PLoS ONE: Øget Pleiotrophin Koncentrationer i papillære Skjoldbruskkirtel Cancer

Abstrakt

Baggrund

skjoldbruskkirtlen knuder er fælles, og ca. 5% af disse knuder er maligne. Pleiotrophin (PTN) er en heparin-bindende vækstfaktor, som er overudtrykt i mange cancertyper. Udtrykket af PTN i papillær kræft i skjoldbruskkirtlen (PTC) er ukendt

Metode og Resultater

74 forsøgspersoner (alder 47 ± 12 y, 15 mænd), der havde thyroidektomi med en histologisk diagnose:. 79 godartede knuder og 23 PTC’er (10 classic, 6 tall celle, 6 follikulær variant og 1 ubestemte). Fin-nål aspiration (FNA) prøver blev opnået

ex vivo

fra kirurgisk fjernet væv og analyseret for PTN og thyroglobulin (Tg). Immunhistokemi (IHC) blev udført på vævssnit. I FNA prøver, PTN koncentration normaliseret til Tg var signifikant højere i PTC end i godartede knuder (16 ± 6 vs 0,3 ± 0,1 ng /mg, p 0,001). I follikulært variant af PTC (n = 6), PTN /Tg forholdet var også højere end i godartede knuder (1,3 ± 0,6 vs 0,3 ± 0,1 ng /mg,

P

0,001 henholdsvis). IHC viste cytoplasmatisk lokalisering af PTN i PTC celler.

Konklusion

I

ex vivo

FNA prøver, PTN til thyroglobulin forholdet var højere i PTC, herunder follikulært variant PTC, end i benigne skjoldbruskkirtlen knuder. Resultaterne hæve den mulighed, at målingen af ​​PTN til Tg forhold kan give nyttige diagnostiske og /eller prognostisk information i evalueringen af ​​skjoldbruskkirtlen knuder

Henvisning:. Jee YH, Sadowski SM, Celi FS, Xi L, Raffeld M, Sacks DB, et al. (2016) Øget Pleiotrophin Koncentrationer i papillære kræft i skjoldbruskkirtlen. PLoS ONE 11 (2): e0149383. doi: 10,1371 /journal.pone.0149383

Redaktør: Soheil S. Dadras, University of Connecticut Health Center, UNITED STATES

Modtaget: August 6, 2015; Accepteret: 1. februar, 2016 Publiceret: 25 feb 2016

Dette er en åben adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:.. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af Intramural forskningsprogrammer Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and human Development (NICHD), National Institute of Diabetes og Digestive og nyresygdomme (NIDDK), center for Cancer Research, National Cancer Institute (NCI), og den kliniske center of National Institutes of Health

Konkurrerende interesser:. YHJ og JB er co-opfindere på en patentansøgning indgivet af National Institutes of Health, der dækker måling af midkine og pleiotrophin i FNA prøver (US patentansøgning nr 61 /728.624 indleveret 20. november 2012. HHS reference:. E-016 til 2013/0-US-01 på assay til måling af midkine eller pleiotrophin niveau for diagnose af en vækst Børsnoterede opfindere: Baron og Jee). Forfattere har ingen andre relevante erklæringer om beskæftigelse, rådgivning, patenter, produkter i udvikling eller modificerede produkter. Dette ændrede ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. Ellers erklærer forfatterne, at der ikke er nogen interessekonflikt, der kunne opfattes som skade upartiskhed forskningen rapporteret.

Introduktion

skjoldbruskkirtlen knuder forekommer hyppigt i den almindelige befolkning med en prævalens på ca. 3-7% for palpable masserne [1, 2]. Ca. 5% af skjoldbruskkirtlen knuder er maligne [3] og den mest almindelige histologiske type er papillær thyroidcancer (PTC) [1]. To store udfordringer klinikere at skelne maligne fra godartede knuder og at identificere de thyroidlidelser der er aggressive [1]. Fin nål aspiration (FNA) cytologi repræsenterer den primære præoperative diagnostiske værktøj til vurdering af skjoldbruskkirtlen knuder [4], men det er usikkert i op til 30% af patienterne [5]. Navnlig follikulær variant PTC er vanskelig at skelne fra godartede follikulære læsioner ved cytologi [6, 7].

