PLoS ONE: høj vedhæftning af tumorceller til mesothelial Monolag Afledte fra Peritoneal Wash af dissemineret Mave Cancers

Abstrakt

rolle mesothelial lag i peritoneale spredning af kræftceller kun delvist afklaret. Her forsøgte vi at bedre at definere den mesothelial bidrag til tumorcelleadhæsion ved hjælp af en direkte vedhæftning test anvendes på humane primære kulturer af mesothelial celler (HPMC’er) stammer fra de peritoneale vasker af patienter med gastrisk og tarmkræft. Gastrisk og coloncarcinomaceller blev podet på forskellige mesothelial monolag og kvantitativ fluorescens-analyse blev udført for at analysere deres vækst og adhæsive egenskaber. Den vedhæftning af kræftcellerne blev ikke påvirket af oprindelsen af ​​de HPMC’er når de hidrører fra patienter med forskellige kræftformer eller med godartet sygdom. I modsætning hertil de høje niveauer af ICAM1 ekspression og ROS produktion, der karakteriserer disse ældede mesotelceller, forstærkede tumor celleadhæsion. Disse resultater antyder, mesothelial klæbende egenskaber er afhængige af celleældning, mens påvirkes ikke af tumoren miljø. Anvendelsen af ​​peritoneale vaske som en kilde til at isolere HPMC’er tilvejebringer en praktisk og pålideligt værktøj til in vitro analyse af mesothelial tilstande, der påvirker det peritoneale carcinomatose

Henvisning:. Ranieri D, Raffa S, Parente A, Rossi Del Monte S, Ziparo V, Torrisi MR (2013) høj Vedhæftning af tumorceller til mesothelial Monolag Afledte fra Peritoneal Wash af dissemineret Mave kræft. PLoS ONE 8 (2): e57659. doi: 10,1371 /journal.pone.0057659

Redaktør: Giuseppe Viglietto, University Magna Graecia, Italien

Modtaget: 9. oktober, 2012; Accepteret: 24 Jan 2013; Publiceret: 25 feb 2013

Copyright: © 2013 Ranieri et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra MIUR og fra AIRC – Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 10272), Italien. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

peritoneal spredning af gastriske og kolorektal kræft repræsenterer en hyppig begivenhed, der indtræffer efter kurativ resektion [1] – [3]. Kritisk for peritoneal gentagelse er vedhæftningen af ​​de gratis formidles kræftceller til mesothelial lag og mange forskellige molekylære mekanismer er direkte involveret i denne proces er blevet identificeret [4]. Til peritoneal carcinomatose skal cancerceller kunne overleve i bughulen, når frigjort fra den primære tumor, og skal have en proliferativ og invasiv adfærd, når klæbet til mesothelium. Mens mange undersøgelser er blevet rettet til analyse af ekspression og aktivering af molekylære veje ansvarlige for de sekventielle biologiske ændringer af de forskellige typer af cancerceller [5] – [7], kun et begrænset antal rapporter har fokuseret på bidraget fra mesothelial lag i vedhæftning og peritoneal spredning af kræft [8] – [10].

for en detaljeret analyse af de molekylære mekanismer, der påvirker den selvklæbende scenen, forskellige in vitro eller ex-vivo modeller er blevet udviklet [11] – [13] og primære kulturer af mesotelceller er blevet opnået for at teste adhæsionen af ​​cancerceller i nærvær af fremme eller interfererende midler [8], [12]. De fleste af disse modeller udnytter enten etablerede cellelinier eller humane primære kulturer af mesothelial celler isoleret fra oment fragmenter [10], [14] – [15]. Det er imidlertid blevet foreslået, at også de peritoneale udskylninger, er guldstandarden til at vurdere tilstedeværelsen af ​​peritoneal udbredelse af gastriske og kolorektal cancer [16] – [18], er en god og mere praktisk kilde til mesotelceller, der skal opformeres in vitro [19], selv om deres anvendelse i co-kultur modeller ikke er blevet udforsket.

