E-cadherin (sc8426), N-cadherin (sc7939), PTEN (sc7974), Snail (sc28199), Slug (sc15391), Twist (sc6269 ), og Lamin A /C (sc20681) blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Primære antistoffer til p-actin (SigmaA-1978) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich. Peberrodsperoxidasekonjugeret gede-anti-muse (NXA931) og anti-kanin (NA934V) sekundære antistoffer blev opnået fra Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).

Etablering af HCC4006ER celler med stabil overekspression Her3

En grøn fluorescerende protein (GFP) retroviral plasmid blev generøst tilvejebragt af Dr. Florian Grebien og Dr. Oliver Hantschel (CeMM Institute, Wien, Østrig). Subkloning af Her3 i retroviral plasmid og etablering af stabile cellelinjer med overekspression blev udført som beskrevet tidligere [36,38]. Kort fortalt blev humant Her3-cDNA erhvervet fra Addgene (Cambridge, MA) og amplificeret ved PCR under anvendelse af fremadrettet primer 5′-CACCATGAGGGCGAACGACGCTCT-3 ‘og revers primer 5′-CGTTCTCTGGGCATTAGCCTT-3’. Den Her3 PCR-produktet blev indsat i pENTR D-TOPO-vektor og indføres derefter i pfMSCV C-Strep-HA IRES GFP-GW vektoren ved Gateway LR ClonaseTM II Enzyme Mix Kit (Invitrogen). Retrovira blev pakket i Phoenix HEK293-celler fra ATCC (Manassas, VA) og anvendes til at inficere HCC4006ER celler. To uger efter infektion blev GFP-positive HCC4006ER celler Weaver FACSVantage (BD Biosciences) i Moffitt flowcytometri Core.

Migration (Scratch) assay og fotomikroskopi

HCC4006 og HCC4006ER udpladedes på 6 cm-skåle og inkuberet natten over i RPMI medium med 10% FBS for at skabe sammenflydende monolag. Cellemonolagene blev skrabet i en lige linje med en 1000-pi pipettespids og inkuberet i yderligere 12 timer. Celleudseende blev set med et Olympus CKX41 omvendt mikroskop (Olympus, Center Valley, PA) og fotograferet med en Infinity Et kamera med Infinity Capture /Analyze software (Lumenera Corp., Ottawa, ON).

TGF-β1 ELISA

HCC4006 eller HCC4006ER celler (5 x 10

5) blev podet i plader med 6 brønde og inkuberet natten over i RPMI med 10% FBS. Medium blev erstattet med serumfri RPMI med eller uden erlotinib (1 uM) og inkuberet i yderligere 24 timer. Supernatanter indsamlet til ELISA til human TGF-β1 (R 500 ng /pl) blev analyseret ved Affymetrix Gene Profilering Array chip HG-U133 (Affymetrix, Santa Clara, CA) i Moffitt Microarray Core. Data blev normaliseret ved hjælp MAS5, og forskelle i fold-ændring blev beregnet mellem HCC4006ER og HCC4006 celler (HCC4006ER /HCC4006). En positiv fold-change angivet et højere forhold i HCC4006ER celler, mens en negativ fold-change angivet højere udtryk i HCC4006 celler. Ændringer i genekspression ± 1,5 gange blev betragtet som signifikante [39]. Gensæt blev analyseret ved MetaCore (https://portal.genego.com; MetaCore, CA) [40]. Netværk data blev integreret og visualiseret ved Cytoscape (https://cytoscape.org/) [41]. Vores microarray datasæt blev forelagt Gene Expression Omnibus (GEO) med tiltrædelse nummer GSE71587.

Kvantitativ real-time RT-PCR-analyse

Efter isolering af RNA som ovenfor, kvantitativ real-time RT -PCR blev udført som tidligere beskrevet [14,42]. Tidligere rapporterede primere blev anvendt til ZEB1, snail, Slug, E-cadherin, EpCAM, ESRP1, ST14, vimentin, N-cadherin, og FGFR1 [14].