Pleiotrophin (PTN) og midkine (MDK) er relateret polypeptid heparinbindende vækstfaktorer [8, 9] . PTN og MDK er overudtrykt i forskellige menneskelige kræftformer, hvor de menes at fremme celle overlevelse, proliferation og angiogenese, der bidrager til tumorvækst [10, 11].

Vi rapporterede for nylig, at koncentrationen af ​​MDK i FNA prøver er forhøjet i PTC forhold til godartede knuder [12]. I den undersøgelse MDK koncentrationen blev normaliseret til koncentrationen thyroglobulin (Tg), som justeret for væv indhold og også forbedret adskillelsen mellem ondartede og godartede prøver på grund af lavere Tg koncentrationer i maligne knuder. Imidlertid blev hverken MDK eller fusionens MDK /Tg-forholdet forhøjet i den follikulære variant af PTC undergruppe [12], hvilket begrænser den potentielle diagnostiske værdi af denne tilgang.

PTN er tidligere rapporteret at være overudtrykt i medullær thyreoidea kræft [13], men udtryk for PTN i PTC’er er ikke undersøgt. Vi antager, at PTN koncentration og PTN /Tg koncentration forholdet er højere i PTC’er end i godartede knuder.

Materialer og metoder

Emner og prøvetagning

Seventy-fire voksne personer (alder 47 ± 12 år, 15 mænd) med skjoldbruskkirtlen knuder, som gennemgik thyroidektomi ved National Institutes of Health (NIH) Klinisk center blev inkluderet i analysen. Undersøgelse protokoller blev godkendt af National Institute of Diabetes og Digestive og nyresygdom Institutional Review Board, og alle patienter skal skriftligt informeret samtykke til at deltage i undersøgelsen. Efter skjoldbruskkirtlen blev fjernet, blev udvalgte knuder med omgivende væv gennemskæres for indkøb og derefter

ex vivo

FNA blev udført ved at føre en 25-gauge kanyle ind i knuder. Nålen blev passeret 10 til 20 gange. Nr sugning blev påført. Vævet inde i nålen blev vasket ud med 0,5 ml PBS indeholdende 1% BSA. Prøverne blev opdelt i portioner og opbevaret straks ved -80 C indtil assay. Multiple

ex vivo

FNA prøver (betyde, 3,0 prøver) blev opnået pr knude. Vi forsøgte oprindeligt at måle PTN i

in vivo

FNA udvaskning prøver, efter at nålen indholdet var blevet fordrevet til cytologi, men ofte findes upåviselige PTN koncentrationer, hvilket indikerer utilstrækkelig væv tilbage i nålen (data ikke vist).

i alt 103 knuder blev udtaget. Af disse blev 62 knuder prøver tidligere analyseret for MDK koncentration og indgår i en forudgående rapport [12].

Pleiotrophin Sandwich ELISA assay

Et PTN sandwich-ELISA blev udviklet i vores laboratorium (se S1 Metode til assay detaljer). Intra-assay CV var 6,9% for høj koncentration (1,3 ng /ml) og 9% for lav koncentration (0,2 ng /ml). Den inter-assay CV var 8,8% ved 0,2 ng /ml og 12,3% ved 0,6 ng /ml. Detektionsgrænsen var 10 pg /ml. Der var ingen krydsreaktivitet med op til 50 ng /ml MDK (S1A Fig). PTN koncentrationer i PBS indeholdende 1% BSA forblev stabil i plast, men ikke glasrør over 2 timer ved stuetemperatur og med gentagne fryse-tø-cykler (S2 Fig). Analysen viste god parallelitet (S3 Fig).

Midkine Sandwich ELISA assay

MDK sandwich ELISA blev udført som beskrevet tidligere anvendelse af et kommercielt kit (Biovendor, Tjekkiet) med modifikationer [12]. Intra-assay CV var 3,4% ved høj koncentration (0,7 ng /ml) og 5,2% ved lav koncentration (0,25 ng /ml). Inter-assay CV var 12,3% ved lav koncentration. Detektionsgrænsen var 0,009 ng /mL. Der var ingen krydsreaktivitet med op til 50 ng /ml PTN (S1B Fig).