Adhæsionsmolekyler spiller en stor rolle i trin, der involverer fastgørelsen af ​​de frie cancerceller for den peritoneale overflade [4] og cytokiner, såsom interleukin 1SS (IL1ß) og tumornekrosefaktor α (TNF) udgivet i den inflammatoriske mikromiljø, er kendt for at fremme deres udtryk [20], [21]. Blandt adhæsionsmolekylerne, som spiller en central rolle i spredningen af ​​de neoplastiske celler til mesothelial monolag, flere undersøgelser pegede på den specifikke funktion af det intercellulære adhæsionsmolekyle 1 (ICAM1) til stede på mesotelceller i fremme processen [10], [21]; Desuden er det blevet vist, at op-modulation af dets ekspression, som et resultat af oxidativ stress og ældning af de peritoneale celler, fremmer vedhæftningen af ​​neoplastiske celler fra ovarie-, gastriske og tyktarmskræft [22] – [24], demonstrerer den generelle og afgørende rolle, ICAM1 i spredningen.

i forsøget på at bedre at definere den mesothelial bidrag til vedhæftning af cancerceller og især den mulige rolle af mesothelial aktivering i en kræft miljø efterligne in vitro som meget som muligt in vivo betingelser, vi brugt her en direkte vedhæftning test udført på humane primære kulturer af mesotelceller (HPMC’er) afledt fra de peritoneale vaske af patienter med gastrisk og kolorektale tumorer eller af patienter med benigne sygdomme, så at efterligne in vitro som meget som muligt in vivo betingelser. Med det formål at minimere de mulige variationer kan tilskrives tumor modstykke, vi matchede forskellige isolerede HPMC’er, dyrkes også på forskellige niveauer i senescens, med to kendte cancercellelinier. Vores resultater viser, at klæbemidlet adfærd kræftcellerne ikke påvirkes af oprindelsen af ​​de HPMC’er fra patienter med forskellige tumorer. Imidlertid bekræfter vores observationer rolle peritoneal senescens, gennem forøget produktion af reaktive oxygenarter og af ICAM1 ekspression, i at fremme tumorcelleadhæsion [22] – [24] og foreslå, at anvendelsen af ​​de peritoneale vaskevæsker som kilde at isolere og opformere HPMC’er let kan anvendes til at vurdere in vitro tilstand mesothelium i kræftpatienter.

Materialer og metoder

Cellelinjer

den menneskelige mesothelial værdis 5A cellelinje [25] blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles /F12 medium (DMEM /F12) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) plus antibiotika og hydrocortison (0,1 ug /ml), insulin (2,5 ug /ml), transferrin (2,5 ug /ml) og selen (2,5 ng /ml) (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MD, USA). Den humane kolorektal adenocarcinom Caco2 cellelinje [18], [26] blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% FBS plus antibiotika (Sigma). Den humane gastrisk adenocarcinom AGS cellelinje [18] blev dyrket i Hams F12-medium (Sigma) suppleret med 10% FBS plus antibiotika (Sigma). Salg

Primære kulturer og co-kulturer Salg

Primære kulturer af human peritoneal mesotelceller (HPMC’er) blev opnået fra intraoperativt peritoneale udskylninger [18] af patienter med peritoneal carcinomatose fra kolorektal cancer (# 062) eller gastrisk cancer (# 219) samt af patienter med ikke-kræft sygdom (# 002), der blev opereret på A Unit for kirurgi Sant’Andrea Hospital. De donor klinisk-patologisk karakteristika er beskrevet i tabel 1. Alle patienter blev udførligt informeret og gav skriftligt samtykke til undersøgelsen. Protokollen af ​​undersøgelsen blev godkendt af Etisk bestyrelse Sant’Andrea Hospital, Rom.