ZEB1 overekspression i H358 celler

Den ZEB1 genet blev klonet ind pcDNA5-FRT-TO og transficeret ind i H358-FlpIn Trex celler efterfulgt af selektion for resistens overfor 5 ug /ml blasticidin og 100 ug /ml hygromycin, som tidligere beskrevet [14]. 6-myc-ZEB1 overekspression blev fremkaldt i stabilt transficerede celler under anvendelse af 10 ng /ml doxycyclin i 5 dage.

Immunohistokemisk analyse af ZEB1

Immunohistokemisk farvning for ZEB1 blev udført som tidligere beskrevet [14] . Kort fortalt blev paraffinindlejrede tumor- skiver deparaffiniseret i Histoclear og rehydrerede efterfulgt af antigen-genvinding i kogende Antigen afmaskering Solution. Tumorprøverne var blevet indsamlet fra kirurgisk resektion prøver, som tidligere rapporteret [10]). Den institutionelle gennemgang bestyrelsens godkendte skriftlige informerede samtykke til brug af tumor vævsprøver blev opnået fra alle patienter eller fra deres værger (Institutional Review Board fra University of Miljø og Sundhed, Japan, IRB nummer 08-05). Endogene peroxidaser blev hæmmet (0,3% H

2O

2) og væv blev permeabiliseret med 0,5% Triton (20 minutter). Objektglas blev blokeret med 3% BSA /5% gedeserum, inkuberet i 2 timer med primær kanin-anti-ZEB1 (1:50), og vasket grundigt. Objektglas blev derefter inkuberet i 1 time med biotinylerede anti-kanin-antistoffer, vasket og fremkaldt med Vectastain ABC, ifølge fabrikantens protokol (Vector Laboratories, Inc.).

Kvantificering af MIR-200C

Totalt RNA blev ekstraheret ved TRIzol (Invitrogen). Revers transkription for moden MIR-200C og RNU6B blev udført med 20 ng total RNA med TaqMan MicroRNA revers transkription kit, der indeholder den MuLV revers transkriptase (Applied Biosystems, Foster City, CA). Den tilsvarende TaqMan MicroRNA assay blev anvendt til kvantitativ realtids-PCR med GeneAmp 7500-systemet (Applied Biosystems). Data er udtrykt som procent af RNU6B, 100×2

-ΔCt, hvor ACt = Ct

miR-200c- Ct

RNU6B.

Transfektion af korte interfererende RNA

Pre-valideret kort interfererende RNA (siRNA, Invitrogen, katalog nr HSS110549.) blev anvendt til at hæmme endogene ZEB1. ON-TARGET plus ikke-Målretning negativ kontrol puljer blev opnået fra Dharmacon (Lafayette, CO) og anvendt som negativ kontrol. Transfektion blev udført med Lipofectamine RNAiMAX fra Invitrogen ved hjælp af den omvendte transfektion procedure som anbefalet af producenten.

Resultater

Kronisk erlotinib eksponering af HCC4006 celler genererer stabil celle-autonome modstand mod EGFR-TKI’er uden T790M eller

MET

forstærkning

For at generere EGFR-TKI-resistente kloner fra en

EGFR

-mutant NSCLC cellelinje, vi udsatte EGFR-TKI-sensitive HCC4006 celler med

EGFR

mutation (exon 19; L747-A750del Insp) til stigende koncentrationer af erlotinib (op til 4 uM) i 3 måneder. HCC4006ER celler blev meget modstandsdygtige over for både erlotinib og irreversible EGFR-TKI, CL387,785 (figur 1A). Denne modstand var stabil, da det ikke var vendt ved dyrkning HCC4006ER celler i op til 6 måneder i erlotinib-frit medium (S1 Fig). Vi har også etableret 5 enkelt celle kloner af HCC4006ER celler (HCC4006ER-S1 til -S5 celler), som var hver for sig resistente over for erlotinib i samme grad som hovedparten HCC4006ER befolkning (S2A Fig). Således er den resistente fænotype var stabil og celleautonom.

