PLoS ONE: Periostin direkte og indirekte Fremmer Tumor lymphangiogenese af hoved og hals Cancer

Abstrakt

Baggrund

Metastase til regionale lymfeknuder via lymfekar spiller en central rolle i udviklingen af ​​kræft. Tumor lymfangiogenese er kendt for at fremme lymfe metastase og vaskulær endotelvækstfaktor C (VEGF-C) er en kritisk aktivator af tumor lymfangiogenese under processen med metastase. Vi har tidligere identificeret periostin som invasion- og angiogenese-fremmende faktor i hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC). I denne undersøgelse, opdagede vi en ny rolle for periostin i tumor lymfangiogenese.

Metoder og Resultater

Periostin overekspression opreguleret VEGF-C mRNA-ekspression i HNSCC celler. Ved at bruge konditioneret medium fra periostin-overudtrykkende HNSCC celler undersøgte vi rør dannelse af lymfatiske endotelceller. Konditionerede medier fra periostin-overudtrykkende celler fremmes dannelse rør. At kende sammenhængen mellem periostin og VEGF-C, vi sammenlignet Periostin udtryk med VEGF-C-ekspression i 54 HNSCC tilfælde ved immunhistokemi. Periostin udtryk var korreleret godt med VEGF-C-ekspression i HNSCC tilfælde. Desuden korrelation mellem periostin og VEGF-C-sekretion blev observeret i serum fra HNSCC patienter. Interessant periostin selv fremmet rør dannelse af lymfatiske endotelceller uafhængigt af VEGF-C. Periostin-forfremmet lymfangiogenese blev medieret af Src og Akt aktivitet. Faktisk mulig sammenhæng mellem periostin og lymfe status i periostin-overekspression xenotransplantattumorer og HNSCC sager blev observeret.

Konklusioner

Vores resultater tyder på, at periostin selv samt periostin-induceret opregulering af VEGF-C kan fremme lymfangiogenese. Vi foreslår, at periostin kan være en markør for forudsigelse af maligne adfærd i HNSCC og et potentielt mål for fremtidig terapeutisk intervention for at hindre tumoral lymfe invasion og lymfangiogenese i HNSCC patienter

Henvisning:. Kudo Y, Iizuka S, Yoshida M , Nguyen PT, Siriwardena SBSM, Tsunematsu T, et al. (2012) Periostin direkte og indirekte Fremmer Tumor lymphangiogenese af hoved- og halscancer. PLoS ONE 7 (8): e44488. doi: 10,1371 /journal.pone.0044488

Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ‘, Italien

Modtaget: 19. april, 2012; Accepteret: August 3, 2012; Udgivet: August 30, 2012 |

Copyright: © Kudo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud-in-Aid fra Ministeriet for uddannelse, videnskab og kultur of Japan (Y. Kudo og T. Takata), en Research Fellowship for Unge Forskere og Excellent Unge Forskere Overseas Besøg Program fra Japan Society for fremme af Science (S. Iizuka), og en Kurozumi Mindefond tilskud (Y. Kudo). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatter Masahiro Maeda er ansat af Immuno-Biological Laboratories, Co, Ltd. ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Millioner af mennesker dør hvert år af metastatisk cancer. Metastase sker via blod eller lymfekar eller direkte i væv og krop hulrum. Selvom de biokemiske mekanismer i metastase er dårligt forstået, er processen menes at være systematisk snarere end tilfældig [1]. Regionale lymfeknuder er ofte de første steder i spredning, formentlig på grund af tumorceller dræning via allerede eksisterende afferente lymfekar og /eller nydannede lymfe kapillærer [2], [3]. Hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) er en af ​​de mest almindelige typer af human cancer, med en årlig incidens på over 500.000 tilfælde på verdensplan [4]. Litteraturen tyder på, at den vigtigste årsag til den høje dødelighed er, at sygdommen ofte ikke diagnosticeres eller behandles, indtil den har nået et fremskredent stadium. Trods aggressiv, tværfaglige behandlingsmetoder, herunder præoperativ eller postoperativ kemoterapi og /eller strålebehandling med rekonstruktionskirurgi, har 5-års overlevelse HNSCC ikke væsentligt forbedret i løbet af de sidste 20 år [5]. Ligesom de fleste andre epiteliale kræftformer, HNSCC udvikler sig i en flertrins proces gennem akkumulering af flere genetiske og epigenetiske ændringer. Den vigtigste prognostiske indikator for HNSCC patienter er metastase til de cervikale lymfeknuder eller fjerntliggende organer [6]. Vi har tidligere etableret en HNSCC cellelinie fra en metastatisk lymfeknude [7] og anvendt en