For at undgå mulig aktivering af de peritoneale celler ved den kirurgiske proces, de peritoneale skylninger blev opnået ved udgangspunktet trin af operationen. Fra hver patient blev 40 ml peritoneal vask opsamlet i EDTA (50 uM). De peritoneale vaske blev centrifugeret ved 1100 rpm i 5 minutter ved stuetemperatur og pelleteret. Prøver resuspenderes til magnetisk mærkning i 80 uL af MACS® adskillelse buffer (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland). At fjerne epitelcelle komponent fra det peritoneale vask og følgelig at berige mesothelial del, immunomagnetisk depletering ved anvendelse af anti-CD326 /EpCAM mikroperler (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland) blev udført ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt havde MS separationskolonner (MACS®, Miltenyi Biotec) ækvilibreret med 0,5 ml MACS® adskillelse buffer og mikroperlerne mærkede celler blev underkastet magnetfeltet trug kolonnen passage. De CD326 negative celler blev vasket af fra kolonnen, og blev udpladet i DMEM /F12 som ovenfor.

I adhæsions- eksperimenter, Met-5A eller HPMC’er blev dyrket til sammenflydning og efter 24h Caco2 eller AGS celler blev podet på monolaget.

morfologisk analyse af HPMC’er

på HPMC’er morfologisk analyse blev kulturprøverne observeret på et Zeiss Axiovert 200 inverteret mikroskop udstyret med fasekontrast (DIC) optik (Zeiss, Oberkochen , Tyskland). Kvantitativ analyse af flerkernede og multivacuolated celler blev udført ved tælling for hver cellekultur, i alt mindst 250 celler observeret i fem mikroskopiske felter tilfældigt udtaget fra tre forskellige eksperimenter. Alle resultater blev udtrykt som middelværdier ± SE. Signifikans blev beregnet ved anvendelse Kruskal-Wallis test eller parret Students t-test.

P

værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Immunofluorescens

For HPMC’er karakterisering celler blev dyrket på dækglas og fikseret med 4% paraformaldehyd efterfulgt af behandling med 0,1. M glycin i 20 minutter ved 25 ° C og med 0,1% Triton X100 i yderligere 5 minutter ved 25 ° C for at tillade permeabilisering. Celler blev derefter inkuberet i 1 time ved 25 ° C med de følgende primære antistoffer: anti-cytokeratiner (genkende Ck8 og CK19 blandt andre CK’er) (1:100 i PBS; klon MNF116, Dako, Glostrup, Danmark) monoklonalt antistof; anti-vimentin (1:100 i PBS; klon V9; Dako) monoklonalt antistof; anti-calretinin (1:100 i PBS; klon DAK Calret 1; Thermo Fisher Scientific Inc., Fremont, CA, USA) monoklonalt antistof; anti-CEA (1:100 i PBS; Zymed, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) polyklonale antistoffer; anti-EpCAM (1:10 i PBS; Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Tyskland) monoklonalt antistof direkte konjugeret med PE; anti-ICAM1 (1:10 i PBS; StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada) monoklonalt antistof direkte konjugeret med FITC

ukonjugerede primære antistoffer blev synliggjort efter passende vaskning med PBS, under anvendelse af gede anti-mus. FITC (1:50 i PBS; Cappel Research Products, Durham, NC), gede-anti-muse Texas Red (1:200 i PBS; Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA), gede-anti-kanin-FITC (1: 400 i PBS; Cappel Research). For at identificere cykling celler, blev immunfarvning udført med anti-Ki67 kanin polyklonale antistoffer (1:50 i PBS, Zymed Laboratories, San Francisco, CA). Kerner blev farvet med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (1:10.000 i PBS; Sigma). Dækglas blev endelig monteret med 90% glycerol i PBS til observation. Fluorescenssignaler blev visualiseret med ApoTome System (Zeiss) forbundet med et Axiovert 200 inverteret mikroskop (Zeiss) og billedanalyse blev udført ved Axiovision software (Zeiss) og KS300 Image Analyzer software (Zeiss).

Procentdel af EpCAM /Ki67-positive celler i co-kulturer af Met-5A og AGS eller Caco2 celler blev analyseret tælle i alt 500 celler tilfældigt observeret i 5 mikroskopiske felter for hver forskellige tidspunkter (1 time, 24 timer, 48 timer) i den tid løbet af eksperimentet. Procentdel af ICAM1-positive celler i HPMC’er blev analyseret optælling for hver primær kultur i alt 300 celler, tilfældigt observeret i 10 mikroskopiske felter fra tre forskellige eksperimenter. Kvantitativ analyse af ICAM1 fluorescensintensiteten blev udført ved analyse af 100 celler for hver prøve i fem forskellige områder, tilfældigt udtaget fra tre forskellige eksperimenter. Alle resultater blev udtrykt som middelværdier ± SE. Signifikans blev beregnet ved anvendelse Kruskal-Wallis test eller Students t-test;

