PLoS ONE: Phenethylisothiocyanate Alters site-og Promoter-Specifikke histon Tail Ændringer i Cancer Cells

Abstrakt

site-specifikke histon modifikationer er vigtige epigenetiske regulatorer af genekspression. Som deregulering af gener ofte resulterer i komplekse lidelser, kunne korrigerende modulation af stedsspecifikke histon mærker være en stærk terapeutisk eller sygdom-forebyggende strategi. Men en sådan graduering af kosten forbindelser og den deraf følgende indvirkning på risiko for sygdom forbliver relativt uudforsket. Her undersøgte vi phenethylisothiocyanate (PEITC), en fælles kosten forbindelse afledt af korsblomstrede grøntsager med kendte kemoforebyggende egenskaber under eksperimentelle betingelser, som en mulig modulator af histon ændringer i humane colon cancerceller. Den nuværende undersøgelsesrapporter roman, dynamiske, stedspecifikke kemiske ændringer histon H3 i et gen-promotor-specifik måde, der er forbundet med PEITC eksponering i menneskelig kolon tumor-afledte SW480 epitelceller. Desuden PEITC svækket celleproliferation i en koncentrations- og tidsafhængig måde, sandsynligvis medieret af caspase-afhængig apoptotisk signalering. Virkningerne af PEITC på histon modifikationer og genekspression ændringer blev opnået ved lave, ikke-cytotoksiske koncentrationer, i modsætning til de højere koncentrationer er nødvendige for at standse cancercelleproliferation. Øget forståelse af specifikke epigenetiske ændringer som kosten forbindelser kan give forbedret kemoforebyggende strategier for reduktion sundhedssektoren forekomsten af ​​kræft og andre sygdomme hos mennesker

Henvisning:. Liu Y, Chakravarty S, Dey M (2013) Phenethylisothiocyanate Alters site-og Promotor-specifik histon Tail Ændringer i kræftceller. PLoS ONE 8 (5): e64535. doi: 10,1371 /journal.pone.0064535

Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: September 17, 2012; Accepteret: 16. april, 2013; Udgivet: 28. maj 2013 |

Copyright: © 2013 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Major støtte til dette arbejde kom fra National Institutes of Health bevilge [R00AT4245] (til MD). Yderligere understøtter kom fra South Dakota Landbrug Experiment Station giver 328100/318000 (til MD) og 3AH386 (til SC), biologisk kontrol og analyse af Applied Photonics: South Dakota 2010 center tilskud 3SG163 (til SC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er fortsat den anden hyppigste årsag til alle dødsfald i USA [1]. Heldigvis kan mange kosten forbindelser potent modulere forskellige molekylære mål, hvilket fører til forebyggelse af kræft initiering, promotion, og progression. Især frugter og grøntsager er rige kilder til biologisk aktive forbindelser, der ofte har lave toksiciteter men betydelige effektiviteter [2]. I fortiden, var kræft snævert tænkt som en sygdom af mutationer, men nyere forskning knytter også den syge tilstand med den forstyrrelse af cellulære regulatoriske netværk, og afbrydelsen af ​​genfunktion og genregulering er nu begge anerkendt som kendetegnende for kræft [3] [4], [5]. Derfor sygdomsspecifikke forebyggende foranstaltninger, der kan målrette centrale elementer i de netværk, der regulerer gen funktion, såsom kromatin, kan være effektiv. Ændringerne af stedsspecifikke kromatin modifikationer, kendt som epigenetiske ændringer, er relevante for klinisk onkologi, da de er tæt forbundet med genekspression og netværk forstyrrelser i den syge tilstand [6], [7]. Derfor belyse rolle kosten forbindelser i nulstilling af afvigende epigenetiske landskaber ansvarlige for ændret genekspression kan lette forebyggende lægepraksis.