A blev HCC4006 og HCC4006ER celler behandlet i 72 timer med stigende koncentrationer af erlotinib eller CL387,785. Data genereret af celleviabilitetstest (CellTiter-Glo) er udtrykt som en procentdel af værdien for ubehandlede celler. Fejlbjælkerne viser SEM af 3 uafhængige forsøg. B, HCC4006 og HCC4006ER celler blev inkuberet i 24 timer ved ~ 80-90% af celle konfluens. Helcellelysat af hver cellelinie blev opsamlet og underkastet Proteome Profiler Humant Phospho-RTK Array Kit til at undersøge phosphoryleringsniveauerne af multiple RTK’er. Detekterede phospho-RTK’er på arrayet er en cirkel. Pletterne i de fire hjørner af RTK-array er positive kontroller. C, HCC4006 og HCC4006ER celler blev inkuberet i 6 timer ± erlotinib (1 uM). Cellelysater blev udsat for proteinekspression analyse med antistoffer mod pEGFR, EGFR, pMET, MET, pHer3, Her3, PTEN, Pakt, Akt, Perk, Erk, og β-actin.

Vi undersøgte

EGFR

gen status både sensitive og resistente celler til sekundære T790M mutation i exon 20. selv HCC4006ER celler bevaret exon 19 L747-A750del Insp, T790M blev ikke fundet selv med PCR-angriber assay [34], som er mere følsom end direkte sekventering (data ikke vist). Derudover fandt vi ikke

KRAS

hotspot mutationer (exon 1 G12V og exon 2 Q61H, data ikke vist), som er forbundet med primær EGFR-TKI resistens i NSCLC [43]. For at undersøge andre rapporterede mekanismer EGFR-TKI modstand såsom

MET

forstærkning [3], aktivering af IGFR signalering [44], eller tab af PTEN protein [45], vi undersøgte centrale molekyler af EGFR vej ved Western blot og ansat en phospho-RTK array til undersøgelse af forskellige aktiverede RTK’er. Men observerede vi ingen tidligere identificeret modstand mekanisme til EGFR-TKI, herunder opreguleret markedsøkonomisk eller IGFR aktivitet (Fig 1B) eller tab af PTEN protein i HCC4006ER celler (Fig 1C). I form af EGFR-signalering, blev evne erlotinib til at hæmme EGFR fosforylering bevaret i både HCC4006 og HCC4006ER celler. Imidlertid phospho-Akt og Erk niveauer var følsomme kun at erlotinib i de parentale HCC4006 celler, i modsætning til HCC4006ER celler (Fig 1C).

En tidligere undersøgelse rapporterede, at Her3 medierer PI3K /Akt pathway signalering i gefitinib- følsomme NSCLC cellelinier [46]. vores Western blot analyser imidlertid demonstreret, at HCC4006ER celler helt tabt Her3 proteinekspression sammenlignet med HCC4006 celler, forklarer tabet af Her3- fosforylering i disse celler observeret i RTK array og Western-analyse (Fig 1B og 1C). For at bestemme, om HER3 tab kunne forklare modstand mod erlotinib i HCC4006ER celler, genereret vi Her3 overekspression celler (HCC4006ER-Her3 celler) ved hjælp af lentiviral infektion at undersøge virkningerne af erlotinib på celledeling og EGFR-sti. HCC4006ER-Her3 celler holdt deres modstand mod erlotinib (Fig 2A), samt vedholdenhed phospho-Akt og phospho-Erk (Fig 2B), der svarer til de oprindelige HCC4006ER celler og kontrol lentivirus-afledte GFP-overekspression (HCC4006ER-GFP). Disse resultater indikerer, at Her3 tab ikke drive erlotinib modstand i HCC4006ER celler.