p

værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Adhæsion assay

Subkonfluente Caco2 eller AGS celler blev trypsinbehandlet og resuspenderet i DMEM serumfrit og mærket med 5 ul /ml Vybrant®DiI opløsning (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ved inkubering i 30 minutter ved 37 ° C. De Dil-mærkede celler blev vasket tre gange og resuspenderet i DMEM /F12 som ovenfor. De mærkede-celler blev direkte udpladet på mesothelial monolag (25 × 10

3 /cm

2 i monolag) og inkuberet i 1, 24, 48 timer. I adhæsionsassays med anti-ICAM1 blokerende antistof (StemCell Technologies), blev inkubationen udføres i nærvær af forskellige fortyndinger (1:10, 1:5 og 1:2) af antistoffet. Et ubeslægtet antistof (anti-cytokeratiner, klon MNF116; Dako) blev anvendt som negativ kontrol ved 1:02 fortynding. Ikke-adhærente celler blev fjernet ved rigelige vaske med serumfrit medium, og adhærente celler og HPMC’er monolag blev fikseret med 4% paraformaldehyd, efterfulgt af behandling med 0,1 M glycin i 20 minutter ved 25 ° C og med 0,1% Triton X-100 for yderligere 5 minutter ved 25 ° C for at tillade permeabilisering. Kerner blev farvet med DAPI. Kerner blev farvet med DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol) (1:10.000 i PBS; Sigma). Kvantitativ analyse af Dil-positive celler /mm

2 blev udført ved at tælle antallet af positive celler i 10 forskellige optiske felter af 2,24 mm

2, tilfældigt udtaget fra tre forskellige eksperimenter. Resultaterne er blevet udtrykt som middelværdier ± SE. P-værdier blev beregnet ved anvendelse Kruskal-Wallis test og signifikansniveau blev defineret som p. 0,05

reaktive oxygenspecies detektion

For reaktive oxygenarter (ROS) påvisning, HPMC’er celler blev inkuberet med 2 ‘, 7’-dichlorfluorescein-diacetat (DCFH-DA, Fluka) (5 uM) i 10 minutter ved 37 ° C, vasket grundigt med PBS og straks observeret under et Axioskop 2 mikroskop udstyret med Pascal LSM 5 konfokal laser scanning (Zeiss, Oberkochen , Tyskland) under anvendelse af en argon-laser med en 488 nm excitation band. Emissionen lang pasning var en 505 filter: laser intensitet blev indstillinger pinhole diameter og Fotomultiplikatorrør holdes konstant for hver eksperiment [27]. Til optimering af fremgangsmåden HPMC’er # 062 ved passage 2 blev behandlet med den pro-oxidant cumenhydroperoxid (Fluka Chemika, AG, Buchs, Schweiz) i forskellige doser (100 og 200 uM) i nærvær eller ikke af antioxidanten vitamin E (15 mg /ml), før den afhængighed af DCFH-DA. Fluorescensintensiteten (FUI, Fluorescence Intensity Units) blev målt ved Zeiss KS300 billedanalysator software (Zeiss) evaluering mindst 200 celler for hver betingelse i tre forskellige mikroskopiske felter. De præsenterede data er udtrykt som middelværdier ± SE fra tre forskellige eksperimenter. Statistisk analyse blev udført under anvendelse parret Students t-test og signifikansniveau er blevet defineret som

s Restaurant 0,05

generation af basal intracellulære ROS blev også målt ved cytofluorimetrisk assay.. De # 062 HPMC’er, behandlet med DCFH-DA som ovenfor, blev trypsiniseret, pelleteret, resuspenderes i forvarmet medium og indsamlet med MACSQuant® Analyzer flowcytometer (Miltenyi Biotec GmbH). Excitations- og emissionsbølgelængder var 488 og 525 nm (FL2 kanal). Den grønne fluorescens-signalet blev analyseret ved MACSQuantify® software (Miltenyi Biotec GmbH) og visualiseret på en tre-årti log skala. Den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) blev beregnet ud fra tre uafhængige forsøg med evaluering af mindst 20.000 begivenheder for assay og udtrykt som relativ fluorescensintensitet (gennemsnit ± SE). Statistisk analyse blev udført ved hjælp parret Students t-test med signifikansniveau defineret som

s

. 0,05

Resultater

Optimering af in vitro-test til vurdering af vedhæftning af kræftceller til mesothelial monolag