epigenetiske grundlag af genregulering er manifesteret ved den strukturelle enhed af kromatin, den nukleosom, som er en samling af histon octamerer indpakket af genomisk DNA. Ændringer af histoner udgør en stor molekylær kontrolpunkt i reguleringen af ​​genekspression, og disse ændringer er ofte ændres i kræft [6], [7]. Blandt mange kendte histon aminosyre hale modifikationer, methylering og acetylering af lysinrester på histon H3 er blevet grundigt undersøgt med hensyn til gen-silencing og genregulering. Dimethylering af H3 ved lysin 9 (H3K9me2) og trimethylation af H3 ved lysin 27 (H3K27me3) er ofte forbundet med transkriptionel repression og gendæmpning [8]. Site-specifikke histon lysin methyleringer katalyseres af histon methyltransferaser (HMTs), og fjernelsen af ​​methylgrupper katalyseres af demethylases. Tilsvarende er deacetylering af histoner på genpromotorer katalyseret af histondeacetylaser (HDAC) korreleret med kondensering af kromosomale domæner mærkning regioner af transkriptionel inkompetence og nedregulering af de tilknyttede gener [9]. Selvom in vitro-undersøgelser af den rolle, kosten fytokemikalier i modulering af niveauerne af HMTs og HDAC’er findes i mindre mængder [10], graduering af position-specifikke H3 lysin ændringer ved kosten forbindelser i et gen-specifik måde fortsat relativt uudforsket [11] . Her undersøgte vi H3-acetylering (H3-Ac) og stedspecifikke H3 lysin methyleringer (H3K27me3 og H3K9me2) i forbindelse med phenethylisothiocyanate (PEITC) -medieret genekspression graduering i humane colon cancerceller. Dette er en opfølgning af vores tidligere rapporter om PEITC som kosten forbindelse med potentielle anti-inflammatoriske funktioner i forskellige forsøgsmodeller [12], [13].

PEITC forekommer naturligt i form af sin glucosinolater forløber, gluconasturtiin, i grøntsager, såsom kål, blomkål, wintercress, og broccoli. PEITC har vist potentiale antioxidant og kemoforebyggende aktivitet i eksperimentelle modeller for forskellige kræftformer [14], [15]. Det udviste ingen tilsyneladende toksicitet i narkotika sikkerhedsundersøgelser [16] og er i øjeblikket i kliniske forsøg for lungekræft behandlinger (clinicaltrials.gov: NCT00005883, NCT00691132). I mus, vi tidligere vist, at PEITC dæmper colon inflammation og modulerer en række potentielle biomarkører relateret til inflammation og colon carcinogenese. Disse biomarkører inkluderet gener relateret til det inflammatoriske respons, apoptose, cellecyklusregulering, proliferation, cytokin /chemokin-aktivitet, og transkriptionel regulering [12], [13].

kolorektal cancer er den anden førende årsag til kræft -relaterede dødsfald i USA [21]. Interessant, er en mekanistisk sammenhæng mellem kronisk inflammation og en øget risiko for kræft som følge af betændelse-induceret genetiske og epigenetiske ustabilitet nu godt accepteret [17]. Centrale aktører i denne forening omfatter transkriptionsfaktorer, såsom nuklear faktor kappa B (NFKB) og signal transducere og aktivatorer af transkription (stats), cytokiner /kemokiner og matrixmetalloproteinaser (MMP’er), en multigenfamilie af zink-afhængige ekstracellulære Matrix- remodeling endopeptidaser. Disse cellulære mediatorer, hvoraf vi studeret tidligere i musemodeller [12], [13], har vigtige funktioner i forbindelse med omgåelse af adaptiv immunitet, proliferation, overlevelse af maligne celler, tumorvækst, angiogenese, invasion og metastase [17 ], [18], [19], [20]. Den aktuelle undersøgelse undersøgte kromatin ændringer i forbindelse med PEITC-medieret modulering af ekspressionen af ​​disse mediatorer i humane colon cancerceller.