in vitro

invasion assay for at isolere en stærkt invasiv klon fra denne cellelinie [8]. Vi derefter sammenlignet de transkriptionelle profiler af forældre HNSCC celler og meget invasive klon af microarray analyse og identificeret periostin (osteoblast-specifik faktor 2) som det gen mest udtrykkes forskelligt i den invasive klon [9]. Periostin er et udskilt protein, der er blevet foreslået at fungere som en celleadhæsionsmolekyle for præ-osteoblaster og deltage i osteoblast rekruttering, vedhæftet fil, og spredning [10], [11]. Periostin overekspression forbedret invasion og forankringsuafhængig vækst i HNSCC celler [9]. Interessant periostin-overudtrykkende celler blev aggressivt invasiv og spontant metastaseret til cervikale lymfeknuder og til lungen i en ortotopisk musemodel for HNSCC [9]. Bao et al. også vist, at en coloncancercellelinie med lavt metastatisk potentiale vises påfaldende accelereret tumor metastatisk vækst hos et dyr xenograft model af metastase når manipuleret til at overudtrykke periostin [12]. Disse resultater indikerer, at periostin overekspression kan være fælles i forskellige former for kræft, og at periostin kan være vigtigt for tumor invasion. Periostin er tidligere blevet vist at stimulere metastatisk vækst ved at inducere angiogenese [12], [13] og forbedrer VEGF receptor FLK-1 /KDR ekspression i endotelceller via et integrin avp3-FAK-medieret signalvej [13]; desuden rekombinant periostin øger kapillær dannelse

in vitro

[14]. Vigtigere er, har kliniske studier af periostin ekspression i humane cancere påvist, at øget ekspression af periostin korrelerer med antallet af tumor blodkarrene og med metastase [14]. På den anden side viste tidligere immunhistokemiske undersøgelser en mulig korrelation mellem periostin ekspression og lymfeknudemetastaser i kræfttilfælde [15]. Der er imidlertid ingen undersøgelse om den rolle, periostin i tumor lymfangiogenese. I den foreliggende undersøgelse, demonstrerer vi en ny aktion periostin: direkte og indirekte fremme af tumor lymfangiogenese

Resultater

VEGF-C opreguleret ved periostin overekspression fremmer rør dannelsen af ​​lymfeendotelceller

Vi har tidligere identificeret periostin som en invasion-fremmende faktor ved at sammenligne genekspression profiler af de forælder HNSCC celler (MSCC-1) og en meget invasiv klon (MSCC-INV1) [9] (figur 1A). VEGF-C blev også opreguleret i det stærkt invasive klon af microarray analyse (figur 1A). Øget VEGF-C-ekspression i MSCC-INV1 celler i forhold til moderceller blev observeret (figur 1B). Desuden er der i vores tidligere microarray analyse for at sammenligne genekspressionsprofilen mellem kontrol og periostin-overudtrykkende HNSCC celler blev VEGF-C opreguleret i periostin-overudtrykkende celler [9]. Her bekræftede vi, at ektopisk overekspression af periostin opreguleret VEGF-C-ekspression (figur 1B). Både periostin og VEGF-C blev detekteret i konditioneret medium fra periostin-overudtrykkende celler, men ikke kontrol celler (Figur 1B). VEGF-C er kendt for at være en kritisk aktivator af tumor lymfangiogenese under processen med metastase. Derfor undersøgte vi rør dannelse af lymfatiske endotelceller ved tilsætning konditionerede medier fra tom vektor-transficerede celler eller periostin-overudtrykkende celler til TR-LE-celler. TR-LE-celler blev tidligere etableret som en udødeliggjort rotte lymfatiske endotel cellelinje [16]. Konditionerede medier fra periostin-overudtrykkende celler bemærkelsesværdigt fremmes rør dannelse ved TR-LE-celler (figur 1C og 1D).