A, HCC4006ER celler med stabil GFP eller Her3 overekspression (HCC4006ER-GFP og HCC4006ER-Her3 celler) samt HCC4006 og de oprindelige HCC4006ER celler blev behandlet i 72 timer med stigende koncentrationer af erlotinib. Data genereret af celleviabilitetstest (CellTiter-Glo) er udtrykt som en procentdel af værdien for ubehandlede celler. Fejlbjælkerne viser SEM af 3 uafhængige forsøg. B, blev HCC4006, HCC4006ER, HCC4006ER-GFP, og HCC4006ER-Her3-celler inkuberet i 6 timer ± erlotinib (1 uM). Cellelysater blev underkastet proteinekspression analyse med antistoffer mod Her3, pEGFR, EGFR, PTEN, Pakt, Akt, Perk, Erk, og β-actin. C, HCC4006ER-celler blev behandlet i 72 timer med stigende koncentrationer af erlotinib alene, BEZ235 alene, AZD6244 alene eller BEZ235 og AZD6244 i kombination. HCC4006 celler blev behandlet i 72 timer med stigende koncentrationer af erlotinib i 72 timer for at plotte en referencekurve. Data genereret af celleviabilitetstest (CellTiter-Glo) er udtrykt som en procentdel af værdien for ubehandlede celler. Fejlbjælkerne viser SEM af 3 uafhængige forsøg. Kombinationsindeks (CI) ved IC50-dosis BEZ235 kombineret med AZD6244 blev beregnet ved CompuSyn software. CI 1, CI = 1, og CI 1 angiver antagonistiske, additive og synergistiske virkninger, hhv. D, Both HCC4006 og HCC4006ER celler blev inkuberet i 6 eller 24 timer ± erlotinib (1 uM), BEZ235 (500 nM) eller AZD6244 (1 uM) som angivet. Cellelysater blev underkastet proteinekspression analyse med antistoffer mod pEGFR, EGFR, Pakt, Akt, Perk, og Erk (prøver af 6 timer) eller til PARP sammen med antistoffer mod p-actin som en loading kontrol (prøver af 24 timer).

med vedvarende fosforylering af Akt og Erk i HCC4006ER celler, vi undersøgt virkningerne af den PI3K /mTOR-hæmmer, BEZ235, og MEK-inhibitor, AZD6244. Vi observerede, phospho-Akt blev aktiveret ved phospho-Erk inhibering med AZD6244 i både HCC4006 og HCC4006ER celler. Denne phospho-Akt aktivering induceret af AZD6244 var ikke helt hæmmet af BEZ235 i HCC4006 og HCC4006ER celler (Fig 2D). Kombinationen af ​​BEZ235 og AZD6244 genetablerede ikke inhiberingen af ​​celleproliferation eller PARP-spaltning i HCC4006ER celler induceret af erlotinib behandling i HCC4006 celler, selvom Kombination Index (CI) for denne kombination indikerer synergistisk virkning (Cl 1) (fig 2C og 2D ). Disse resultater viser, at den dobbelte hæmning af Akt og Erk ikke overvinde erlotinib resistens i HCC4006ER celler, selvom phospho-Akt og Erk vedvarende aktiveredes uafhængigt af EGFR pathway.

HCC4006ER celler en EMT fænotype med aktivering af TGF-β /SMAD vej

For at bestemme, om modstand i HCC4006ER celler var forbundet med en EMT proces, vi testede celle migration ved hjælp scratch analyser. I HCC4006ER celler, blev hullet helt lukket inden for 12 timer, mens mere end 12 timer var nødvendige i forældrenes HCC4006 celler (Fig 3A). Vi fandt også, at proliferation af HCC4006ER celler var signifikant langsommere end parentale celler (Fig 3B), i overensstemmelse med nylige undersøgelser tyder langsommere vækst af lægemiddelresistente celler [47]. Adskillige rapporter har indikeret, at EMT er forbundet med primær og erhvervet resistens til EGFR-TKI i NSCLC [4-11]. Den øgede migration, erlotinib modstand, og reduceret spredning af HCC4006ER celler var i overensstemmelse med en EMT proces. For yderligere at undersøge denne mulighed, vi kiggede for EMT-relaterede molekyler i HCC4006 og HCC4006ER celler. Vigtigt er det, fandt vi tab af E-cadherin og opregulering af N-cadherin, vimentin og fibronektin i HCC4006ER celler, som ikke var påvirket af erlotinib behandling (Fig 3C). Endvidere fandt vi, at alle enkelt celle kloner (HCC4006ER-S1 til -S5) havde undergået EMT, samt tab af Her3-protein, svarende til de observeret i de oprindelige HCC4006ER celler (S2B Fig) resultater. Tidligere undersøgelse viste, at vedligeholdelsen af ​​gefitinib forhindrede EMT-processen og hæmmede celle migration i gefitinib-resistente NSCLC celler med