Materialer og metoder

Drug og kemikalier

Dimethyl sulfoxid (DMSO), lipopolysaccharid (LPS, fra

Escherichia coli

stamme O55: B5), penicillin /streptomycin, og phenethylisothiocyanate (PEITC) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), føtalt bovint serum (FBS), og TrypLE blev indkøbt fra Gibco (Grand Island, NY). Humant interferon-γ (IFNy) blev indkøbt fra R Promega, Madison, WI) blev anvendt til bestemmelse af relative antal af levedygtige SW480 celler er tilbage efter PEITC behandling, i henhold til producentens anvisninger. Assayet blev udført ved at behandle SW480 celler med forskellige PEITC koncentrationer, efterfulgt af tilsætning af 20 pi CellTiter reagens direkte til dyrkningsbrønde, inkubering i 2 timer ved 37 ° C, og derefter registrering af absorbansen ved 490 nm med en BioTek Synergy H4 pladelæser ( BioTek, Winooski, VT). Baggrund 490 nm absorbansen blev korrigeret ved at forberede en tredobbelt sæt kontrolbrønde (uden celler), der indeholder de samme mængder af dyrkningsmedium og CellTiter reagens som i de eksperimentelle brønde. Det samme assay blev også udført ved anvendelse af højere koncentrationer af PEITC (op til 80 uM) og udsætte celler for længere tidsperioder på op til 48 timer for at bestemme anti-spredning virkninger af PEITC i SW480-celler (figur 1). Det skal bemærkes, at selv lavere koncentrationer (over 5 uM) af PEITC behandling i længere inkubationsperioder såsom 48 timer inducere signifikant celledød og mRNA nedbrydning (Figur 1). Koncentrationer af PEITC i hvilke der ingen signifikant tab af cellelevedygtighed indtraf (ingen cytotoksiske virkninger) blev udvalgt til alle yderligere eksperimenter (figur 2, 3, 4, 5, 6). Derfor blev alle genekspression assays (RNA og protein udtryk) og epigenetiske ændringer præsenteret i dette håndskrift bestemmes ved 5 h tidspunkt, medmindre andet er nævnt. En 40 uM eksponering af PEITC i 12 timer eller mindre viste ikke en statistisk signifikant tab i cellelevedygtighed (figur 1A). For tidsafhængige observationer (figur 5 og S1, S2, S3, S4, S5), celler med 10 pM PEITC behandling blev inkuberet i op til 18 timer, som en statistisk signifikant tab i cellelevedygtighed blev ikke observeret indtil dette tidspunkt ( Figur 1A).

Efter 12, 24 og 48 h PEITC eksponering og en efterfølgende 2 timers inkubation med CellTiter vandigt reagens (Promega), a

490 nm blev målt i SW480-celler i en BioTek Synergy H4 læser. Procent cellelevedygtighed er vist i forhold til kontrol (ingen PEITC) som middelværdien ± SEM (A); Koncentrationsafhængig effekter af PEITC efter 48 h på DNA-fragmentering (B); Koncentrationsafhængig modulering af ekspressionen af ​​gener relateret til apoptose og cellecyklussen ved PEITC efter 48 timer. GAPDH blev anvendt som en husholdning kontrol for relativ kvantificering af genekspression ændringer (C); for alle forsøg n = 3. * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001. Intet tab i celle levedygtighed i 10 uM PEITC gruppen sammenlignet med no-PEITC gruppen blev observeret op til 12 timer.