(A) Schema viser strategien til at identificere Periostin og VEGF-C ved sammenligning genekspressionsprofilen mellem moderselskabet (MSCC-1 celler) og en meget invasiv klon (MSCC-INV1 celler). (B) Højere ekspression af VEGF-C-mRNA i celler af stærkt invasive klon MSCC-INV1 og VEGF-C-ekspression i periostin-overudtrykkende celler. HSC4 celler uden periostin ekspression blev transduceret ved anvendelse af en retroviral plasmid koder for hexa-histidin-tagget periostin. Periostin og VEGF-C mRNA-ekspressionsniveauer i MSCC-1-celler, MSCC-INV1 celler, tom vektor-transficerede HSC4 celler (tomme) og periostin-overudtrykkende HSC4 celler (His-periostin) blev undersøgt ved RT-PCR. GAPDH udtryk blev anvendt som en loading kontrol. Konditionerede medier blev opsamlet fra tom vektor-transficerede HSC4 celler (tom) og periostin-overudtrykkende HSC4 celler (His-periostin) efter inkubation i 4 dage. Konditionerede medier blev koncentreret og analyseret ved western blotting til ekspression af His-periostin og VEGF-C i konditionerede medier. (C) konditioneret medium fra periostin-overudtrykkende celler fremmer rør dannelse af lymfatiske endotelceller. Tube formation TR-LE-celler ved at tilsætte konditionerede medier fra periostin-overudtrykkende celler. TR-LE-celler podedes på Matrigelcoatede brønde i nærvær af konditioneret medium fra tom vektor-transficerede (kontrol CM) eller periostin-overekspression (periostin CM) HSC4 celler. Efter inkubation i 0-9 timer blev længderne af rørlignende strukturer dannet evalueret. Figuren viser celler efter inkubering i 9 timer. (D) Grafen viser røret scorer efter 0-9 timers inkubation af kontrol CM eller periostin CM. Søjlerne viser de gennemsnitlige værdier og SDS fra 3 uafhængige forsøg.

For at demonstrere effekten af ​​periostin-inducerede VEGF-C-ekspression på dannelse rør, brugte vi VEGF receptor 3 (VEGFR-3) kinaseinhibitor MAZ51, som er rapporteret at blokere både VEGF-C- og VEGF-D-induceret phosphorylering af VEGFR-3 i PAE-celler [17]. TR-LE-celler vides at udtrykke VEGFR-3 [16]. Vi bekræftede, at MAZ51 markant inhiberet VEGF-C-induceret rør-dannelse (Figur S2A og S2B). MAZ51 spænder inhiberede rør induceret af konditioneret medium fra periostin-overudtrykkende celler (Figur S2a og S2b). Inhiberingen af ​​dannelse røret ved MAZ51 i konditioneret medium fra tom vektor-transficerede celler blev også observeret. kan forklares denne inhibering for ved VEGF-C-sekretion fra lymfatiske endotelceller selv. Den inhiberende virkning af MAZ51 var lav i celler behandlet med konditioneret medium fra tom vektor-transficerede celler (figur S2C). Disse resultater viser, at periostin kan fremme lymfangiogenese gennem opregulering af VEGF-C.

Korrelation af periostin udtryk med VEGF-C og lymfe status i tilfælde kliniske kræft

For at bestemme korrelationen mellem periostin og VEGF -C ekspressionsniveauer i sager kliniske kræft, vi sammenlignet periostin udtryk med VEGF-C-ekspression i 54 HNSCC tilfælde af immunhistokemisk analyse. Vi definerede klassificeringen af ​​periostin og VEGF-C-farvning så højt (over 10% af tumorcellerne viser ++ eller +++ intensitet) eller lav (ingen farvning eller mindre end 10% af tumorcellerne viser + intensitet). For kriterium på 10% positive celler, vi overvejet at HNSCC sager med mindre end 10% af tumorcellerne viser svag /omdrejningspunkt immunopositivitet var samme som HNSCC tilfældet med nogen positiv farvning. Figur 2A viser et repræsentativt tilfælde af høj ekspression af både periostin og VEGF-C. Både Periostin og VEGF-C-ekspression blev observeret i cytoplasmaet af HNSCC celler (figur 2A). Således har de fleste tilfælde med høj ekspression af periostin eller VEGF-C udviste stærk og diffus immunopositivitet som vist i figur 2A og de fleste tilfælde med lav ekspression af periostin eller VEGF-C viste ingen immunopositivitet som vist i figur S3A. Kun nogle få tilfælde viste det heterogene farvning (figur S3B). For den heterogene farvning, vi helt evalueret antallet af farvede celler og deres farvningsintensitet ved at kontrollere mindst ti områder, herunder overfladiske, centrale og dybe invasive områder af tumoren. Af de 54 HNSCC tilfælde blev observeret høj ekspression af periostin i 39 (72,2%) tilfælde og høj ekspression af VEGF-C i 37 (68,5%) tilfælde (figur 2B). Tredive-tre af de 39 (84,6%) HNSCC tilfælde med periostin udtryk udtrykte VEGF-C; denne sammenhæng var statistisk signifikant (P 0,001).

