PLoS ONE: En observationsstudie af cirkulerende tumorceller og 18F-FDG PET Optagelse i patienter med behandling-Naive Ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Introduktion

Vi undersøgte forholdet mellem cirkulerende tumorceller (CTCs) i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) med tumor glucosemetabolisme som defineret af

18F-fluorodeoxyglukose (FDG) optagelse, da begge har været forbundet med patientens prognose.

Materialer Metoder

Vi udførte en retrospektiv skærm af patienter på fire medicinske centre, som gennemgik FDG PET-CT scanning og tapning forud for en terapeutisk intervention for NSCLC. Vi brugte en epitelcelle adhæsionsmolekyle (EpCAM) uafhængig væske biopsi baseret på cellemorfologi for CTC påvisning og tælling (her defineret som High Definition CTCs eller “HD-CTCs”). Vi derefter korreleret HD-CTCs med kvantitative FDG optagelse billeddata kalibreret tværs centre i en tværgående analyse.

Resultater

Vi vurderede halvfjerds-én NSCLC patienter, hvis median tumorstørrelse var 2,8 cm ( interkvartile område, IQR, 2,0-3,6) og median maksimal standardiseret optagelse værdi (SUV

max) var 7,2 (IQR 3,7-15,5). Mere end 2 HD-CTCs blev påvist i 63% af patienterne, også på tværs af alle stadier (45 af 71) eller i trin I-sygdom (27 af 43). HD-CTCs blev svagt korreleret med delvis volumen korrigeret tumor SUV

max (r = 0,27, p-værdi = 0,03) og ikke korreleret med tumor diameter (r = 0,07; p-værdi = 0,60). For en given delvis volumen korrigeret SUV

max eller tumor diameter der var en bred vifte af detekteret HD-CTCs i omløb i både tidlige og sene stadie sygdommen.

opdages Konklusioner

CTCs ofte i den tidlige fase NSCLC anvendelse af et ikke-EpCAM medieret tilgang med en lang række bemærket for et givet niveau af FDG-optagelse eller tumorstørrelse. Integration potentielt komplementære biomarkører som disse med traditionelle patientdata i sidste ende kan øge vores forståelse af klinisk,

in vivo

tumor biologi i de tidlige stadier af denne dødelige sygdom

Henvisning:. Nair VS, Keu KV , Lüttgen MS, Kolatkar A, Vasanawala M, Kuschner W, et al. (2013) Et observationsstudie af cirkulerende tumorceller og

18F-FDG PET Optagelse i patienter med behandling-Naive Ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 8 (7): e67733. doi: 10,1371 /journal.pone.0067733

Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center på Dallas, USA

Modtaget: Marts 13, 2013; Accepteret: 22 maj 2013; Udgivet: 5 jul 2013

Copyright: © 2013 Nair et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. VSN var finansieret af National Institutes of Health (NIH) T32 NHLBI uddannelse tilskud (HL007948), Lung Cancer Research Foundation og LUNGevity Foundation. KVK blev understøttet af en Faculté de Médecine et des Sciences de la Santé de l’Université de Sherbrooke SMV Research Fellow Scholarship. Dette håndskrift blev støttet af Award nummer U54CA143906 fra National Cancer Institute. Finansiering af Dr. Gambhir vedrørende dette projekt blev leveret gennem NCI ICMIC P50CA114747, NCI CCNE-TR U54 CA119367, CCNE-T U54 CA151459, Doris Duke Foundation, og De Kanariske Foundation. Database støtte til dette projekt blev leveret af The Stanford Center for Klinisk og Translationel uddannelse og forskning gennem NIH /NCRR give UL1 RR025744. Indholdet offentliggjort her er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Cancer Institute eller National Institutes of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesse. Peter Kuhn, Kelly Bethel, og Jorge Nieva har en ejerandel i Epic Sciences, som har licens HD-CTC teknologi, der anvendes i denne undersøgelse. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

To af de mest aktive områder undersøgelsesudvalg i kræftforskningen i dag er fokuseret på formodede cirkulerende tumorceller (CTCs), der er frigivet fra moderselskabet svulst i blod [1] og molekylær billeddannelse agenter, der kan definere tumor biologi

in vivo

[2]. Dette er drevet delvist af den overbevisning, at begge disse teknologier er potentielt robust, omkostningseffektiv og let translaterbare til klinikken med en minimal risiko for patienten.