MET

-amplification (men uden EMT fænotype) [48]. Imidlertid blev ekspressionsniveauerne af EMT markører (E-cadherin, N-cadherin, vimentin, og fibronectin) ikke påvirket af fortsat eksponering af erlotinib i 72 timer i HCC4006ER celler (S3A Fig). Derudover evne migration i HCC4006ER celler var stadig bedre end i HCC4006 celler selv inkuberet med erlotinib (S3B Fig). Disse resultater antydede, at EMT fænotype i HCC4006ER celler var stabile uanset tilstedeværelsen af ​​erlotinib.

A, Monolag af HCC4006 og HCC4006ER celler blev skrabet i en lige linje med en 1000-uL pipettespids. Enkeltlagshylstre fotos med ridser blev taget efter 12 timers inkubation. B, blev HCC4006 og HCC4006ER celler udpladet ved 1×10

3 celler /brønd i sorte væg plader med 96 brønde, inkuberet i RPMI med 10% FBS og fik lov at vokse i angivne dage. Data genereret af celleviabilitetstest (CellTiter-Glo) er udtrykt som en procentdel af værdien for ubehandlede celler. Bestemmelser blev udført tre gange. Barer, SEM. * P 0,0001 for HCC4006 versus HCC4006ER (Student

t

test). C, HCC4006 og HCC4006ER celler blev inkuberet i 6 timer ± erlotinib (1 uM). Cellelysater blev underkastet proteinekspression analyse med antistoffer mod E-cadherin, N-cadherin, vimentin, fibronectin, og β-actin. D, HCC4006 og HCC4006ER celler blev inkuberet i 6 timer ± TGF-β1 (10 ng /ml) eller erlotinib (1 uM), som angivet. Cellelysater blev underkastet proteinekspression analyse med antistoffer mod pSMAD2 og til p-actin. E, HCC4006 eller HCC4006ER celler blev inkuberet natten over. Medium blev erstattet med serumfri RPMI med eller uden erlotinib (1 uM) og inkuberet i yderligere 24 timer. Supernatanter blev opsamlet og udsat for TGF-β1 ELISA. Bestemmelser blev udført tre gange. Barer, SEM. *

P

0,0001 versus HCC4006 celler med eller uden erlotinib behandling (Student

t

test). F, er TGF-β-induceret transkription øges ved samtidig behandling med TGF-β og erlotonib i forbigående og transfektioner med TGF-p-responsiv luciferase konstruktioner. HCC4006 og HCC4006ER celler blev transient transficeret med p3TP-Lux reporter eller pSBE4 og behandlet med DMSO, 5 ng /ml TGF-β1, 1 uM erlotinib, eller en kombination af 5 ng /ml TGF-β1 og 1 uM erlotinib i 48 timer. Efter 48 timer blev luciferaseaktivitet bestemmes som beskrevet i Materialer og Metoder.

I overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der viser, at TGF-β-vejen er kritisk for EMT-relaterede erhvervet EGFR-TKI resistens i NSCLC [8 , 9], fandt vi højere basale niveauer af SMAD2 fosforylering i HCC4006ER celler. Som forventet, SMAD2 fosforylering yderligere forøget efter TGF-β behandling, og denne stigning var uafhængig af erlotinib behandling (Fig 3D). I forhold til HCC4006 celler blev mængden af ​​TGF-β1 i mediet opreguleret i HCC4006ER celler (uafhængige af erlotinib behandling) (fig 3E), hvilket antyder, at TGF-β pathway blev aktiveret sekundært til øget ligand ekspression. Aktivering af TGF-β vej hos HCC4006ER celler blev bekræftet ved transfektion af TGF-p-responsiv luciferase reporter plasmider, pSBE4 og p3TPlux, ind både HCC4006 og HCC4006ER celler behandlet med 5 ng /ml TGF-β og /eller 1 uM erlotinib . Som det kan ses i fig 3F, TGF-β-drevet transkription er højere i HCC4006ER celler end i parentale celler, når de stimuleres af TGF-β uanset tilstedeværelsen af ​​erlotinib (fig 3F). *

P

*

P