(A) Immunohistokemisk farvning for periostin og VEGF-C i HNSCC tilfælde. Repræsentative HNSCC tilfælde (høj og lav forstørrelse) med periostin og VEGF-C-ekspression er vist. Scale bar er vist i hvert billede. (B) Graf viser VEGF-C-ekspression status i HNSCC sager med høj eller lav udtryk for periostin. (C) serumniveau af periostin og VEGF-C i 81 HNSCC patienter blev undersøgt ved ELISA. Serumniveau af periostin og VEGF-C blev sammenlignet med tumor fase. Graf viser procentdel af periostin eller VEGF-C positive tilfælde i forskellige tumor stadie (fra trin 1 til 4). (D) serumniveau af periostin og VEGF-C blev sammenlignet med lymfeknudemetastaser. Grafen viser procentdelen af ​​periostin eller VEGF-C positive tilfælde i tilfælde med eller uden lymfeknudemetastaser (E) serumniveau af periostin blev sammenlignet med serumniveau af VEGF-C. Graf viser procentdelen af ​​VEGF-C positive tilfælde i tilfælde med periostin positiv eller negativ.

Da både periostin og VEGF-C udskilles proteiner, vi undersøgte serumniveauer af periostin og VEGF-C i HNSCC patienter ved ELISA. I denne undersøgelse anvendte vi perifert blod opsamlet fra 81 patienter HNSCC cancer. Disse tilfælde var forskellige fra de tilfælde, der anvendes i immunhistokemisk undersøgelse. Klinisk oplysninger, herunder lymfeknude metastase, tumor scenen og TNM klassifikation blev indsamlet fra kirurgiske optegnelser af patienterne (Tabel S2). I prøver fra 5 raske kontroller, det periostin serumniveau var 0 ng /ml, og VEGF-C serumniveau mindre end 11,0 ng /ml (data ikke vist). Periostin blev fundet på 11,4 ng /ml i konditioneret medie fra MSCC-INV1 celler. Baseret på disse resultater blev en periostin-positive tilfælde defineret som havende et serum periostin niveau 0 ng /mL og et VEGF-C-positive tilfælde som havende et serum VEGF-C-niveau ≥12.0 ng /mL. Procentdelen af ​​periostin-positive tilfælde steget med den fase af progression og med lymfeknudemetastaser (figur 2C og 2D). Dataene på serumniveauer af periostin og VEGF-C og de relevante kliniske data om HNSCC patienter er anført i tabel S2. Procentdelen af ​​VEGF-C-positive tilfælde også forøget med trinnet for progression og med lymfeknudemetastaser (figur 2C og 2D). Interessant, 32,4% af periostin-positive tilfælde, men kun 18,2% af periostin-negative sager VEGF-C-positive (figur 2E).

