PLoS ONE: YAP /TEAD Co-Activator reguleret pluripotens og kemoresistens i ovariecancer Indledt Cells

Abstrakt

De seneste oplysninger tyder på, at nogle solide tumorer, herunder kræft i æggestokkene, indeholder forskellige populationer af stamceller, der er ansvarlige for tumor initiering, vækst, kemo-modstand, og gentagelse. Den Hippo vej har tiltrukket sig betydelig opmærksomhed og nogle forskere har fokuseret på YAP funktioner til at opretholde stemness og celledifferentiering. I denne undersøgelse, vi med succes isoleret kræft i æggestokkene initierende celler (OCICs) og demonstrerede YAP forfremmet selv-fornyelse af æggestokkræft igangsat celle (OCIC) gennem sin nedstrøms co-aktivator TEAD. YAP og TEAD familier var nødvendige for at opretholde ekspression af specifikke gener, der kan være involveret i OCICs ‘stemness og kemoresistens. Tilsammen vores data først viser, at YAP /TEAD co-aktivator reguleret æggestokkræft igangsat celle pluripotens og kemo-resistens. Den foreslog en ny mekanisme for resistens i cancer stamceller som Hippo-YAP signalvej kunne tjene som terapeutiske mål for ovariecancer behandling i klinisk

Henvisning:. Xia Y, Zhang YL, Yu C, Chang T , Fan HY (2014) YAP /TEAD Co-Activator Reguleret pluripotens og kemoresistens i ovariecancer Indledt Cells. PLoS ONE 9 (11): e109575. doi: 10,1371 /journal.pone.0109575

Redaktør: Hong Wanjin, Institut for Molekylær og Cell Biology, Biopolis, USA

Modtaget: Juni 21, 2014, Accepteret: September 1, 2014; Udgivet: November 4, 2014

Copyright: © 2014 Xia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81172473, 31371449), National Basic Research Program Kina (2011CB944504, 2012CB944403 ), og videnskabelig grundforskning Finansiering af Zhejiang University (2011QN81001). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den mest dødbringende af gynækologiske maligniteter, primært på grund af en mangel på tidlig påvisning, hvilket resulterer i de fleste patienter bliver diagnosticeret på et fremskredent stadium af denne sygdom [1], [2]. De mekanismer, der ligger til grund kræft lægemiddelresistens og tilbagefald er fortsat usikker. De seneste oplysninger tyder på, at nogle solide tumorer, herunder kræft i æggestokkene, indeholder forskellige populationer af stamceller, der er ansvarlige for tumor initiering, vækst, kemo-modstand, og tilbagefald [3] – [6]. Der er nogle mente, at kemoterapeutiske modstand ved kræft i æggestokkene skyldes primært, at der findes små bestande af kræft stamceller (CSCS).

Nogle undersøgelser rapporteret, at CSCS organiseret forankringsuafhængige, autonome, sfæriske strukturer [7] . Lignende strukturer blev observeret i ovariecancer patient ascites celler, som omfattede en lille delpopulation af tumor-formerings celler, der var i stand til at organisere i sfæroider. Det er kendt, kan detekteres høje ekspressionsniveauer af stamcellemarkører, såsom OLT 4, SOX-2, Nanog, og Notch-1, i CSCS [8]. Nogle celleoverflademarkører også kraftigt udtrykt af CSCS, herunder CD44, CD117, CD133 og [9], [10]. Det er godt accepteret, at cancerceller med høj CD44 og CD117 ekspressionen blive meget tumorigene og kan genoprette deres oprindelige tumor hierarki [11].

En stamcelle pulje, der omfatter cancer stamceller er også stramt reguleret af signalveje fra mikro-miljø i stamcelle niche. Blandt disse har Hippo vej tiltrukket sig betydelig opmærksomhed, og nogle forskere har fokuseret på YAP funktioner til at opretholde stemness og celledifferentiering [12], [13]. Ektopisk YAP udtryk forhindrer ES celledifferentiering

in vitro

og vedligeholder stamcelle-fænotype [14], [15]. Men til dato, TEAD familiemedlemmer, som er YAP downstream co-aktivatorer, har ikke undersøgt i cancer stamceller.