En af de første afgørende skridt i peritoneal metastatisk spredning af gastrointestinale tumorer er vedhæftningen af ​​kræftceller til mesothelial monolag [4]. For at undersøge den biologiske opførsel af både kræft og mesotelceller og vurdere deres adhæsionsegenskaber, vi først udvalgt og tilpasset vores betingelser en co-dyrkningssystem og en in vitro-test for adhæsion (Fig. 1A), der tidligere blev anvendt til ovariecancer [12]. Den humane mesothelial cellelinie Met-5A blev dyrket ved sammenløb og humane gastriske adenocarcinomceller (AGS-cellelinie) eller humane colon carcinomceller (Caco2 cellelinie) blev udsået i co-kultur på densiteten af ​​25.000 celler /cm

2 af mesotelial monolag

a) Skematisk tegning af co-dyrkningssystem og adhæsionstesten anvendt gennem hele undersøgelsen:. cancerceller podes på en mesothelial monolag at evaluere celleadhæsion. B) Met-5A mesothelial cellelinie blev dyrket ved sammenløb og AGS eller Caco2-celler blev podet på mesothelial monolag i co-kultur (25.000 celler /cm

2). Efter 24 timer fra podning blev co-kultur fikseret, permeabiliseret og farvet med et primært antistof rettet mod vimentin, efterfulgt af et sekundært Ab mærket med FITC fluorocrome (grøn) til at identificere de mesotelceller. Dobbelt immunofluorescens med α-EpCAM PE-antistof (rød) blev udført for at genkende cancerceller epitelceller. Cellulære kerner blev farvet med DAPI (blå). Immunofluorescensanalysen afslører de forskellige celletyper i vores co-kulturmodel. Det signal, der svarer til vimentin i cellemonolaget er forenelig med intermediære filamenter, som perinukleære cytoplasmatiske bundter, mens EpCAM farvning er forbundet med plasmamembranen af ​​kræftcellerne. Både AGS og Caco2 celler stå enten i små klynger eller isoleres og strengt klæbende til mesothelial celler. Bar: 10 pm. C) Fase kontrast mikroskopi bruges til at verificere integriteten af ​​mesothelium monolag. Efter 48 timer fra såning, de vedhængende Caco2 celler vise et mønster af at vokse i kompakte øer, mens den årlige vækstundersøgelse vedhængende celler viser en mere flad form og en isoleret vækstmønster. Bar: 100 um. D) Proliferation assay udføres ved immunfluorescensfarvning med et primært anti-Ki67-antistof, som identificerer cykling celler efterfulgt af en sekundær FITC-mærket Ab (grøn). Tumorcellerne blev mærket med anti-EpCAM PE Ab som ovenfor. Efter 48 timer fra såning, fordelingen af ​​kræftceller positive for Ki67 nukleare signal afslører en anden adfærd af tumorvækst: anderledes end de isolerede AGS celler, er det Ki67

+ Caco2 celler placeret i periferien af ​​øerne. Bar:. 100 um

For at identificere de forskellige celletyper i vores co-kultur model, vi brugte immunofluorescens (IF) mikroskopi. Efter 24 timer fra podning til at genkende mesothelial celler, der udgør Met-5A monolag farvede vi de co-kulturer med et primært antistof rettet mod vimentin, en komponent af de mellemliggende filamenter af cytoskelettet, efterfulgt af et sekundært Ab mærket med FITC fluorocrome (grøn): signalet var forenelig med struktur og lokalisering af vimentin, der vises som perinukleære cytoplasmatiske bundter af filamenter (figur 1B.). Kræftcellerne blev mærket med α-EpCAM PE-antistof, genkender en human epithelial adhæsionsmolekyle og gælder konjugeret til fluorochromet PE (rød): det tilsvarende signal blev associeret med plasmamembranen af ​​cellerne adhærente til monolaget (. Fig 1B) . De cellulære kerner blev farvet med DAPI (blå). Både AGS og Caco2-celler dukkede enten i små klynger eller isoleret og strengt vedhængende på mesotelceller (fig. 1B).