Periostin direkte fremmer rør dannelse ved lymfeendotelceller

som vist ovenfor, fandt vi, at periostin ekspression korrelerede godt med VEGF-C-ekspression. Periostin er tidligere blevet vist at fremme angiogenese, som påvist af flere resultater: (i) periostin forbedrer VEGF receptor FLK-1 /KDR ekspression i endotelceller via et integrin avp3-FAK-medieret signalvej [13], (ii) rekombinant periostin forbedrer kapillærdannelse [12], og (iii) forøget ekspression af periostin er korreleret med antallet af blodkar og med metastase i HNSCC [14]. På den anden side viste klinisk-patologiske undersøgelser at periostin var godt korreleret med lymfeknudemetastaser i forskellige cancere [15]. Disse fund gjort os hypotesen, at periostin kan påvirke direkte til lymfeendotelceller i lighed med vaskulære endotelceller. Derfor har vi undersøgt, om periostin direkte kan fremme lymfangiogenese. Vi undersøgte virkningen af ​​periostin på dannelse rør af TR-LE-celler. I tidligere rapporter, 100 ng /ml rekombinant periostin protein blev brugt til

in vitro

eksperimenter [12], [13]. Shao et al. undersøgt Flk1 ekspression efter behandling med rekombinant periostin (0, 50, 100 og 250 ng /ml). Som 100 ng /mL periostin bemærkelsesværdigt opreguleret Flk1 udtryk, de brugte 100 ng /mL periostin i deres studier. I vores ELISA-analyse, vi har registreret 11,4 ng /mL periostin i konditioneret medie fra MSCC-INV1 celler. Desuden har vi opdaget 0-15,1 ng /mL periostin i serum fra HNSCC patient (tabel S2). Selvom 100 ng /mL periostin synes at være høj koncentration, troede vi, at koncentrationen af ​​periostin kan være højere i lokal tumor område end i serum. Desuden fandt vi, at periostin fremmes rør-dannelse i en koncentrationsafhængig måde (0, 50, 100 og 200 ng /ml) (figur S4), og virkningen af ​​100 ng /ml periostin på dannelse rør er bemærkelsesværdig (figur 3A -C og figur S4). Selvom 100 ng /ml periostin synes at være højere i sammenligning med fysiologisk niveau, anvendte vi 100 ng /ml periostin i følgende undersøgelser. 100 ng /ml VEGF-C blev anvendt som en positiv kontrol for lymfangiogenese. I forskellige undersøgelser, 100 ng /ml VEGF-C blev anvendt til

in vitro Salg eksperimenter [18] – [20]. Interessant behandling med rekombinant periostin fremmes kanaldannelse i forhold til ingen behandling (figur 3A og 3B). Overraskende er virkningen af ​​periostin på dannelse rør svarede til den af ​​VEGF-C (figur 3C). Endvidere co-behandling med periostin og VEGF-C markant fremmet rør-dannelse (figur 3D og 3E).

(A) TR-LE-celler podedes på Matrigelcoatede brønde i nærvær af periostin (100 eller 200 ng /ml) eller VEGF-C (100 ng /ml). Efter inkubation i 1-9 timer blev længderne af rørlignende strukturer dannet evalueret. Figuren viser celler efter inkubering i 9 timer. (B) Grafen viser røret scorer efter inkubation i 1-9 timer. Søjlerne viser de gennemsnitlige værdier og SDS fra 3 uafhængige forsøg. (C) Grafen viser de rør score nøgletal efter behandling med VEGF-C eller periostin i 9 timer. Røret score af kontrol blev defineret som 1,0. (D) TR-LE-celler podedes på Matrigelcoatede brønde i nærvær af periostin (100 ng /ml) og VEGF-C (100 ng /ml). Efter inkubation i 1-9 timer blev længderne af rørlignende strukturer dannet evalueret. Grafen viser røret score efter inkubation i 1-9 timer. Søjlerne viser de gennemsnitlige værdier og SDS fra 3 uafhængige forsøg. (E) Grafen viser de rør score nøgletal efter behandling med VEGF-C og periostin i 9 timer. Røret score af kontrol blev defineret som 1,0. (F) Periostin fremmer Src og Akt fosforylering. Niveauer af total og phosphorylerede former af Src, Akt, ERK, og FAK efter behandling af TR-LE-celler med periostin (100 ng /ml) vist ved western blotting. p-actin-ekspression blev anvendt som en loading kontrol. (G) Længderne af rørlignende strukturer dannet af TR-LE-celler inkuberet i 1-9 timer med rekombinant periostin (100 ng /ml) med eller uden SU6656 (400 nM) blev evalueret. Den øverste graf viser røret scorer efter inkubation i 1-9 timer. Søjlerne viser de gennemsnitlige værdier og SDS fra 3 uafhængige forsøg. Det nederste diagram viser røret score ratio. Røret score af kontrol blev defineret som 1,0. (H) Længderne af rørlignende strukturer dannet af TR-LE-celler inkuberet i 1-9 timer med rekombinant periostin (100 ng /ml) med eller uden LY294002 (10 uM) blev evalueret. Den øverste graf viser røret scorer efter inkubation i 1-9 timer. Søjlerne viser de gennemsnitlige værdier og SDS fra 3 uafhængige forsøg. Det nederste diagram viser røret score ratio. Røret score af kontrol blev defineret som 1,0.