Thyroglobulin Assay

50 pi buffer indeholdende skjoldbruskkirtelvæv fra en FNA nål blev fortyndet 10 fold i normalt saltvand og koncentrationen af ​​Tg blev målt med et kemiluminescerende immunometrisk assay (Immulite 2000XPi, Siemens, UK) ifølge producentens anvisninger og som tidligere beskrevet [12].

BRAF mutationsanalyse

DNA blev ekstraheret på en Qiacube halvautomatiseret robotanordning (Qiagen, Valencia, CA) under anvendelse af enten QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) fra 17 FNA udvaskning prøver og 6 frosne vævsprøver eller QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen) for paraffin -embedded vævssnit, i henhold til producentens anvisninger.

BRAF

T1799A (V600E) mutationsanalyse blev udført under anvendelse af PrimePCR ddPCR mutationsdetektion assay (Bio-Rad, Hercules, CA) på en BIO-RAD QX200 dråbe digital PCR (ddPCR) system. Hver reaktion indeholdt 10 pi 2x ddPCR Supermix for sonder (ingen dUTP), 1 pi

BRAF

V600E primer /probe mix (FAM), 1 pi BRAF vildtype primer /probe mix (HEX), og 40-100 ng genomisk DNA. Tilstedeværelsen af ​​mutation og fraktioneret overflod af den mutante allel blev bestemt med QuantaSoft v.1.7 (BIO-RAD).

Pleiotrophin Immunhistokemi

Væv blev formalin-fikseret, indlejret i paraffin, og skåret i 5-um-tykke sektioner, som blev deparaffinerede og rehydreret i graduerede alkohol. For antigen hentning blev snit anbragt i citratpuffer ved 120 ° C under anvendelse af en pressuer komfur i 10 minutter. Efter blokering med 1,5% normalt kaninserum i Tris-bufret saltvand og Tween 20 (TBST) i 60 minutter ved stuetemperatur, blev objektglassene inkuberet med et gede-polyklonalt antistof rejst mod human PTN (Cat # AF-252-PB, R 0,001, S4 fig). Da denne korrelation sandsynligvis sket, fordi både PTN og Tg koncentrationer i udvaskningsvæske var afhængig af mængden af ​​skjoldbruskkirtlen væv til stede i prøven, PTN niveauer blev normaliseret til Tg-niveauer som PTN /Tg, ng /mg, for at korrigere for mængden af thyreoideavæv.

PTN koncentrationer og PTN /Tg-forholdet i ex vivo FNA prøver

PTN koncentrationer i PTC var betydeligt højere end i godartede knuder (0,1 ± 0,01 vs 0,05 ± 0,01 ng /ml, gennemsnit ± SEM, s 0,001). PTN koncentrationer i den delmængde af follikulært variant papillær thyroidcancer (FVPTC) var også højere end i benigne knuder (0,12 ± 0,03 vs 0,05 ± 0,01 ng /ml, p 0,001, figur 1A).

Prøver blev opnået af

ex vivo

fin nål aspiration; PTN og Tg blev målt ved immunoassay. PTN koncentrationer (gennemsnit ± SEM) var højere i PTC (herunder alle undertyper) og i undergruppen af ​​follikulært variant PTC (FVPTC) end i benigne knuder (A). Ligeledes var PTN /Tg større i PTC (herunder alle undertyper) og i delmængde af FVPTC end i benigne knuder (B). PTN-koncentrationer ikke adskiller sig væsentligt blandt klassiske, høje celle variant, og FVPTC (C). PTN /Tg tendens (

P

= NS) at være lavere i FVPTC end i andre undertyper (D). Scatterplot viser PTN /Tg-værdier for alle knuder. Lukkede symboler, PTC; åbne symboler, godartede knuder (E). Værdier mindre end 0,001 vises som lig med 0,001.