Seks gener er vist for hvilke PEITC-associerede ændringer i H3 modifikationer blev også observeret . Gois for hvilke ikke blev observeret PEITC-eksponering-associeret H3 ændringer er vist i tabel 3, men ikke i det nuværende tal. Virkningerne af PEITC behandlinger blev målt ved den relative mRNA mængde af indonesiske regering udtrykt i de behandlede celler. Det mRNA mængde blev målt ved hjælp af real-time RT-PCR, med GAPDH som en intern kontrol. Lavere værdier repræsenterer større inhiberende virkninger. Værdier er gennemsnit ± SEM (n = 6). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001. Når alle værdier under den stiplede linje svarer til samme kategori af

s Drømmeholdet værdi, er individuelle stjerner udeladt for at undgå overbelægning af figuren. Statistiske betydninger blev målt i forhold til den positive kontrol, som er celler behandlet med LPS og ingen PEITC, der viser de højeste geninduktion niveauer.

histon H3 ændringer methylering ved de promotorområder af gener af interesse (GOI ) i SW480-celler. Chromatin fra SW480 celler blev høstet efter 5 timer af 10-pM PEITC behandling. Resultaterne af chip analyser under anvendelse af (A) anti-trimethyl-histon H3 Lys27 (H3K27me3) og (B) anti-dimethyl-histon H3 Lys9 (H3K9me2) antistoffer er vist. Ud af 13 testede i SW480 celler Góis’s, viste seks gener statistisk signifikante PEITC-associerede ændringer i H3K27me3 stater og et gen viste statistisk signifikante PEITC-associerede ændringer i H3K9me2 tilstand. DNA-sekvenser blev kvantificeret ved real-time PCR under anvendelse promotor- primere. Gennemsnitlig procentdel input ± SEM (n = 3) fra hvert eksperiment er afbildet. * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001 sammenlignet med positiv-kontrol celler

histon H3 acetyleringsniveauer ændringer på promotorområdet af gener af interesse (GOI) i SW480 celler. Chromatin fra SW480 celler blev høstet efter 5 timers 10 pM PEITC behandling. Ud af 13 testede i SW480 celler Góis’s, viste to gener statistisk signifikante PEITC-associerede ændringer i H3-Ac-status. Resultaterne af chip analyser anvendelse af et anti-acetyl-histon H3-antistof er vist. DNA-sekvenser blev kvantificeret ved real-time PCR under anvendelse promotor- primere. Gennemsnitlig procentdel input ± SEM (n = 3) fra hvert eksperiment er afbildet. * P 0,05, *** p. 0,001 sammenlignet med positiv-kontrol celler

Repræsentative resultater, der viser de tidsafhængige effekter af 10 uM PEITC behandling på STAT1 mRNA-niveauer og på H3K27me3 methylering tilstand . SW480-celler blev behandlet med 10 pM PEITC i de angivne tidspunkter (A, B). De STAT1 mRNA niveauer blev normaliseret til GAPDH niveauer og udtrykt som en procentdel i forhold til positiv-kontrol-celler (A). Histon H3 methylering ændringer på STAT1 promotorregionen i SW480-celler blev bestemt ved anvendelse af et anti-H3K27me3 antistof til chip. DNA-sekvenser blev kvantificeret ved real-time PCR (B). Datapunkter repræsenterer middelværdien ± SEM (n = 4) fra hvert eksperiment. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 sammenlignet med positiv-kontrol celler. De grønne stiplede linjer angiver en mulig omvendt korrelation (for undertrykkende varemærker) mellem ændringer i mRNA-niveauer og H3 modifikation status i cellerne. Tilstedeværelsen eller fraværet af tilsvarende korrelationer for de resterende fem indonesiske regering er vist i fig S1, S2, S3, S4, S5.

immunoblotanalyser viser undertrykkelse af totalt cellulært STAT1 samt aktiveret nuklear pSTAT1 i respons på PEITC behandlinger i SW480-celler i en koncentrationsafhængig måde. (A) Immunoblot. (B) Densitometrisk analyser af immunoblot. Celler blev forbehandlet med forskellige koncentrationer af PEITC i 5 timer før til 4 h LPS-aktivering. Ikke-stimulerede celler og stimulerede celler tjente som negative og positive kontroller. Båndintensiteter blev normaliseret for p-actin. Værdier er udtrykt som middelværdier ± SEM (n = 3) af tre separate forsøg. * P 0,05, ** p. 0,01

DNA fragmentering Assay til påvisning af apoptose

SW480 celler behandlet med forskellige koncentrationer af PEITC blev inkuberet i 48 timer før høst genomisk DNA hjælp DNAzol (Invitrogen, Grand Island, NY), efter fabrikantens protokol. DNA-fragmentering blev visualiseret under anvendelse af 1,5% agarosegelelektroforese og GelRed farvning (Biotium, Hayward, CA).