Vi undersøgte hvordan periostin fremmer lymfangiogenese ved anvendelse af Western blotting med phosphoryleringsafhængige antistoffer til bestemmelse af aktivitetsniveauer af celle-signalmolekyler, såsom Src, Akt, ERK og FAK, i periostin-behandlede TR-LE-celler. Src og Akt men ikke ERK og FAK blev aktiveret ved rekombinant periostin behandling (figur 3F). For at bekræfte rolle Src og Akt i periostin forfremmet lymfangiogenese, brugte vi SU6656 til at hæmme Src aktivitet og LY294002 at hæmme Akt aktivitet. Disse kinase hæmmere hæmmede periostin-induceret rør dannelse ved TR-LE-celler (figur 3G og 3H), tyder på, at periostin-induceret lymfangiogenese kan medieres af Src og Akt aktivitet.

Dernæst undersøgte vi effekten af ​​periostin på proliferation og migration af TR-LE-celler. Rekombinant periostin kun lidt fremmet cellevækst (figur 4A), men i høj grad fremmet migration (figur 4B). Focal adherens, som er klynger af integriner med ophobning af flere cytoskeletal og signaler proteiner rundt integrinet cytoplasmatiske domæner, få væsentlig indvirkning på celle migration og signalering. Derfor undersøgte vi effekten af ​​periostin på dannelsen af ​​fokale sammenvoksninger. Vi podet trypsiniseret TR-LE celler på dækglas overtrukket med PBS eller rekombinant periostin og farvet for fokale sammenvoksninger med anti-vinculin antistof og for F-actin med phalloidin. TR-LE-celler effektivt fastgjort og hurtigt genvundet deres morfologi på periostin-coatede dækglas sammenlignet med PBS-overtrukne dækglas (figur 4C). Især TR-LE-celler dannede talrige vinculin-holdige fokale adhæsioner på periostin-coatede, men ikke de PBS-overtrukne dækglas (figur 4C). Forstærkning af rør dannelse ved periostin kan påvirkes af fremme af migration og øgede fokale sammenvoksninger.

(A) spredning af TR-LE celler efter rekombinant periostin behandling. Celler blev podet på fibronectincoatede plader med 24 brønde ved 1,5 x 10

4 /brønd. Efter præinkubation ved 33 ° C i 24 timer blev temperaturen ændret og rekombinant periostin (100 ng /ml) blev tilsat til mediet. Cellerne blev trypsiniseret og talt 0, 2, 4 eller 6 dage efter tilsætningen af ​​rekombinant periostin. Søjlerne viser de gennemsnitlige værdier og SDS fra 3 uafhængige forsøg. (B) Effekten af ​​periostin på celle migration af TR-LE-celler. Celler blev podet på filtre pre-coatet med 10 ug af fibronectin. Det nedre rum indeholdt 0,5 ml serum-frit medium med eller uden 100 ng /ml rekombinant periostin. Efter inkubering i 4 timer blev celler, der var migreret til de nedre overflader af filtrene visualiseret ved hæmatoxylin-farvning og talt. Assayet blev gentaget 3 gange. Figuren viser celler, der var migreret til den nedre overflade af filteret (øvre panel). Grafen viser antallet af celler på de nedre overflader af filtrene med eller uden periostin (100 ng /mL) (nedre panel). (C) TR-LE-celler blev podet på dækglas overtrukket med PBS eller rekombinant periostin (200 ng /ml) og fik lov til at fæstne sig i 60, 120, 180, eller 240 min. Cellerne blev farvet med Alexa Fluor 488-phalloidin-antistof og anti-vinculin-FITC-antistof. DNA blev visualiseret ved 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) farvning.