Nylige undersøgelser har vist, at samspillet mellem flere veje, herunder the Hedgehog [16], Wnt [17] – [19], MAPK [20], PI3K [21], og Hippo veje [22] – [24], var involveret i stamcelle pluripotens og regulering carcinogenese. Knockdown af Hippo pathway centrale komponenter påvirkede væv homeostase i fladorm

Macrostomum lignano

og forårsagede hyper-spredning af stamceller [12]. LATS2, en tumor suppressor kinase af Hippo pathway, post-transkriptionelt undertrykker human celle omprogrammering [25]. YAP er funktionelt vigtigt for tumor undertrykkende virkninger på LKB1, en opstrøms cancer suppressor i MAPK-vejen [26].

I denne undersøgelse har vi med succes isoleret stamcelle kugler fra muse tumorxenoplantater der blev afledt fra human ovarie cancerceller. Disse kugle-dannende celler blev stærkt tumorigene og kunne serielt forplanter sig med deres oprindelige tumor fænotyper. Baseret på denne forbedrede, reproducerbar tumorgenicitet, vi har udpeget disse kugle-dannende celler ovariecancer initierende celler (OCICs), i overensstemmelse med tidligere accepterede terminologi. Denne sub-population af kræftceller også havde forbedret OCICs ‘stemness og resistens gennem YAP /TEAD regulerer specifikke gener udtryk. Disse resultater understøttes nylige observationer, herunder vores egen, at YAP-TEADs bestemt ovariecancer malignitet niveauer og forudsat yderligere mekanistiske indsigt vedrørende roller YAP og TEADs i kræft i æggestokkene.

Materialer og metoder

kræft i æggestokkene initierende celle (OCIC) isolation og kultur

for at opnå OCICs, vi subkutant injicerede celler af kræft i æggestokkene cellelinje A2780 i nøgne mus (2 × 10

6 Cells per mus). Efter en tumor diameter nået omkring 1,5 cm (sædvanligvis ved fire uger efter injektionen) fjernede vi tumorvævet, skæres i små stykker, og fordøjet med collagenase at fremstille enkeltcellesuspensioner. Så de indsamlede enkeltceller blev dyrket i serumfrit DMEM-F12 (Invitrogen) suppleret med 5 pg /ml af insulin (Sigma), 20 ng /ml human rekombinant epidermal vækstfaktor (EGF; Invitrogen), 10 ng /ml basisk fibroblastvækstfaktor (b-FGF, Invitrogen), og 0,4% bovint serumalbumin (BSA; Sigma) i Ultra Low Attachment plader (Corning). OCICs og kontrolcellerne blev alle adskilt fra andre celler ved anvendelse kontinuerlig densitetsgradientcentrifugering. Kontrolcellerne blev også opnået ved at injicere A2780 celler i nøgne mus og separationsmetoder svarede til dem, der anvendes til OCICs. De blev dyrket i Ultra Low Attachment plader (Corning), og mediet var ens med OCICs bortset fra, at dyrkningsmediet inkluderet 10% føtalt bovint serum (FBS). Alle medier indeholdt penicillin (10 enheder /ml) og streptomycin (10 ng /ml) og celler blev dyrket i en fugtig inkubator ved 37 ° C med 5% CO

2. Medium blev ændret hver 3 dage.

Nude mus xenograftmodel

Mus blev behandlet i overensstemmelse med NIH Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr, der er godkendt af etiske komité i Zhejiang University. Mus blev opstaldet i en temperatur-kontrolleret rum med ordentlig mørke-lys cyklusser, fodret med en almindelig kost, og holdt under pleje af Laboratory Animal Unit, Zhejiang University, Kina. De ovariecancercelle-transplanterede nøgne mus blev injiceret 2 × 10

6 celler og undersøges dagligt i omkring tre uger. Efter tumor diameter nået til 1,5 cm, blev musene aflivet ved anvendelse af CO