Total RNA Extraction, Purification, og cDNA Synthesis

Totalt RNA blev ekstraheret fra celler under anvendelse af TRIzol reagens (Invitrogen, Grand Island, NY), ifølge producentens instruktioner. RNA blev kvantificeret ved absorptionsmålinger ved 260 og 280 nm ved NanoDrop spektrofotometersystemet (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). RNA blev derefter behandlet med DNase I (Invitrogen Inc.), ved at følge producentens retningslinier til fjernelse af eventuelle spor af DNA-kontaminering. CDNA’erne blev syntetiseret under anvendelse af 3 ug af RNA for hver prøve ved anvendelse af High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) efter fabrikantens protokol. RNA ekstraktion, oprensning, og cDNA-syntese blev udført som beskrevet tidligere [13].

Real-Time kvantitativ PCR

De syntetiserede cDNA’er blev fortyndet fire gange. To mikroliter af hver fortyndet prøve blev tilsat til 0,5 pi gen-specifikke primere og 12,5 pi Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosciences, Foster City, CA) og det endelige volumen bringes til 25 pi ved tilsætning sterilt destilleret vand. PCR-amplifikationer blev udført på et MX3005P-system (Roche /Stratagene) under anvendelse af en cyklus ved 50 ° C i 2 minutter, en cyklus på 95 ° C i 10 minutter, 40 cykler af 15 sekunder ved 95 ° C og 1 min ved 60 ° C og en sidste cyklus med 95 ° C i 1 min, 55 ° C i 30 s, og 95 ° C i 30 s, som beskrevet [13]. NTC (ingen skabelon kontrol), no-RT kontrol, og PEITC-only kontroller blev anvendt som passende til kvalitetskontrol. Alle prøver blev kørt in duplo. Genspecifikke, intron-spændende primere anvendt i den aktuelle undersøgelse er beskrevet i tabel 1 (for PEITC koncentrationsafhængig mRNA-ekspression) og tabel 2 (for CHIP eksperimenter). Beregninger af relative ekspressionsniveauer blev udført under anvendelse af ΔΔC

t-metoden [25]. Dataværdier er gennemsnit af mindst tre uafhængige forsøg, og er udtrykt som den relative mRNA mængde i forhold til en positiv kontrol, der er normaliseret til en værdi på 1,0.

Western blot analyse

for immunoblot analyser, IFNy-primet, PEITC-behandlede SW480-celler blev aktiveret med LPS i 4 timer og høstet ved anvendelse af RIPA-lysepuffer (20 mM Tris-HCI pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM Na

2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 1% natriumdeoxycholat, 2,5 mM natriumpyrophosphat, 1 mM β-glycerophosphat, 1 mM Na

3VO

4, 1 ug /ml leupeptin). Til fremstilling kerneekstrakt og proteinkoncentration bestemmelse blev fabrikantens (Thermo Scientific, Rockford, IL) protokoller for NE-PER Nuclear Ekstraktion Reagenser og Pierce BCA Protein Assay kit fulgt. Proteiner (50 ug /bane) blev adskilt ved 12% SDS-PAGE og produkterne blev elektro-overført til polyvinyldene (PVDF) -membraner (Thermo Scientific, Rockford, IL). Membranerne blev blokeret med 5% skummetmælk i 1 time, vasket tre gange i PBS, inkuberet med primært antistof (kanin-anti-β-actin fra Santa Cruz Biotechnology og kanin-anti-STAT1 og anti-phosphoryleret STAT1 [Ser727] fra Millipore) natten over, vasket tre gange i Tween-20 (0,1% i PBS) og inkuberet med Dylight 800 anti-kanin sekundært antistof fra Li-Cor i 1 time, alle ved stuetemperatur. Efter skylning i Tween-20 (0,1% i PBS), blev blots afbildet med en Odyssey infrarød billeddannelse-system (Li-Cor).