Periostin udtryk korrelerer godt med antallet af lymfatiske endotelceller i kliniske cancer prøver

Til kender rolle periostin i tumor lymfangiogenese

in vivo

, bekræftede vi korrelationen mellem periostin ekspression og antallet af lymfekar i en tumor xenograft model i nøgne mus. Vi har tidligere injicerede kontrol- eller periostin overudtrykker HNSCC celler subkutant i nøgne mus og fandt, at transplanterede periostin-overudtrykkende celler produceret forholdsvis større tumorvolumen efter 28 dage end gjorde tom vektor-transficerede celler [9] (Figur S5). Vi anvendte disse tumorvæv (10 Kontrol og 10 periostin-overudtrykkende tumorer) til at tælle antallet af lymfekar udtrykker Lyve-1, som specifikt blev observeret i lymfekar i både kontrol- og periostin-overudtrykkende tumorer (figur 5A og figur S4). Interessant, at antallet af lymfekar var signifikant højere i periostin-overudtrykkende tumorer (36,3 ± 11,1) end i kontroldyr tumorer (14,95 ± 2,0) (figur 5B).

(A) Periostin-overekspression (periostin) og tom vektor-transficerede (kontrol) HSC2 celler (1 x 10

7 celler) blev individuelt injiceret subkutant på 2 steder i hver af 5 nøgne mus. Efter 1 måned blev tumorerne resekteret og farvet med et anti-muse Lyve-1 antistof, der genkender lymfekar. Repræsentative tilfælde af immunhistokemisk farvning for Lyve-1 i kontrol og periostin-overekspression tumorer vises. Pil viser Lyve-1-positive lymfekar. (B) De Lyve-1-positive lymfekar i kontrol- og periostin-overudtrykkende tumorer blev talt. Grafen viser de gennemsnitlige antal lymfekar i kontrol og periostin-overekspression tumorer. Søjlerne viser de gennemsnitlige værdier og SDS.

Endelig har vi undersøgt sammenhængen mellem periostin udtryk og lymfe status i HNSCC sager ved immunhistokemi hjælp af D2-40 antistof. Den D2-40 antistof specifikt genkendes lymfatiske endotelceller, men ikke blodkar (data ikke vist). Lymfekar blev ulige fordelt i hele tumorer. Vi talte antallet af lymfekar i intratumoral (inden for tumor) og peritumoral (inden for 1 mm fra de invasive forreste) områder. HNSCC tilfælde med periostin ekspression tendens til at have større antal af lymfekar i både intratumoral og peritumorale områder (figur 6A og 6B), men dette korrelation var ikke statistisk signifikant. Som forventet fremhævet D2-40 immunfarvning tilstedeværelsen af ​​lymfatisk invasion. Af 54 HNSCC tilfælde, 27 (50%) udviste lymfekar invasion ved tumorceller. Påfaldende blev periostin ekspression observeret i 25 ud af 27 HNSCC tilfælde med lymfatisk invasion (figur 6C). Periostin udtryk var signifikant korreleret med lymfatisk invasion (

P

0,001).

(A) Periostin og D2-40 ekspressionsniveauerne blev undersøgt af immunhistokemisk farvning af HNSCC case prøver. vises et repræsentativt tilfælde af periostin og D2-40 udtryk i HNSCC. Pil viser D2-40 positive lymfekar. (B) Grafen viser sammenligningen mellem de gennemsnitlige antal lymfeknuder fartøjer i intratumoral, peritumoral og samlede areal i HNSCC sager med høj eller lav udtryk for periostin. (C) Grafen viser status af lymfatisk invasion i HNSCC sager med høj eller lav ekspression af periostin.

Diskussion

Den overordnede 5-årige overlevelsesrate for HNSCC, en af de mest almindelige kræftformer, er lav, skyldes i høj grad tilbøjelighed nogle svulster til at formidle via lymfekarrene. Faktisk lymfekirtelinvolvering er en af ​​de stærkeste dårlige prognostiske indikatorer. Nylige undersøgelser under anvendelse af dyremodeller tyder på, at faste tumorer kan inducere lymfangiogenese der igen kan fremme tumorspredning [21]. Desuden kan lymfangiogenese forekomme siden af ​​eller i cancere og korrelerer med lymfeknudemetastaser [22], [23]. Vi har tidligere vist, at antallet af lymfekar i både intratumorale og peritumorale områder var godt forbundet med en øget tendens til, nodal metastase i HNSCC [24]. Mens lymfangiogenese i primære tumorer er kendt for at forudsige nodal metastase, dens mekanisme er stadig uklar.