2 inhalation metode før de aflives. For at vurdere OCIC tumorigen evne

in vivo

, sfæroider blev talt, resuspenderet i 100 pi PBS, og derefter injiceret subkutant i den venstre flanker af 4 uger gamle nøgne hunmus. Cell anvendte koncentrationer lå i området fra 10

4 til 10

5 i OCIC og kontrolgrupper og musene blev inddelt i to grupper og fire mus i hver undergruppe. Fra en uge efter injektion, blev der observeret indpodede mus dagligt for tumor masser og volumen. En mus blev humant aflivet, når en tumor diameter nåede 1,5 cm. Xenotransplantattumorer blev dissekeret ud, fikseret i 4% paraformaldehyd, indlejres i paraffin, og snit med en Leica rotationsmikrotom (5 um tykkelse). Snit blev anvendt til H Santa Cruz).

kemoterapimiddel følsomhed assays

Cell sfæroider blev dissocieret og podet ved 4.000 celler /brønd i 96- godt Ultra Low Attachment plade (Corning) og dyrket med serumfrit DMEM /F12 suppleret med vækstfaktorer. OCICs og styre ovariecancerceller blev behandlet med cisplatin (20 til 60 uM), taxol (2 til 20 uM), eller bleomycin (20 uM til 100 uM) i 48 timer. Efter dyrkning i 48 timer blev cellelevedygtighed vurderet under anvendelse af en celletælling kit-8 (Dojndo, Japan), ifølge producentens instruktioner. Celle overlevelsesrater blev defineret som procentdelen af ​​overlevende lægemiddelbehandlede celler divideret med ubehandlede kontrolceller. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt.

Kvantitativ PCR microarray analyse og real-time RT-PCR

human cancer Drug Resistance RT

2 Profiler PCR array (QIAGEN # 330.231) blev anvendt til bestemme udtrykket profiler af 84 gener involveret i kemoterapi regulering. Primere til 84 test gener og 5 husholdning gener (

B2M

,

Hprt1

,

Rpl13a

,

GAPDH

, og

ACTB

) blev inkluderet på hver plade med 96 brønde. En First Strand Kit (QIAGEN # 330.401) og SYBR Green qPCR Mastermix (QIAGEN # 330.500) var fra SABiosciences. qPCR blev udført ifølge producentens instruktioner (SABiosciences RT

2 Profiler PCR Array System) under anvendelse af en Bio-Rad CFX96TM Real-Time PCR enhed. Dataanalyse blev udført under anvendelse af online SABiosciences PCR Array dataanalyse, som beskrevet i producentens protokol.

sfæroide celler, differentierede sfæroide celler eller primære tumorceller blev anbragt i RNAase-free mikrorør. Total RNA-ekstraktion og revers transkription blev udført med RNAiso Plus og en Reverse Transcription Mix kit (Takala), ifølge producentens instruktioner. Totalt RNA (0,5 ug) blev vendt transkriberet under anvendelse af en cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). Real-time PCR reaktioner blev kørt under anvendelse af en CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). Hver cDNA prøve blev testet tredobbelt. For at kvantificere genekspression ændringer blev △△ Ct metoden til beregning relative fold-ændringer efter normalisering til

ACTB

(β-actin) mRNA-niveauer. De genspecifikke RT-PCR primersekvenser er vist i tabel S1.

proteinekstraktion og Western blotting-analyse

Celler blev lyseret med cellelyse-buffer (Beyotime), der omfattede en passende volumen af ​​en proteaseinhibitorcocktail (Roche). Totale proteiner blev separeret ved SDS-PAGE og derefter overført til polyvinylidenfluoridmembran (Milipore, USA). Ikke-specifikke bindingssteder blev blokeret med 5% skummetmælk i TBST ved stuetemperatur i 1 time. Efter sondering med primære antistoffer, blev membraner inkuberet med peberrod peroxidase-bundne anti-kanin-antistoffer (cellesignalering Technologies, Danvers, MA) og derefter vasket. Bundne antistoffer blev visualiseret under anvendelse af et forøget kemiluminescens Detection Kit (Amersham). De primære antistoffer var: anti-YAP, anti-Oct-4, anti-Notch-1, anti-actin, som alle var fra Cell Signaling Technology. En anti-TEAD1 (1:1000; 5178-1) antistof var fra Epitomics. Anti-TEAD2 (1:1000; LS-C119063) og anti-TEAD3 (1:1000; LS-C30406) antistoffer var fra Levetid Biosciences. Anti-TEAD4 (1:1000; ab97460) antistof var fra Abcam. Proteiner blev visualiseret ved anvendelse af en Dura Super Signal Substrat (Millipore, USA).