Kvantitativ chromatin Immunfældning (chip) Analyse

Celler udpladedes ved en densitet på ~3-5 × 10

6 per brønd i 6-brønds plader 18-24 timer før behandling, derefter skyllet to gange med koldt PBS og høstet efter behandling [26]. Chippen assay blev udført under anvendelse af en modificeret version af en tidligere publiceret metode [27]. Celler blev suspenderet i iskold buffer 1 (0,06 M KCI, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl

2, 15 mM Tris-HCI pH 7,4-7,6, 0,1 mM EGTA, 0,3 M saccharose, 180 ug aprotinin, 5 mM natriumbutyrat, 0,1 mM PMSF, 0,5 mM DTT) og Buffer 2 (0,8% NP40 + buffer 1) i 10 minutter på is. Cellesuspensioner blev tilsat til nye rør indeholdende Buffer 3 (0,06 M KCI, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl

2, 15 mM Tris-HCI pH 7,4-7,6, 0,1 mM EGTA, 1,2 M saccharose, 180 ug aprotinin, 5 mM natriumbutyrat, 0,1 mM PMSF, 0,5 mM DTT). Efter at prøverne blev centrifugeret, blev kernerne opsamlet og resuspenderet i MNase digestionspuffer (0,32 M saccharose, 50 mM Tris-HCI pH 7,4-7,6, 4 mM MgCl

2, 1 mM CaCI

2, 0,1 mM PMSF, 5 mM natriumbutyrat), inkuberet i et 37 ° C vandbad i 6 min, og 20 pi 0,5 M EGTA tilsat for at stoppe reaktionen. På denne måde blev kromatin spaltet til en gennemsnitlig DNA længde på 300-800 bp. Efter centrifugering supernatanten indeholdt den første opløselige fraktion af kromatin, S1. Pelleten blev resuspenderet i dialyse puffer (1 mM Tris-HCI pH 7,4-7,6, 0,2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 5 mM natriumbutyrat), anbragt på is i 1-2 timer og centrifugeret. Den resulterende pellet blev den anden opløselige kromatin fraktion, S2. Portioner af de to kromatin fraktioner (10-20 ug S1 og 10-20 ug S2) blev blandet, mængden fortyndet til 1 ml ved chip inkubationsbuffer (Abcam), og den underkastes immunofældning med specifikke antistoffer blanding, med rotation natten over ved 4 ° C. Immunopræcipiterede kromatin blev ekstraheret ved anvendelse af protein-A-sepharose og oprenset ved anvendelse af en DNA-oprensning opslæmning (Diagenode, Denville, NJ). En alikvot af hver immunopræcipiteret DNA-template (100-150 ng) blev anvendt til kvantitativ realtids-PCR-analyse under anvendelse sekvensspecifikke genpromotor primere (tabel 2). Det PCR-amplificerede immunopræcipiteret DNA signal blev normaliseret til PCR signal fra ikke-immunpræcipiteret indført DNA [28]. De opnåede ved udfældning med kontrol-IgG signaler blev subtraheret fra signalerne opnået med de specifikke antistoffer. Beregninger var baseret på gennemsnittet af mindst tre uafhængige forsøg, og resultaterne er udtrykt som en procentdel af input (figur 3, 4, 5, S1, S2, S3, S4, S5).