18F-fluor-2-deoxy –

D

glucose (FDG) PET er i øjeblikket den eneste udbredte molekylær billeddannelse agent klinisk, og det udnytter glukosemetabolismen at fange et øjebliksbillede af uforstyrrede tumor biologi på diagnose [3], [4]. Mens mange studier har vurderet [5], om intensiteten af ​​FDG optagelse kan vedrøre en tumor metastatisk potentiale via Warburg Effect og forstyrret cellulære bioenergetik [6] -. [9], mekanismen for denne forening er stadig dårligt forstået

Aktuelle teorier for, hvordan mekanismen “frø og jord” af tumor metastase sker posit at CTCs først skal underkastes en epitelial-til-mesenkymale overgang (EMT) for frigivelse efterfulgt af en mesenchymal-til-epitel (MET) overgang til metastatisk aflejring i et passende miljø [10] – [13]. Da tumor glukosemetabolismen er drevet af Warburg Effect, hvor afvigende aerob glykolyse bliver evolutionært fordelagtige [14], den initiativtagende begivenheder metastatisk formering kan delvist vedrører mere hurtigt delende tumorer, der har øget FDG optagelse på PET [15].

Hvordan CTCs associeret med tumor glukosemetabolismen stort set uudforsket klinisk. For at undersøge dette spørgsmål, rapporterer vi om korrelationen af ​​cirkulerende tumorceller bruger en ikke-EpCAM baserede CTC assay med standardiserede, semikvantitativ, tumor FDG uptake målinger i patienter, der gennemgår evaluering til behandling-naive ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Salg

Materialer og Metoder

Study design

Det var et multicenter, tværgående analyse af eksisterende data fra igangværende observationsstudier. Data blev indhentet retrospektivt fra patienter med NSCLC af alle stadier (American fælles udvalg om kræft, 7. udgave) [16], der undergik FDG PET-CT scanning og CTC-analyse fra et perifert blod uafgjort mellem oktober 2009 og maj 2012. Vi inkluderede patienter med NSCLC, der havde FDG PET-CT-billeder erhverves sammen med en CTC prøve inden for 90 dage og forud for et kirurgisk, medicinsk eller kombinationsbehandling. Emner, som gennemgik en biopsi inden indskrivning fik også lov til at deltage

Patienter blev indskrevet efter hinanden på fire steder:. Stanford University Medical Center (SUMC); Den Veterans Affairs Palo Alto Health Care System (VAPAHCS); University of California San Diego Moores Cancer Center (UCSD); og Billings Clinic (Billings) (Supplerende Fil 1, S Figur 1). Patienter med SUMC og VAPAHCS var indskrevet på tidspunktet for FDG PET-CT som en del af en formel tidlig påvisning studie undersøger cirkulerende biomarkører og billedbehandling, og patienter på UCSD og Billings med ethvert stadium af sygdommen var støtteberettigede, hvis de mødte inklusionskriterierne. Tapning blev udført ved anvendelse af standardteknikker, og prøver blev behandlet på The Scripps Research Institute (TSRI) inden for 48 timer efter tapning (median tid = 23 timer) [17]. Medicinske diagrammer blev revideret til at udtrække patient demografiske, kliniske, billedbehandling og information behandling af samarbejde forskerteam på hver respektive sted. Stanford University, Billings Klinik og Scripps Research Institute Institutional Review Boards (interne metoder) godkendt alt arbejde præsenteres i denne undersøgelse på deres respektive sites. Fuldt informeret, blev skriftligt samtykke patient opnået inden tilmelding efter gennemgang af undersøgelsen protokol dokumenter. HD-CTC-resultater for ni patienter inkluderet for denne CTC-imaging korrelationsundersøgelse tidligere er blevet offentliggjort [18].

Et repræsentativt billede af High Definition Cirkulerende tumorceller (HD-CTCs) fra en Stanford patient med stadie I ikke-småcellet lungekræft vist i komposit immunofluorescens (A) og ved Wright-Giemsa lysfeltmikroskopi (B). HD-CTCs karakteriseres som 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) positivt med en kerne, der er større end omgivende hvide blodlegemer (Blå, C), cytokeratin (CK) positive (rød, D) og CD45 leukocyt markør negativ (Green, E).