Statistisk analyse

Alle assays blev udført tre gange. GraphPad Prism-software (GraphPad Prism, San Diego, CA) blev anvendt til at sammenligne gruppere resultaterne efter Chi-square test eller ANOVA, som er relevant. Forskelle blev betragtet som signifikante for p. 0,05

Resultater

Ovariecancerpatienter indledt sfærer har kræft stamceller egenskaber

Primære ovariecancerceller blev dissocieret og placeret i ubestrøget dyrkningskolber i serumfrit medium suppleret med EGF, b-FGF, insulin og BSA. Efter en uge i kultur, blev der observeret ikke-adhærente sfæriske klynger af celler i bunden af ​​disse kolber. Til en måned senere blev kugler med øgede størrelser klart observeret (fig. 1A). Normalt 5 × 10

6~1 × 10

7 fordøjet xenograft celler blev sat i kultur, og ca. 2-4% af dem blev konverteret til OCICs under serum berøvet betingelser. Real-time RT-PCR og Western blotting Resultaterne viste, at stamcellemarkører OLT-4, SOX-2, Nestin, Notch-1, og Nanog blev alle stærkt udtrykt af disse celler i kugler (fig. 1B).

A: Billeder af ikke-klæbende sfæriske celleklynger afledt fra dyrkede primære æggestokkene cancerceller. Scale barer = 100 um. B: Western blotting og real-time RT-PCR resultater, der viser øget ekspression af de angivne gener i OCICs. Relative mRNA-niveauer blev bestemt ved at normalisere til endogene p-actin mRNA-niveauer (anvendt som en intern kontrol) ved hjælp af Microsoft Excel. For hver angivet gen, blev den relative transkript niveau af kontrolprøven (venstre søjle af hvert graf) fastsat til 1. De relative transkriptniveauer i andre prøver blev sammenlignet med kontrollen, og fold-changes er vist i grafen. C-D: Repræsentative immunfluorescensfarvning resultater for CA125, CK7, CD44, og CD117 ekspressionen i udifferentierede og differentierede OCICs. Kerner blev farvet med DAPI. Scale bar = 100 uM for alle paneler.

Næste, vi undersøgte, om disse kugle celler havde forankringsuafhængig selvfornyelse. Vi dyrket sphæroider i 14 dage under differentiere betingelser (vækstfaktorer trukket tilbage og mellemstore, som indeholdt 10% FBS). De sfæroide celler ændret fra flydende celler til adhærente celler, erhvervet en epitelial morfologi, og dannede CA125 og CK-7-positive symmetriske kolonier (fig. 1C). (CA125 og CK-7 er veletablerede celleoverflademarkører af differentierede epiteliale ovariecancerceller.) Desuden blev de tidligere rapporterede celleoverflademarkører af ovarieepitelceller stamceller, CD44 og CD117, udtrykt i meget højere niveauer i sfære celler end i differentierede flade celler (Fig.1D). Salg

Sphere-dannende celler er stærkt tumorigene

Vi undersøgte, om disse identificerede sfære-dannende celler blev så stærkt tumorigene som andre rapporterede epitelcancer initierende celler. Sammenlignelige antal sfære celler og kontrolceller blev subkutant injiceret i flankerne af nøgne mus. Efter to uger senere blev tumorer fundet i tre af fire athymiske nøgne mus, der var blevet injiceret med 10

4 sfære celler. Imidlertid blev tumorer ikke fundet i mus, der var blevet injiceret med differentierede ovarietumorceller, selv ved 10