Statistisk analyse

den statistiske signifikans af behandlingsgrupper blev vurderet ved envejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts posthoc analyse til sammenligning af individuel behandlingsgruppe med kontrollen. Data er udtrykt som middelværdi ± SEM. Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange. En sandsynlighed (

s

) værdi på 0,05 eller derunder blev anset for at være kriteriet for en betydelig forskel.

Resultater

Effekt af PEITC på genekspression i humane celler

for at revurderer de genekspression resultater som reaktion på PEITC behandlinger opnået i vores tidligere undersøgelse af mus makrofager [12], vi udført assay optimeringer bruger tre humane cellelinjer: den menneskelige monocytiske cellelinje THP-1 og den menneskelige colonepitelceller cellelinier HT-29 og SW480. Optimering inkluderet induktion parametre det inflammatoriske respons i celler behandlet med LPS eller LPS + IFNy og række ikke-cytotoksiske PEITC koncentrationer og eksponering varigheder. Information eksisterede ikke i litteraturen om PEITC effekter i SW480 og THP-1 celler. I den tidligere undersøgelse [12], blev 21 LPS-inducerede gener undertrykkes tre gange eller mere med 10 uM PEO (PEITC Essential Oil) sammenlignet med LPS-aktivering alene i RAW 264.7 mus makrofagceller. (PEO er PEITC opnået fra

Barbarea Verna

frø [15] Både PEO og kommercielt købt PEITC er sammensat af .. 95% ren PEITC I den aktuelle undersøgelse med THP-1, HT-29, og SW480 celler, vi medtaget to yderligere gener, MMP7 og MMP9, for i alt 23 endelige gener af interesse (GOI). PEITC undertrykt 9, 3, og 13 ud af de 23 gener i THP-1, HT-29, og SW480 celler (tabel 3). resultaterne viste også, at SW480-celler var de mest reagerer på IFNy-primet LPS induktion blandt de tre testede cellelinjer. de 13 gener nedreguleret af PEITC behandling i SW480-celler repræsenterer centrale cellulære forsvarsspillere inflammation og cancer. Derfor er alle efterfølgende genekspression blev udført under anvendelse af disse 13 gener i SW480-celler. de 10 gener, der blev screenet, men blev ikke induceret /udtrykkes i humane cellelinier behandles ikke yderligere i dette håndskrift. efter genekspression analyser , ændringer i histon modifikationer (H3K27me3, H3K9me2, og H3-Ac) i promotorregionerne af hver af disse 13 gener blev undersøgt. Vi observerede differentierede H3-ændringer i forhold til kontrol for kun seks ud af disse 13 gener, som diskuteres i detaljer i manuskriptet. Alle 13 gener, uanset om H3 ændringer blev observeret i deres promotorregioner i samarbejde med PEITC eksponering, er angivet i tabel 3.

Effekt af PEITC på tyktarmskræft (SW480) Cell Proliferation

Flere af de udvalgte gener observeret at være moduleret af PEITC i SW480-celler regulerer celleproliferation under carcinogenese (tabel 3). Derfor undersøgte vi, om PEITC havde en antagonistisk virkning på tumorcelleproliferation, fastslog, at PEITC svækkede levedygtighed i SW480-celler på en tids- og koncentrationsafhængig måde (figur 1A). Interessant, PEITC koncentrationer og eksponeringstider nødvendige for at standse cancerceller multiplikation er højere og længere, end hos de nødvendige for at inducere ændringer i kromatin kemi (figur 3, 4, 5, S1, S2, S3, S4, S5) og gen ekspression (figur 2, 6, S1, S2, S3, S4, S5). For koncentrationer under 80 uM, var nødvendig for at signifikant inducere celledød (figur 1) mindst 24 timers udsættelse. For de fleste af de resterende eksperimenter (figur 2, 3, 4, og 6), anvendte vi en PEITC eksponering af 5 timer ved eller under 15 uM. I figur 5 og S1, S2, S3, S4, S5, 10 uM PEITC blev anvendt på forskellige tidspunkter i SW480-celler i op til 18 timer af PEITC eksponeringstid. En 10 uM koncentration af PEITC signifikant påvirket cellelevedygtighed ved eller ud over 24 timer (figur 1A), og en DNA-fragmentering assay (figur 1B) afslørede, at de antiproliferative virkninger af PEITC kan skyldes apoptotiske opregulering som også fremgår af højere ekspression af caspase 3 og 8 (figur 1C). Fraværet af væsentlige ændringer i cellecyklus protein CyclinD1 (CCND1) angiver, at PEITC ikke direkte hæmmer cellens cyklus (figur 1C).