Tg-koncentrationer var lavere i PTC end i godartede knuder (112 ± 30 vs 926 ± 88 pg /ml,

P

0,001, Fig 1B og 1E), og også betydeligt højere i FVPTC end i godartede knuder (1,3 ± 0,6 vs 0,3 ± 0,1 vs ng /mg,

P

0,001) (figur 1B). PTN /Tg blev også forhøjet i den ene knude indeholder medullær thyreoideacancer (2,9 ng /mg).

Blandt PTC’er, var der ingen forskel i PTN koncentrationer blandt klassiske, høje celle variant og FVPTCs (0,09 ± 0,02, 0,12 ± 0,03 og 0,12 ± 0,03 ng /ml henholdsvis

P

= NS) (figur 1C). Men FVPTC havde de laveste de PTN /Tg-forhold (24,5 ± 11,7, 42,1 ± 23,3 og 1,3 ± 0,6 ng /mg henholdsvis

P

= 0,06) (Fig 1D).

af 10 godartede knuder med den højeste PTN /Tg-forholdet, 2 forekom hos patienter med Graves ‘sygdom (2 af 2 forsøgspersoner med Graves’ sygdom), 1 i et emne med en follikulært adenom (1 af 4 forsøgspersoner med follikulært adenom), 1 hos en patient med kronisk lymfatisk thyroiditis (1 af 3 individer med kronisk lymfatisk thyroiditis), 1 i en godartet knude støder op til PTC og 5 i godartede knuder uden andre væsentlige histologiske fund.

PTN /Tg-forholdet ikke havde nogen association med knude størrelse eller tilstedeværelsen af ​​lymfeknude metastaser (data ikke vist).

associering mellem det PTN /Tg og MDK /Tg og bivariate analyse

Begge MDK /Tg og PTN /Tg blev målt i 22 PTC’er og 77 godartede knuder. Der var ingen sammenhæng mellem PTN /Tg og MDK /Tg blandt godartede knuder. Men der var en positiv korrelation mellem MDK /Tg og PTN /Tg blandt PTC’er (R

2 = 0,44,

P

= 0,001) (figur 2A).

associering mellem PTN /Tg og MDK /Tg nøgletal blandt alle PTC knuder undersøgt (A). PTN /Tg og MDK /Tg var positivt korreleret (R

2 = 0,44,

P

= 0,001). Bivariate analyse af PTN /Tg og MDK /Tg-forhold (B). Alle PTC’er havde MDK /Tg på over 0,2 ng /ml (vandret stiplet linje) og PTN /Tg på over 0,13 ng /ml (lodret stiplet linje). Værdier mindre end 0,001 vises som lig med 0,001. Lukkede cirkler, PTC; åbne cirkler, godartede knuder.

En afsætning med to variabler af alle knuder med både PTN /Tg og MDK /Tg målt afslørede, at alle PTC’er havde MDK /Tg på over 0,2 ng /ml og PTN /Tg på end 0. 13 ng /ml (fig 2B). Af de 35 knuder, der opfyldte begge disse kriterier, 23 var ondartet (100% af PTC) og 12 var godartet (15% af godartede knuder), hvilket giver en følsomhed på 100% og en specificitet på 85%.

Association mellem PTN /Tg-forholdet og BRAF mutation

Blandt 23 PTC knuder, 16 havde

BRAF

V600E mutation. Den PTN /Tg-forholdet tendens til at være højere i

BRAF

-positive end i

BRAF

-negative knuder, men forskellen nåede ikke statistisk signifikans (21,5 ± 7,9 vs 1,8 ± 0,8,

P

= 0,095).

Bekræftelse af PTN udtryk ved hjælp af immunhistokemi

immunhistokemisk farvning af vævssnit afslørede, at PTN immunfarvning var mere intens i disse neoplastiske skjoldbruskkirtlen epitelceller inden for de PTC’er end i de nærliggende normale thyroidea epitelceller. (Fig 3A-3C). Nogle spredte stromale celler i det tilstødende bindevæv viste også immunhistokemisk farvning. Inden skjoldbruskkirtlen epitelceller, PTN farvningen var primært cytoplasmatisk og perinukleær (fig 3C).