5 celler pr indpodning (fig. 2A). Cellekoncentration er vist i fig. 2A er 10

4 pr mus og andre koncentrationer resultater er ikke blevet vist

A:. Billeder af nøgne mus viser xenotransplantat æggestokkene tumor dannelse efter injektion OCIC sfærer. Cell koncentrationer anvendt 10

4 i hver gruppe. B: H 0,01, sammenlignet med den tilsvarende kontrolgruppe. **, P 0,001, sammenlignet med den tilsvarende kontrolgruppe. B. Survival satser OCICs med eller uden

Yap

Tead1 /3/4

knockdown efter behandling med CDDP, taxol eller bleomycin ved de angivne koncentrationer i 48 timer. ns, ikke signifikant; *, P 0,01; **, P 0,001. C-D: Real-time RT-PCR-resultater viser, at de angivne gener blev udtrykt i OCICs på højere niveauer end i primære ovariecancerceller (C). Indiceret gener ‘ekspressionsniveauerne i OCICs var signifikant nedreguleret med

Yap

Tead1 /3/4

RNAi (D). *, P 0,01; **, P 0,001. E. Western blotting resultater for AKT og Pakt niveauer i OCICs med eller uden

Yap /Tead1 /3/4

shRNA behandling.

YAP opregulerer GSK3A og ABCB1 udtryk at styrke OCICs ‘resistens

for at bestemme resistente gener involveret i regulering OCICs, brugte vi drug-resistente gen microarray analyse for OCICs og identificerede flere formodede kemoresistens-relaterede gener, der var stærkt udtrykt i OCICs. En oversigt synopsis af deres microarray resultater med de respektive fold ændringer blev givet i tabel S1. Det stof-resistens-gener ABCB1, ABCC1 GSK3A, havde signifikant højere ekspressionsniveauer i OCICs end i primære ovariecancerceller (fig. 5C). Vi undersøges yderligere, hvis disse gener blev reguleret af YAP-TEADs i OCICs. Blandt disse gener, ABCB1 og GSK3A var signifikant nedreguleret i

Yap /TEAD

-depleted OCICs, mens ABCC1 udtryk ikke var væsentligt påvirket (fig. 5D).

Desuden

Gsk3a

,

GSK3b

og

p53

genekspression blev også påvist i OCICs (fig. 5C). Blandt disse,

Gsk3a

og

p53

blev bemærkelsesværdigt nedreguleret i

Yap /TEAD

-depleted OCICs og

GSK3b

ændret sig lidt (fig. 5D ). Disse resultater antydede, at YAP og TEADs forbedrede OCICs ‘resistens ved op- og nedregulere de gener, der er involveret i stofskiftet narkotika og celleoverlevelse.

PI3K signalvejen er kendt for at samarbejde med Hippo vej til at regulere celle vækst og proliferation [28]. Phosphorylerede AKT niveauer var høje i OCICs og faldt med

Yap

og /eller

Tead1 /3/4

udtynding. Interessant, blev de samlede AKT niveauer også nedreguleret i

Yap /Tead1 /3/4

co-udtømte OCICs. Disse resultater viste også, at YAP /TEADs var nødvendige for at opretholde PI3K /AKT-vejen aktivitet i OCICs (fig. 5E).

MAPK pathway gener er involveret i YAP opretholdt OCIC pluripotens

Resultaterne af qPCR microarray analyse (tabel S2) viste, at adskillige gener involveret i MAPK veje, herunder

c-Fos

,

EGFr

, og

Igf2r

, havde højere ekspressionsniveauerne i OCICs end i primære ovariecancerceller (fig. 6A). Deres udtryk blev nedreguleret efter

Yap

Tead1 /3/4

shRNA behandling (fig. 6B). Fordi c-Jun og c-fos danne AP-1-komplekset og funktion sammen undersøgte vi

c-Jun

genekspression i disse prøver og fundet lignende resultater (fig. 6A-B).