Cirkulerende Tumor Cell Analysis

Vi anvendte en ikke-EpCAM baseret, immunfluorescerende, morfologisk tilgang til kvantificering CTCs som tidligere beskrevet (figur 1) [ ,,,0],17] – [20]. CTCs blev identificeret ved immunfluorescens (et panel af cytokeratiner, DAPI, CD45) med automatiseret morfometrisk analyse efterfulgt af manuel validering af en patolog-uddannet tekniker (MSL). Den teknikeren, mikroskoper og automatiseret billedbehandlingssystem var konstant gennem hele undersøgelsen. Vi opsummerer fremgangsmåderne [17] her for fuldstændighedens.

Seks til 10 ml fuldblod opsamlet i cellefrie DNA BCT ™ (Streck, Omaha, NE) blev underkastet lyse af røde blodlegemer ved stuetemperatur, centrifugeret, og den resulterende cellulære pellet blev resuspenderet og vedlagt som et monolag til specialdesignet, objektglas. Fire objektglas blev behandlet for at sikre tilstrækkelig prøve til analyse, sædvanligvis repræsenterer 1-2 ml helblod. Fremstillede prøver blev opbevaret ved -80 ° C indtil videre til det farvningsprotokollen og analyse. Optøede objektglas blev fikseret, permeabiliseret og derefter inkuberet med et monoklonalt anti-cytokeratin (epitelcelle markør) antistof rettet mod humane cytokeratiner (CK) 1, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 18 og 19 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); en AlexaFluor® 555 konjugeret ged anti-mus sekundært antistof (Life Technologies, Carlsbad, CA); et monoklonalt antistof rettet mod CD45 direkte konjugeret til et AlexaFluor® 647 farvestof (ABD Serotec, Oxford, UK); og en nuklear kontrastfarve på 0,5 g /ml 4,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (Life Technologies, Carlsbad, CA).

Alle fire dias, der tilsammen omfattede en “test”, blev scannet i deres helhed af en automatiseret fluorescerende mikroskop. Kandidat cellulære begivenheder blev manuelt klassificeret som

High Definition CTCs (HD-CTCs

), hvis de var CK positive, CD45 negativ, indeholdt en intakt DAPI positiv kerne uden identificerbare apoptotiske ændringer eller en forstyrret udseende, og var morfologisk forskellig fra omgivende hvide blodlegemer (WBCs). HD-CTC tælling blev bestemt ud fra fire-diassæt med det mål at analysere en total blodvolumen belagte indeholdende 1 x 10

7 kerneholdige celler pr prøve. WBC tællinger af helblod bestemmes automatisk (WBC system HemoCue®, Cypress, CA) og antallet af kerneholdige celler påvises ved assayet pr glideren (via DAPI og CD45-farvning) blev anvendt til at beregne den ækvivalente mængde blod analyseret pr slide . Denne væske biopsi platform undgår også kassere andre unormale celler med nogle HD-CTC egenskaber, der ikke fuldt ud opfylder inklusionskriterier (såsom apoptotiske legemer) og digitalt kataloger dem til efterfølgende analyse.

HD-CTC klynger for denne undersøgelse blev identificeret som tidligere [21] beskrevet, og blev optalt fra rumlige grupperinger og derefter karakteriseret som samlede antal klynger. Klynger blev defineret som mindst to HD-CTC celler med cytoplasma i kontakt med hinanden ved visuel inspektion under celletælling. Vi analyserede HD-CTCs på en kontinuerlig række skala standardiseret pr 10 millioner WBCs (benævnt HD-CTC /10M WBC) og de samlede HD-CTC klynger per prøve. Vi rapporterer også om HD-CTCs standardiseret pr blodvolumen som HD-CTC /mL til sammenligning med andre eksisterende platforme og for at lette fortolkning. For at kalibrere HD-CTC test blev prøver analyseret for andre kræft i lungerne (ikke-NSCLC) og til dokumenterede godartede knuder i lungerne ved biopsi, kirurgi eller klinisk opfølgning. Vigtigere, analyse af alle prøver (ML) blev udført blindet til diagnose for at fjerne enhver mulig fortolkning bias.