A) Histologiske afsnit med høj celle variant PTC blev immunfarvet for PTN (brun farve) og modfarvet med hematolxylin (lilla farve). Immunohistokemisk farvning var mere intens i de neoplastiske thyroidea epitelceller inden for de PTC’er (lukkede pile) end i i nærliggende normale thyroidea epitelceller (åbne pile). Nogle stromale celler i det tilstødende bindevæv viste også immunhistokemisk farvning. B) Højere forstørrelse af PTC og normalt væv fra det samme snit som i panel A. C) Immunhistokemisk belaster klassiske PTC, der viser perinuklear placering af PTN (pile). Størrelse bar, 100 um.

Diskussion

Vi fandt, at PTN var målbar i FNA prøver opnåede

ex vivo

fra thyroidektomi prøver, og at PTN koncentrationerne var højere i PTC end i benigne knuder. Tilsvarende PTN /Tg-forhold var større i PTC end i benigne knuder. Vi valgte i første omgang at bruge Tg som et mål for væv indhold. Vi fandt imidlertid, at niveauet af Tg i prøver fra PTC var lavere end i prøver fra godartede knuder, hvilket tyder på, at Tg udtryk kan være lavere i maligne celler, i overensstemmelse med en forudgående undersøgelse [14], og derfor Tg kan ikke blot være en måling af væv indhold. Men fra et pragmatisk synspunkt, denne effekt er tilfældigt, fordi normalisering af PTN til Tg forbedret adskillelse mellem maligne og benigne prøver.

PTN udtryk af PTC blev bekræftet ved immunhistokemi. De immunohistokemiske resultater antyder, at PTN overudtrykkes af de neoplastiske thyroidea epitelceller selv, primært i en perinukleær og cytoplasmatisk lokalisering som rapporteret i andre væv [15-16]. Men farvning for PTN blev også observeret i de tilstødende stromaceller hæve muligheden for, at andre celler også kan bidrage til den forhøjede PTN målt ved ELISA i PTC.

Konstateringen af, at PTN er forhøjet i PTC tyder på, at PTN overekspression kan fremme væksten af ​​PTC’er, som også er blevet foreslået til andre cancere, såsom ovariecancer [17], pancreas [18], glioblastoma [19], prostatacancer [20] og brystkræft [21]. For eksempel i en brystcancer model, PTN overekspression stimuleret ombygning af mikromiljøet, tumorangiogenese, og hurtig tumorvækst [22]. Men i vores undersøgelse, vi ikke observere en sammenhæng mellem PTN /Tg-forholdet og størrelsen af ​​knuder eller tilstedeværelsen af ​​lymfeknude metastaser. Vi også finde en signifikant sammenhæng mellem den PTN /Tg-forholdet og tilstedeværelsen af ​​BRAF V600E mutation. Men stikprøvestørrelse på vores undersøgelse er utilstrækkelig til definitivt udelukke foreninger med sygdom aggressivitet eller genetisk ætiologi.

Vi har tidligere fundet, at koncentrationen af ​​MDK, en heparin-bindende vækstfaktor relateret til PTN, var højere i PTC end i godartede knuder [12]. I den aktuelle undersøgelse, fandt vi, at MDK /Tg og PTN /Tg positivt blev korreleret i PTC. , En vigtig forskel er imidlertid, at den PTN /Tg i FVPTC, blev ophøjet mens MDK /Tg viste værdier overlapper dem af godartede knuder. Dette fund er af særlig interesse, fordi FVPTC er ofte vanskeligt at skelne fra godartede follikulært læsioner ved cytologi, ofte kræver histologisk evaluering [7].