Vi tidligere identificeret periostin som en invasion-fremmende faktor ved at sammenligne genekspressionsprofilerne af moder- og stærkt invasive klon HNSCC celler [9] . Periostin, oprindeligt kaldt osteoblast-specifik faktor-2 (Osf2), blev først identificeret i knogler, hvor det blev impliceret i reguleringen osteoblast vedhæftning og differentiering [10], [25]. Kumulative beviser for, at høj ekspression af periostin ofte observeres i forskellige cancerformer og korrelerer godt med maligne opførsel [15]. For nylig har periostin blevet afsløret at stimulere metastatisk vækst ved at inducere angiogenese [13], [14]. Periostin udskilles af tumorceller handlinger i en parakrin måde for at forøge overlevelsen af ​​endotelceller og inducerer neovaskularisering, overensstemmelse med den opfattelse, at en øget overlevelse af intratumorale endotelceller er kritisk for vellykket tumorangiogenese [26] – [28]. Vores tidligere microarray analyse af forælder og stærkt invasive klon HNSCC celler fundet, at VEGF-C blev opreguleret i de meget invasive celler [9] (figur 1A og 1B). Faktisk periostin overekspression inducerede opregulering af VEGF-C-ekspression i HNSCC celler, og VEGF-C-protein blev udskilt fra periostin-overudtrykkende HNSCC celler (Figur 1B). VEGF-C, den oprindelige Flt-4 /VEGFR-3 ligand [29], [30], er et medlem af VEGF-familien af ​​polypeptid-vækstfaktorer, som omfatter VEGF-A, -B, -C, -D og parapoxvirus Orf virus VEGF’erne [31], [32]. Baseret på dets ekspression profil og dens binding til Flt-4, har VEGF-C blevet impliceret i udviklingen af ​​lymfesystemet [33], [34]. Desuden transgen overekspression af VEGF-C under keratin 14-promotoren inducerer lymfe udvidelse fartøj i huden [35], og rekombinant VEGF-C inducerer lymfangiogenese i kyllingechorioallantoinmembranen [36]. Aktivering af VEGF-C /Flt-4 akse i lymfatiske endotelceller kan lette metastase ved at øge dannelsen af ​​lymfekar i og omkring tumorer [37]. VEGF-C /Flt-4 akse udtrykkes derfor ikke kun af lymfatiske endotelceller, men også af en række humane tumorceller. Som vi forventede, konditioneret medie fra periostin-overekspression HNSCC celler fremmes rør dannelse af lymfatiske endotelceller. Desuden VEGFR-3-kinase-inhibitor inhiberede røret induceret af konditioneret medium fra periostin-overudtrykkende celler, hvilket antyder, at periostin-fremmet lymfangiogenese kan til dels skyldes øget sekretion af VEGF-C fra cancerceller (fig S2B). Ved brug af kliniske prøver, vi demonstreret, at periostin ekspression korrelerede godt med VEGF-C-ekspression i HNSCC tilfælde ved immunohistokemi og at serum periostin niveau korrelerede godt med den af ​​VEGF-C i HNSCC patienter (Figur 2E). I denne undersøgelse, kunne vi ikke finde periostin i serum fra 5 normale raske frivillige. Tidligere rapporter har vist, at vilde række serum periostin (0,2-194 ng /ml) blev påvist hos normale raske frivillige [35] – [38]. Således serum niveau af periostin i normale raske frivillige synes at være kontroversiel, og det er stadig uklart, om periostin produceres af normale celler eller ej. I fremtiden vil vi undersøge serum niveau af periostin i det store antal af normale raske frivillige. Men alle rapporter, herunder den nuværende undersøgelse viste, at øget niveau af periostin blev observeret hos kræftpatienter [38] – [41]. Vigtigere, serumniveau af periostin og VEGF-C var godt korreleret med tumorudvikling, herunder lymfeknudemetastase.