EGFr

Igf2r

gener koder for epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) og insulin-lignende vækstfaktor 2 receptor (IGF2R), hhv. Det er vigtige cellemembranreceptorer der sender vigtige ekstracellulære signaler til kernen ved at aktivere MAP-kinase kaskader. Phosphorylerede og aktiverede MAP-kinaser translokerer fra cytoplasmaet til cellekernen at mediere c-fos og c-jun-transkription aktivering. Nogle undersøgelser har vist, at YAP reguleret TEAD gener til opregulere

Areg

gen, som interagerer med EGF /TGF-alfa-receptor at fremme væksten af ​​normale epitelceller [29], [30]. Således er vores resultater foreslået, at disse gener i MAPK veje kan være involveret i YAP opretholdt OCIC pluripotens.

A. Real-time RT-PCR resultater, der viser, at de angivne gener blev udtrykt i OCICs i højere niveauer end i primære ovariecancerceller (kontrol). B. Real-time RT-PCR-resultater viser, at de angivne gener ‘ekspressionsniveauerne var signifikant nedreguleret i OCICs med

Yap

/

Tead1 /3/4

RNAi.

diskussion

Tumor forekomst og progression er tæt knyttet til unormal somatiske celler udvikling og differentiering. Der er et lille antal specifikke celler eller såkaldte stamcelle i vores krop inkluderet ovarievæv, der er i stand til selvfornyelse og retningsbestemt differentiering [31] – [33]. Som en del af disse celler, har cancer stamceller nylig tiltrukket sig opmærksomhed. En tidligere undersøgelse viste, at en meget mindre kræft stamceller befolkning faktisk eksisteret i nogle kræft væv, som igangsatte udviklingen af ​​kræftceller og var relateret til stamceller ejendomsvedligeholdelse, tumorgenese, ondartet metastase, og tilbagefald [34]. Cancerstamceller har flere vigtige funktioner, inkluderet klon dannelse kapacitet, ekspressionen af ​​stamcelle markører og specifikke celleoverflademarkører, celledifferentiering og morfologiske identifikation og stærk tumorigen evne.

I denne undersøgelse har vi med succes isoleret ovarie cancer stamceller-lignende celler fra tumorbærende mus og påviste, at disse celler havde cancer stamceller egenskaber beskrevet ovenfor. Efter omkring en måned i kultur, OCICs dannet klynger, der indeholdt mange celler og havde en diameter på op til 500 um. OCICs ikke blot havde stærke klonogene evne, men også udtrykte kræft stamceller markører ved høje niveauer. Celledifferentieringsfaktorer Resultaterne viste, at sfæroiderne vi isoleret faktisk havde karakter af epitelial ovariecancer. De tumorigene satser for disse OCICs var betydeligt højere end de primære ovariecancerceller og disse data er ikke vist i figur 2.

Mange signalveje, såsom Wnt, PI3K, MAPK signalveje, har været rapporteret at være tæt forbundet med stamceller og Hippo vej [18], [19]. Den Hippo vej har også modtaget betydelig opmærksomhed med hensyn til at dæmme mekanismer celle regulering og tumorigenese [23], [35], [36]. Nogle undersøgelser viser, at YAP genet reguleres epitel stamcelle reparation og intestinal stamcelle og hæmatopoietisk stamcelle funktion [37] – [40]. Tumor-formerings celler og aktivitet bidrog til lunge tumor progression og metastase i CD24-afhængige og Yap /Taz-afhængige veje [41]. YAP blev inhiberet af catenin under epidermal stamcelleproliferation og hudkræft udvikling via Wnt signalvejen [42]. I modsætning hertil YAP begrænset Wnt-signaler i løbet af tarm regenerering. I vores undersøgelse, AKT og MAPK phosphoryleringsniveauerne var dramatisk højere ekspression ikke kun i OCIC tumorvæv, men også i OCICs.

Transgen ekspression af YAP reduceret Wnt målgenekspression og resulterede i det hurtige tab af intestinale krypter. Desuden et tab af YAP resulterede i hyperplasi og udvidelsen af ​​intestinale stamceller (HTT) og niche celler [38].