HD-CTC analysens reproducerbarhed

HD-CTC-analysen blev teknisk valideret med cellelinie spiking eksperimenter for at nå frem til en R

2 = 0,9997 om linearitet test som tidligere rapporteret [17]. Disse forsøg blev udført under anvendelse af SKBR3-cellelinier og fra 0 til 3 x 10

2 celler pr ml normal donor kontrol blod. Variationskoefficienten (CV) for denne analyse er 16%, og inter-processor korrelation er R

2 = 0,979. Prøveforberedelse proces følger standardprocedurer for patientprøver gennem en stregkode system til alle forbrugsstoffer og instrumentering. Alle off-the-shelf instrumentering er kalibreret i overensstemmelse med producentens anbefalinger og alle brugerdefinerede instrumentering er kalibreret i overensstemmelse med de tekniske validering protokoller, der er etableret under idriftsættelsen.

FDG PET-CT Acquisition

Generelt FDG PET-CT erhvervelse blev udført for fastende patient (minimum seks timer) efter en injektion af 444-555 MBq

18F-FDG, evaluering af patientens glukose niveau, og et sporstof optagelse periode på 60-90 minutter før billeddannelse. Bestilt delmængde forventning maksimering (OSEM) genopbygning med CT svækket-korrektion blev udført på PET data på alle centre og detaljerede imaging protokoller for hvert center er tilgængelige i supplerende File 1, tabel S1. Semi-kvantitative værdier (maksimal standardiseret optagelse værdi, SUV

max) blev udvundet fra FDG PET-CT-billeder ved hjælp af et område af interesse trækkes over tumoren ved tolkning læge for yderligere analyse for hver institutions kliniske protokoller. For de tilfælde, hvor SUV

max blev ikke rapporteret ved diktat, blev tilgængelige billeder gennemgået af samarbejdende forsker ved hver institution (KVK på SUMC, MV på PAVAHCS, CH på UCSD og JN på Billings) til at udtrække værdien.

Phantom Protocol

Delvis volumen korrektion (PVC) [22] blev anvendt til SUV

max ved hjælp af data, der er erhvervet fra en menneskelignende thorax fantom, der blev scannet på hver deltagende stedet (Supplerende File 1 , Figur S2). Kort fortalt et fantom, der består af en mock mediastinal pool, to lunger og “tumor” sfærer spænder fra 0,4 cm til 3,1 cm med kendte og identiske FDG koncentrationer efterligner tumor intervaller i menneskelig, blev scannet på hver deltagende center ved hjælp af sin kliniske protokol. Erhvervede billeder blev rekonstrueret ved hjælp af deltagende center algoritme og derefter et opsving koefficient (RC) blev genereret i overensstemmelse med tidligere metoder [22]. Denne RC-kurve blev anvendt til at korrigere for partielle mængde effekter. Vi betegner de korrigerede funktioner i denne undersøgelse med en “PVC” sænket til forskel (dvs. PVC SUV

max betegnes som SUV

maxPVC). Endelig brugte vi denne kurve til at bestemme, hvor godt scannere blev kalibreret tværs centre (Supplerende File 1 Figur S3).

FDG PET-CT Optagelse Egenskaber

FDG uptake funktioner blev udvundet ved hjælp af en tre- dimensionelle område af interesse (ROI) i løbet af den primære tumor på en GE Healthcare AW Workstation, v4.5 på SUMC med PET VCAR ™ gennemførelse (figur 2). PET-VCAR ™ er en softwareplatform, som GE Healthcare med funktionen anmærkninger til rådighed som et add-on til GE arbejdsstationer. [23] Vi re-udvundet SUV

max fra den rå Digital Imaging i meddelelsen of Medicine (DICOM) filer for hver institution for at verificere den kliniske fortolkning af SUV

max ved hvert sted og for at sikre reproducerbarhed. Tumor SUV

maxPVC blev beregnet efter udvinding baggrund FDG lunge optagelse og brug af RC fantom data (Supplerende fil 1, SMethods og tabel S2).

En tredimensionel, maksimal intensitet projektion, hele kroppen

18F -FDG PET-CT (til venstre). Fysiologisk optagelse ses i hjernen, hjertet og leveren med udskillelse gennem nyrebækkenet og blære. Denne tumor viste en intens FDG optagelse med SUV

max på 19, SUV

betyder på 9,6, og TLG af 65,6 ved hjælp af en 50% SUV

max tærskel (øverst til højre). På CT blev læsionen volumen anslået til 6,0 cm

3 med en maksimal diameter på 22 mm (nederst til højre).