Modulation af Chemokiner ved PEITC i Human Colon Celler

kemokiner spiller en vigtig rolle i opretholdelsen af ​​inflammatoriske processer i tyktarmen. Produktion af kemokiner i tarmen etablerer en kemotaktisk gradient stand til at forøge migration af monocytter /makrofager, granulocytter og lymfocytter fra blodbanen gennem endothelet i både mucosa og submucosa i kroniske inflammatoriske tarmsygdomme (IBD) [29]. Tidligere observerede vi, at PEITC reduceret inflammation, udtømning af slimceller, og infiltration af inflammatoriske celler i muse mucosa og submucosa [12]. I den aktuelle undersøgelse blev koncentrationsafhængig PEITC-medieret dæmpning af mRNA-niveauer af fire proinflammatoriske chemokiner /cytokiner (CCL2, EFSR2, CXCL10, og IL8) observeret i SW480-celler (tabel 3, figur 2). Enkelte chip eksperimenter på disse chemokin promotorer afslørede hyper-trimethylation af H3 ved lysin 27 (øget H3K27me3 stater), der omgiver promotorområder IL8 og CCL2 og en yderligere formindsket acetylering omgiver promotorområder IL8 forbundet med 10 pM PEITC eksponering (tabel 3- 4, figur 3A og 4). Imidlertid blev en tidsafhængig omvendt korrelation observeret for H3K27me3 (repressive varemærke), men ikke H3-Ac med IL8 mRNA ekspressionsniveauer (tabel 4, figur S5). I tilfælde af CCL2, blev der observeret mRNA-niveauer og H3K27me3 stater at variere sammen, udelukker en potentiel årsagssammenhæng (tabel 4, figur S4). Selvom Polycomb undertrykkende kompleks 2 (PRC2) -catalyzing H3K27 trimethylation er involveret i cytokingen omprogrammering som respons på inflammatoriske stimuli [30], [31], den tilsyneladende selektivitet PEITC i forbindelse med histon modifikationer omgiver promotor- regioner af de målrettede kemokiner /cytokiner fører os til at tro, at PEITC er usandsynligt, at direkte påvirke PRC2.

PEITC Eksponering forstyrrer transkriptionsfaktor Aktiviteter i Human Colon Celler

de NFκBs og statistikker er to vigtige familier af transkriptionsfaktorer aktiveres som reaktion på en række stimuli til at regulere flere cellulære processer, herunder immunresponset og carcinogenese. De NFκBs og STAT’er har forskellige samt synergistiske virkninger på nedstrømseffektor geninduktionsblokerende [32]. Rolle NFKB i IBD [33] samt effekten af ​​PEITC på NFicB aktivitet [34], [35], [36], [37] er godt undersøgt. Her observerede vi PEITC-medieret ned- regulering af forskellige NFKB familiemedlemmer, nemlig NFκB1, NFκBiα og REL proteiner, der ikke tidligere er indberettet for SW480-celler (tabel 3, figur 2). Interessant nok blev en tidsafhængig stigning i H3K27me3 tilstand er forbundet med en tidsafhængig nedgang i NFκB1 ekspression i PEITC-eksponerede celler, hvilket tyder på potentiel epigenetisk regulering af NFκB1 som fortjener fremtidige validering (tabel 4, figur 3A, S1).