Til vurdering af de klæbende egenskaber af kræftcellerne, anvendte vi fasekontrastmikroskopi, som lov til at kontrollere mesothelium monolag og fjernet enhver tvivl om muligheden for kræftceller klæber til glas eller plastik støtte. Den morfologiske analyse efter 48 timer fra podning viste, at de adhærente Caco2 celler udviste et mønster til at vokse i kompakte øer (fig. 1C). I modsætning hertil blev AGS klæbede celler karakteriseret ved en mere flad form og en mere isoleret vækstmønster (Fig. 1C).

For bedre at forstå den biologiske opførsel observeret i fase kontrast mikroskopi og vurdere spredning sats af de vedhæftende celler, brugte vi HVIS analyse med Ki67 markør, der identificerer cykling celler. Efter 48 timer fra podning blev co-kulturer farvet med et primært anti-Ki67-antistof, efterfulgt af et sekundært FITC-mærket Ab (grøn). Tumorcellerne blev mærket med anti-EpCAM PE Ab som ovenfor. Mens den proliferative hastighed af de to vedhængende celletyper, vurderet som procentdelen af ​​cellerne positive for Ki67 nukleare signal var sammenlignelige (21% ± 2 og 23% ± 2 for de Caco2 og AGS celler henholdsvis; Kruskal-Wallis test:

s

= NS), afslørede deres fordeling en anden adfærd af kræftceller (fig. 1d). Til forskel AGS celler, Ki67

+ Caco2-celler blev placeret ved periferien af ​​øerne, som forventet ud fra deres spontane evne til at differentiere in vitro [26].

I en kvantitativ vurdering af den vedhæftning af de to cancer cellelinjer til Met-5A monolag, vi brugte de lipofile cellulære tracer Dil at mærke kræftcellerne før vedhæftning test [12]. Figur 2A viser resultaterne opnået ved den samtidige anvendelse af Dil og DAPI farvning af co-kulturer på forskellige tidspunkter (1 time, 24 timer, 48 timer) fra podning. blev taget tilfældigt billeder af 10 forskellige optiske felter som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. Antallet af Dii

+ cancerceller pr mm

2 blev derefter beregnet og statistisk analyseret som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. Resultaterne i figur 2b viste, at begge Caco2 og AGS celler klæber til mesothelial monolag ligeligt på 1 time af co-kultur. Imidlertid adhæsion af Caco2-celler havde tendens til at fordoble efter 24 og 48 timer, mens AGS celler, selv om lidt, men signifikant forøgelse i antal under timespan, var mindre talrige end de Caco2 celler ved enten tidspunkter (

p

0,05). Fordi den proliferative hastighed af de to celletyper efter 48 timer, som beskrevet ovenfor, afslørede ikke forskelle, der kan forklare det højere antal Caco2-celler adhærerer til monolaget i forhold til de AGS celler, resultaterne af Dil-baseret test optrådte at afspejle reelle forskellige klæbende egenskaber.

A) Met-5A mesothelial monolag blev dyrket som beskrevet ovenfor. Caco2 og AGS celler blev mærket med Dil sporstof og derefter podet på monolaget som ovenfor. Efter 1, 24 og 48 timer blev co-kulturer vaskes, faste og permeabiliseres. Kerner blev farvet med DAPI. Bar: 200 um. B) Kvantitativ analyse af antallet af adhærerende Dil

+ celler /mm

2 blev udført som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. Mens efter 1 times såning både Caco2 og AGS celler klæbe til monolag i tilsvarende mængde, på 24 og 48 timer tidspunkter antallet af Caco2 celler er næsten fordoblet sammenlignet med AGS, hvilket øger kun lidt, men betydeligt i den tid . Resultater er udtrykt som middelværdier ± IC 95%. Statistik: Students t-test:

* p

0,01 vs AGS 1 time;

** p

0,001 vs Caco2 1 time og AGS 24timer ***

s

0,01 vs AGS 1 time og

s

= NS vs AGS 24timer ****

s

. 0,001 vs Caco2 24 timer

Adhæsion af kræftceller til primære humane mesothelial monolag stammer fra peritoneale vasker

For at vurdere mulige rolle i mesothelium i vedhæftning processen med kræftceller i vores co-kultur-systemet, brugte vi den ovenstående test med primære kulturer af mesotelceller opnået fra den peritoneale vask af patienter ramt af peritoneal carcinomatose fra kolorektal eller gastrisk cancer og ikke- carcinoma sygdom. Faktisk peritoneumudskylning repræsenterer en praktisk kilde til mesotelceller [19], i stedet for at udnytte omentum fragmenter.

For at karakterisere de humane peritoneale mesoteliale celler (HPMC’er), opnået som beskrevet i materialer og fremgangsmåder, anvendte vi immunofluorescensmikroskopi (fig. 3). At anerkende de primære mesotelceller fra andre typer af celler til stede i den peritoneale vask, såsom fibroblaster og epitelcancerceller farvede vi kulturerne med en kombination af antistoffer rettet mod kendte mesothelial markører, såsom vimentin, cytokeratiner (Ck8 og CK19) og calretinin. For at være sikker på, at cellerne var af mesenchymal oprindelse og ikke epitel, vi anvendes parallelt de samme antistoffer på Caco2 celler. Resultaterne viste, at HPMC’er var positive for både vimentin og cytokeratin-farvning, som optrådte som perinukleære cytoplasmatiske bundter af intermediære filamenter (fig. 3, venstre paneler). Som forventet blev Caco2 celler negativt farvet for vimentin og positivt mærket til cytokeratiner (fig. 3, højre paneler). Til utvetydigt diskriminere HPMC’er fra fibroblaster muligvis er til stede i vore kulturer blev celler mærket med antistoffer mod calretinin, en intracellulær calcium-bindende protein, der tilhører troponin-C superfamilien udtrykkes i mesotelceller: signalet var i cytosoliske brændpunkter (fig. 3, højre panel). Igen epiteliale Caco2-celler var negative (fig. 3, venstre panel). I modsætning hertil HPMC’er var negative for epitel markør EpCAM som blev udtrykt på plasmamembranerne i de Caco2-celler (fig. 3, nederste paneler, rødt signal) og for tumormarkøren carcinoembryonisk antigen CEA, hvis signal var synligt enten i intracellulære pletter eller på celleoverfladerne (fig. 3, nederste paneler, grønt signal).

Primære kulturer af humane peritoneale mesoteliale celler (HPMC’er) blev isoleret fra peritoneale vaskevæsker som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. Caco2 coloncancer-celler blev anvendt som kontrol. Immunofluorescensanalyse under anvendelse af antistoffer rettet mod mesothelial (vimentin, Ck8 og CK19 cytokeratiner og calretinin) og epithelial (EpCAM og CEA) markører viser, at HPMC’er er positive for vimentin og cytokeratin-farvning, der vises som perinukleære bundter af filamenter, såvel som for den varme -spotted calretinin signal, men er negative for plasmamembranen EpCAM-farvning og for den intracellulære og overfladen CEA signal. Caco2 celler er positive for cytokeratiner og dobbelt positiv for EpCAM og CEA epitel markører synlige på celleoverfladerne (EpCAM, grønt signal) eller på plasma membraner og i intracellulære pletter (CEA, rød signal). Kerner blev farvet med DAPI. Bar: 20 pm