FDG PET-CT Volumetrisk Analyse

Da vi var interesserede i at bestemme, hvor alt Læsion Glycolysis (TLG, her defineret som SUV

betyder x metaboliske tumor volumen) [24] korreleret med HD-CTCs sammenlignet med anatomisk tumor volumen på CT del af FDG PET-CT undersøgelse, vi brugte PET-VCAR ™ til segment og beregne mængder fra PET og CT-billeder. For PET billeder, denne grænse havde en standardindstilling på 50%, og det repræsenterede signal drop-off, der afgrænses regionen voksende algoritme til at definere FDG optagelse. For de tilfælde, hvor denne segmentering ikke præcist repræsenterer tumoren, blev en tærskel manuelt optimeret til fuldt ud at fange FDG aktivitet ved hjælp af co-registrerede CT billede. Anatomisk tumor diameter og volumen blev taget til fange af CT billedet ved visuel inspektion. Notatet blev den fortolkende læge (KVK) blindet til HD-CTC resultater.

Statistisk analyse

Beskrivende statistik for kliniske, billedbehandling og patologiske variabler blev bestemt ved hjælp af median og interkvartile område (IQR ) eller nummer med procent efter behov. Forskelle på tværs af centre blev vurderet af ANOVA for kontinuerlige variabler ved hjælp af Tukey test, en Chi-squared og Fishers eksakte test for kategoriske variable er relevant, og en Kruskal-Wallis test for ordinale variabler. Normalitet for variabler i modellering blev formelt testet ved hjælp af Kolmogorov-Smirnov-metoden. HD-CTC tællinger blev korreleret med FDG-optagelse under anvendelse af et Spearman rank test for at tage højde for den ikke-parametriske fordeling af de underliggende variable. Log-normaliseret billedbehandling og HD-CTC målinger blev også sammenlignet ved hjælp af Spearman rank og Kendall s Tau korrelationer til at vurdere sammenhængen. For yderligere analyser, vi definerede en FDG ivrig tumor som en med en SUV

max ≥2.5, da dette er en klinisk relevant forskel [25], og ikke-metastatiske tumorer som enhver T etape svulst uden ledsagende satellit læsioner, nodal eller fjernmetastaser, ifølge de seneste AJCC 7.0 retningslinjer.

statistiske analyser blev udført ved hjælp af Excel ™ (Excel til Mac 2010, Seattle, WA) og SAS Enterprise guide ™ (v4.3, Cary, NC) .

Resultater

af 153 patienter undersøgt på tværs af de fire steder, der er involveret i denne undersøgelse (Supplerende Fil 1, figur S1), halvfjerds-én patienter var i sidste ende er berettiget til analyse, og 62 af disse patienter havde rå imaging (DICOM) filer til rådighed for mere detaljeret billede feature extraction (tabel 1). Den mediane alder for kohorten var 71 år (spændvidde 44-96 år), 59% var mandlige køn, og de fleste patienter var hvide (73%). Fyrre-tre patienter havde stadium I-sygdom, 5 havde stadie II, og 23 havde stadie III-IV NSCLC, med median primær tumor diameter er 2,8 cm (IQR 2,0-3,7 cm).

median tid fra PET til HD-CTC uafgjort var 1 dag (IQR 0-14 dage, der spænder fra 24 før PET til 84 dage efter) og en median på 1,23 ml blod (IQR 0,95-1,55) omfattede en test for HD-CTC analyse per prøve. Fyrre-fire patienter (62%) havde en biopsi af den primære tumor i løbet af deres oparbejdning og 27 (38%) af disse biopsier var før HD-CTC uafgjort, men kun to var inden 7 dage-og ingen var inden for 24 timer-HD-CTC sampling. Prøverne blev sædvanligvis behandlet inden for en dag af tapning (interval 17-43 timer). Lokaliseret NSCLC dominerede på SUMC og PAVAHCS, mens Billings og UCSD tilmeldt flere lokalt avancerede og metastatisk patienter (tabel 1).