En bivariate plot af PTN /Tg og MDK /Tg viste stærk gruppering af PTC prøver, således at alle maligniteter havde MDK /Tg på over 0,2 ng /mg og PTN /Tg på over 0,13 ng /mg. Kun 15% af godartede knuder opfyldte begge disse kriterier (figur 2B). Observationen, at PTN /Tg-forholdet og MDK /Tg-forholdet er forhøjede i PTC forhold til godartede knuder rejser muligheden for, at FNA prøver måling af PTN, MDK, og Tg i skjoldbruskkirtlen kan give nyttige supplerende diagnostisk information til cytologisk undersøgelse, som har påvist ved RNA profilering [23], mutationsanalyse [24] og andre molekylære fremgangsmåder [25]. Men for at etablere en klinisk nyttig metode, der er vigtige udfordringer, der skulle overvindes, hvoraf mange afspejler begrænsninger i den aktuelle undersøgelse. Dels at måle PTN i FNA udvaskning, skal tilstrækkelig thyreoideavæv være til stede. Således kan en dedikeret FNA aflevering, adskilt fra dem, der kræves for cytologi, være forpligtet til at opnå tilstrækkelig væv som der bliver gjort med den kommercielt tilgængelige genekspression klassificeringen test [23]. Alternative mulige tilgange omfatter udvikling af en mere følsom PTN analyse eller vaske bortvist nål med en mindre volumen af ​​buffer og udførelse af analysen uden fortynding. For det andet blev den aktuelle undersøgelse udført med FNA prøver opnåede

ex vivo

efter thyroidektomi. Hvorvidt lignende data vil blive observeret med

in vivo

, perkutan FNA sampling er ukendt. Vi har ikke behandle dette spørgsmål på grund af den manglende adgang til dedikerede

in vivo

FNA prøver i denne forskningsundersøgelse. For det tredje kan vores tilgang ikke være anvendelige til patienter med Graves ‘sygdom eller kronisk lymfatisk thyroiditis; vi observeret forhøjede PTN /Tg nøgletal i godartede knuder i skjoldbruskkirtel berørt af disse autoimmune sygdomme. For det fjerde ville tilpasning af disse resultater i en supplerende klinisk diagnostisk test kræver betydeligt større undersøgelse for at bestemme følsomheden og specificiteten hos forsøgspersoner med indeterminant cytologi. Den nuværende pilotundersøgelse viser en ny observation af forhøjet PTN /Tg i alle typer af PTC, men var ikke designet til konsekvent at validere en diagnostisk test. Vores undersøgelse er designet til en proof-of-concept og brugt

ex vivo

FNA materialer. Derfor er ROC-analyse ikke foretaget.

Konklusioner

Som konklusion, vores resultater viser, at PTN koncentrationer og PTN /Tg-forholdet i

ex vivo

FNA prøver skelne PTC fra godartede læsioner, hæve muligheden for, at denne strategi kan have supplerende diagnostisk værktøj til at supplere cytologi og andre eksisterende molekylære metoder. Dog vil yderligere større undersøgelser være nødvendige for at validere denne fremgangsmåde.

Støtte Information

S1 Fig.

Supplerende figur 1A. PTN krydsreaktivitet med MDK. Supplerende Figur 1B. MDK krydsreaktivitet med PTN

doi:. 10,1371 /journal.pone.0149383.s001

(DOCX)

S2 Fig.

Supplerende Figur 2A. Stabilitet i glas vs plastrør. Supplerende Figur 2B. Stabilitet ved stuetemperatur og under fryse og tø cyklus

doi:. 10,1371 /journal.pone.0149383.s002

(DOCX)

S3 Fig. Supplerende Figur 3.

parallelitet af PTN ELISA mellem standardkurven og serielt fortyndede udvaskning prøver

doi:. 10,1371 /journal.pone.0149383.s003

(DOCX)

S4 Fig. Supplerende Figur 4.

PTN koncentrationer blev positivt forbundet med Tg koncentrationer i FNA udvaskning prøver fra godartede knuder (analyse omfattede alle individuelle afleveringer, R

2 = 0,04, P 0,001)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0149383.s004

(DOCX)

S5 fig. Supplerende Figur 5.

Positive og negative IHC styring

doi:. 10,1371 /journal.pone.0149383.s005

(DOCX)

S1 Method. Supplerende Metode

Pleiotrophin Sandwich ELISA assay

doi:.. 10,1371 /journal.pone.0149383.s006

(DOCX)