For en kvantitativ vurdering af evnen af ​​de to cancer cellelinjer (AGS og Caco2 celler) for at holde sig til forskellige HPMC monolag, vi brugte den Dil sporstof som ovenfor for at markere. cancerceller før adhæsionstesten. Til analysen anvendte vi tre primære kulturer af mesotelceller, der stammer fra de peritoneale vaske med patienter uden carcinoma sygdom (fig. 4A), med kolorektal cancer (fig. 4B) eller med gastrisk cancer (fig. 4C) og vi var i stand til at sammenligne bidragene fra forskellige mesothelial monolag til adhæsionen af ​​den samme type cancerceller på forskellige tidspunkter (1 time, 24 timer, 48 timer). Den kvantitative analyse af adhæsionen af ​​DiI

+ -celler til HPMC monolag (fig. 4A-C) viste reducerede niveauer af adhæsion i timespan for begge tumorcellelinier sammenlignet med adhæsionen test udført på Met-5A (se fig. 2B). På disse primære dyrkede monolag, de Caco2-celler var mere vedhængende end AGS celler ved enten 24 eller 48 timer, uafhængigt af oprindelsen af ​​de peritoneale vaskevæsker. Men mens vedhæftningen af ​​Caco2 celler var sammenlignelig med alle mesothelial lag, uanset om deres kilde fra patienter med neoplastisk eller godartet sygdom, viser de AGS celler betydelige forskelle i deres adfærd, viser højere vedhæftning til de HPMC’er fra tyktarmskræft patient (# 062) i forhold til de HPMC’er fra enten mavekræft patient (# 219) eller fra ikke-carcinoma sygdom (# 002). Medens de adhæsionsegenskaber mesothelial monolag vises uafhængig af kræft miljø, vores co-kultur model er i stand til at detektere forskelle blandt HPMC’er.

HPMC’er isoleret fra det peritoneale vask af et ikke-cancerpatient ( a, # 002), fra den for et tyktarmskræft patient (B, # 062), og fra den af ​​en gastrisk cancer patient (C, # 219), blev dyrket til sammenflydende monolag som ovenfor. Caco2 og AGS celler blev mærket med Dil, podet på HPMC lag, venstre mod klæbe til forskellige tidspunkter (1, 24 og 48 timer) og derefter vasket, faste og permeabiliserede. Kerner blev farvet med DAPI. Kvantitativ analyse af antallet af adhærerende Dil

+ celler /mm

2 blev udført som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. Uafhængigt af oprindelsen af ​​de peritoneale vaske de Caco2 cellerne udviser højere niveauer af adhæsion i forhold til AGS efter 24 og 48 timer. Men mens adhæsion af Caco2 celler ligner alle mesothelial lag, vise AGS celler signifikante forskelle, som viser højere vedhæftning til laget # 062 i forhold til # 219 og # 002. Resultaterne af den kvantitative analyse er udtrykt som middelværdier ± IC 95%. Kruskal-Wallis test: A)

* p

0,05 vs AGS en time; **

s

0,01 vs Caco2 en time,

s

0,01 vs AGS 24timer ***

s

0,05 vs AGS 1 time og

s

= NS vs AGS 24 timer; ****

s

0,01 vs Caco2 24 timer. B)

* p

0,01 vs AGS en time; **

s

0,01 vs Caco2 en time,

s

= NS vs AGS 24timer ***

s

0,01 vs AGS 1 time

s

= NS AGS 24timer ****

s

0,01 vs Caco2 24 timer. C)

* p

0,01 vs AGS en time; **

s

0,01 vs Caco2 en time,

s

0,01 vs AGS 24timer ***

s

0,05 vs AGS 1 time

s

= NS 24 AGS timer; ****

s

. 0,001 vs Caco2 24 timer

Rolle HPMC ældning i vedhæftningen proces

For at analysere vores model bidrag mulige cellulære og molekylære mekanismer, der kan spille en rolle i de forskellige adhæsive egenskaber af HPMC’er fokuserede vi vores opmærksomhed på mesothelial ældning. Faktisk blandt de fysiologiske egenskaber mesothelial monolag, er det ældning niveau af HPMC’er menes at fremme adhæsionen af ​​tumorceller [22] – [24]. Interessant, idet vores HPMC’er, afledt af peritoneale vasker stedet for fra omentum prøver, vises allerede ved det første in vitro passage de velkendte træk ved senescens, ligesom en forstørret morfologi, flere kerner og cytoplasmatisk vakuolisering [14].