Sixty-to rå billede (DICOM) filer var tilgængelige for kvantitativ billedanalyse, og 40 af 71 tumorer kræves PVC justering baseret på fantom undersøgelser. Inter-scan variation på tværs af disse fire centre var inden indberettede skøn (Supplerende fil 1, figur S3) [26]. Fireogtyve af 62 billeder (39%) krævede manuel overstyring til automatiseret tumor segmentering, og denne overstyring tærskel varierede fra 45% til 70% i forhold til standard på 50%. Otte billeder blev manuelt segmenteret som vi kunne ikke tærskel dem ordentligt. Rapporteret median primær tumor SUV

max var 7,2 (IQR 3,7-15,5) og aftalt godt med udtrukne værdier fra DICOM-filer (Supplerende Fil 1, tabel S2), mens SUV

maxPVC var lidt højere end den ukorrigerede metriske (8,8 , IQR 4,5-16,8).

Fire ikke-NSCLC, metastatiske knuder havde en række 0,0-2,2 HD-CTCs /10 M WBC (0-1,9 HD-CTCs /ml), mens vi har registreret en lignende vifte af 0,0-2,2 HD-CTCs /10 M WBC fire godartede knuder (0-0,8 HD-CTCs /ml). Vi valgte derfor en tærskel på 2,2 HD-CTCs /10 M WBC ( 1,9 HD-CTCs /ml) til yderligere analyse. Notatet blev der ikke CTC klynger påvist i nogen af ​​disse grupper.

Rækken af ​​HD-CTCs /10 M WBC for NSCLC patienter opdages tværs centre varierede 0-779 for alle TNM stadier og fra 0 til 695 i de 43 patienter med stadium i-sygdom, som var magen til optælles HD-CTCs /ml (tabel 1). Større end 2,2 HD-CTCs /10 M WBC blev påvist i 45/71 (63%) patienter med alle TNM stadier og 27/43 (63%) patienter med kun stadium I-sygdom. For opregnet HD-CTCs /ml, 61% (43/71) af alle TNM stadier og 60% (26/43) af fase I-patienter havde mere end 2 HD-CTCs /mL. For alle TNM faser, 33/71 patienter (46%, median = 5, IQR 2-6) og 21/43 patienter med stadium I sygdom (49%, median = 6, IQR 2-10) havde mindst én HD- CTC klynge opdaget.

Maksimal tumor FDG optagelse, både ukorrigeret (SUV

max) og korrigeret for tumorstørrelse (SUV

maxPVC), var signifikant forskellig blandt stadie i-IV NSCLC (p-værdi = 0,004 og 0,03 henholdsvis). Dette var også tilfældet for histologisk type, med skællede histologi har højere værdier end typebestemt ikke-småcellet lungekræft eller adenocarcinom (p-værdi = 0,0008 og 0,002 for SUV

max og SUV

henholdsvis maxPVC). I modsætning til dette, HD-CTC-numre, hvad enten pr 10 M WBC, ml eller optalt ved klynge tæller-ikke variere betydeligt ved TNM stadie gruppering (p-værdi = 0,64, 0,60 og 0,78 henholdsvis) eller ved histologisk type (p- værdi = 0,97, 0,96 og 0,90 henholdsvis).

HD-CTCs, pr 10 M WBC, ml eller med total klynger, korrelerede ikke med tumor diameter målt ved CT (mm) eller med ekstraheret CT volumen den primære tumor (figur 3). Stigende SUV

maxPVC korreleret svagt med stigende HD-CTC tæller og samlede klynger (figur 3). Ved behandlingen volumen snarere end skalar målinger, TLG korreleret svagt med HD-CTC tæller og samlede klynger i forhold til CT volumen, hvilket korrelerede ikke overhovedet. Disse data var ens for log-normaliseret målinger (Supplerende File 1, tabel S3). Når den undergruppe af patienter, som havde billedbehandling og tapning inden for fire uger fra hinanden kun blev analyseret (n = 65), sammenhænge i figur 3 var generelt svagere end stærkere

TLG = Total Læsion Glycolysis.; SUV = Standardiseret Optagelse Værdi; PVC = Delvis Volume Korrigeret; 10 M WBC = 10 millioner hvide blodlegemer. Fed numre er signifikant ved p-værdi 0,05. Halvdelen af ​​matrixen kun præsenteres da det er symmetrisk omkring en og korrelationer skygge fra omfanget af korrelation. * Spearman rank korrelationer er vist for 62 af 71 patienter med data udtrukket af PET-VCAR.

Vi plottet også SUV

maxPVC af HD-CTC /10 M WBC til at undersøge strukturen af data (figur 4). Selv om disse to variabler svagt blev korreleret som beskrevet ovenfor, ved undersøgelsen af ​​SUV

maxPVC i forbindelse med HD-CTC mængder, 8 PET “negative” tumorer (SUV

maxPVC 2,5) havde en HD-CTC /10 M WBC byrde spænder 0-38, mens 19 PET “positive” tumorer havde ingen mærkbar HD-CTC byrde. Desuden er der for en given SUV

maxPVC eller tumor diameter, der var en bred fordeling af HD-CTCs i patient blod i både tidlige og sene fase NSCLC.

Ikke-metastatiske patienter er fremhævet med rødt (se metoder til definition) og akserne er vist som log

2 (x, y) for at lette fortolkning. Stigende SUV

maxPVC (til venstre) blev svagt korreleret (r = 0,27, p-værdi = 0,03) med stigende HD-CTC /10 M WBC tælle i forhold til tumor diameter på CT (til højre; r = 0,07, p-værdi = 0,60), som viste ingen korrelation. * Vises til 62 af 71 patienter med data udtrukket af PET-VCAR.

Diskussion

Mens flere studier har undersøgt forekomsten og prognostisk nytte af CTCs i karcinomer [27], herunder NSCLC [28], [29], kun få har vurderet forholdet mellem individuelt opregnede CTCs med FDG PET-CT i kliniske omgivelser [30] – [32]. Disse tidligere undersøgelser fokuserede på metastatisk brystkræft [30], [31], men en nylig undersøgelse undersøgte ændringen i CTC tæller som respons på behandling for recidiverende lungekræft og denne forening med FDG PET SUV

max [32]. Mens denne undersøgelse var i stand til at finde en prædiktiv niveau for SUV

max og CTC respons, forfatterne gjorde opmærksom en tendens til en ændring i CTC tæller med behandling og indledende FDG PET SUV

max af recidiverende tumor når stratificering af responders og non-respondere. Det er vigtigt at bemærke, at mens dette var et multicenter studie, blev der ikke FDG PET-scanner kalibrering udføres.

Til vores viden, meget få undersøgelser-om nogen-har samlet et betydeligt antal tidlige fase, behandling naive patienter med annoterede imaging egenskaber for NSCLC. Derudover ovennævnte undersøgelser anvendte EpCAM beriget celle-capture baserede platforme, som er en væsentlig forskel, da den ikke-EpCAM medieret tilgang, vi brugte her ser ud til at være uafhængig af TNM stadie i forhold til disse andre studier med dårlige udbytter for tidlige fase tumorer [33]. Mens HD-CTC assay tidligere har været anvendt NSCLC, [18], [19] dette studie udvider analysen til en behandling-naive indstilling med overvejende patienter tidlige fase, der er forbundet med imaging karakteristika.

FDG optagelse via SUV

max var stærkt iscenesætte og histologi afhængige [15], [22] i denne undersøgelse, men de samme foreninger var ikke indlysende for CTCs og vi var ude af stand til at vise selv en beskeden sammenhæng mellem disse to biomarkører. Dette tyder på, at disse to biomarkører kan fange ortogonale snapshots af tumor biologi, som tilsammen mere rammende beskriver den biologiske mangfoldighed i klinisk lignende NSCLC-patienter. Som et eksempel undersøgte vi to trin IIIA (AJCC 7) patienter, som blev behandlet på samme (chemoradiation uden kirurgi). Begge patienter havde forbehandling, glucoavid tumorer (SUV

maxPVC 15.5 51,9), men disharmoniske CTC tæller (130 0). Mens SUV

max + /CTC + patient har desværre udløbet på 9 måneder (med tilbagefald efter 3 måneder), SUV

max + /CTC- patient forbliver sygdomsfri på næsten et år. Dette antyder, at T

4N

0 (NSCLC NOS) tumor uden CTCs sammenlignet med T

3N

2 (adenocarcinom) tumor med nodal sygdom og mange CTCs kan mere nøjagtigt fænotypebestemt med en integreret biomarkør tilgang. Klart selv, skal denne observation bekræftes flere patienter, som vi indsamler yderligere data over tid.

Antallet af CTCs i kredsløbet er en funktion af primær tumor celle intravasation, tumor celle overlevelse i blodbanen, og tumor celle clearance fra blodbanen [11]. Tidligere data antyder, at de fleste CTCs cleares fra kredsløbet hurtigt [34], og kun en meget lille brøkdel prolifererer på et fjernt sted [35]. Vores data viser, at der findes mange CTCs i den tidlige fase sygdomsfri enten enkeltvis eller i klynger-indebærer tumor hovedparten (dvs. mere fremskreden sygdom), kan ikke være den primære drivkraft for CTC steady state og CTC overlevelse til metastaser. Disse resultater er i overensstemmelse med en anden tidligere undersøgelse ved hjælp af ikke-EpCAM baserede CTC påvisning [29], har brug for yderligere bekræftelse i yderligere undersøgelser, og opfølgning på bænken.

Denne undersøgelse bygger på tidligere arbejde [21 ] undersøge høj forekomst af CTC klynger eller tumor “microemboli” i avancerede fase humane carcinomer ved at vise, at disse indskud er talrige i den tidlige fase sygdom så godt. Da disse “microemboli” er blevet rapporteret at have en højere metastatisk potentiale [36], kunne CTC klynger være vigtige aktører i biomarkør miljø. En nylig og provokerende fund bemærkede, at CTC klynger vise et primært mesenkymale fænotype, som understøtter denne hypotese. [37] Men CTC aggregater syntes at korrelere kun svagt med FDG optagelse af den primære tumor baseret på vores pilotundersøgelse.

Vi har etableret en klinisk model til at studere lungekræft metabolisme og dens virkning på patientens resultat, der kan føre til yderligere og vigtige observationer, men denne undersøgelse har klare begrænsninger, der kræver diskussion. Selvom vi brugte en levedygtig CTC afsløring platform, og vi tegnede sig for inter-scanning og intra-scan variabilitet ved at standardisere FDG PET-CT scanning tværs centre for behandlingsnaive patienter med varierende tumor størrelser, var vi stadig tilbage med en heterogen gruppe af patienter med hensyn til fase og histologi-begge kan forvirre fortolkning af FDG-optagelse og CTC-analyse. Vi fanget også prøver, der blev trukket dage til uger fra FDG PET-CT erhvervelse eller i nærheden af ​​en biopsi af den primære tumor. Effekten af ​​denne variation kan have indført nogle fejl i vores estimater for både CTC påvisning og FDG optagelse, selv om karakteren af ​​denne unøjagtighed er ikke let at vurdere. Yderligere er det meget muligt, at analysere epiteliale karakteristika putative CTCs måske ikke i tilstrækkelig definere subpopulationer med mere mesenchymal eller stamcelletransplantation lignende egenskaber [37], og at disse subpopulationer kunne associere forskelligt med tumor glucosemetabolisme. Endelig anerkender vi, at dette er en pilotundersøgelse, og yderligere patienter er forpligtet til mere fuldstændigt studere nytten af ​​disse oplysninger og at indføre mere sofistikerede modellering givet den ikke-lineære fordeling af de undersøgte variabler. Studere yderligere patienter over tid vil bygge på disse første resultater.

Konklusion

Vi brugte en klinisk model for ikke-småcellet lungekræft, som tyder på, mens CTCs korreleret svagt med tumoral FDG PET optagelse, en stor variation af CTC nummer for en given SUV

max eller tumor diameter eksisterede. Vi bemærkede også, at CTCs var fremherskende i den tidlige fase sygdom ved brug af en ikke-beriget “flydende biopsi” CTC-platformen. Disse resultater kræver yderligere undersøgelse og foreslå, at integrere komplementære, ikke-invasive biomarkører kan være nyttige for at forstå patientens heterogenitet i de tidlige stadier af denne dødelige sygdom.

Støtte Information

File S1.

Figur S1. Patient Flow Across Deltagende Medical Centers. Figur S2. Thoracic Phantom for FDG PET-CT kalibrering. Figur S3. Recovery Koefficient (RC) Kurver Across Centers. Tabel S1. Imaging Parametre for FDG PET-CT erhvervelse af center. Tabel S2. Tabel S3.