PLoS ONE: Kræft Cell Migration: Integrerede roller Matrix Mechanics and Transforming potentiale

er opnået

Abstrakt

betydelige fremskridt i retning af at belyse de molekylære mekanismer, der ligger til grund for brystkræft progression; endnu, langt mindre om de tilknyttede cellulære biofysiske træk. Til dette formål bruger vi tid-bortfaldet konfokalmikroskopi at undersøge samspillet mellem celle motilitet, tre-dimensionelle (3D) matrix stivhed, matrix arkitektur, og omdanne potentiale i en mamma epitelcelle (MEC) kræft progression serien. Vi bruger en velkarakteriseret brystkræft progression model, hvor human-afledte MCF10A MEC’er overudtrykke enten ErbB2, 14-3-3ζ, eller begge ErbB2 og 14-3-3ζ, med tom vektor som en kontrol. Cellemotilitet assays viste, at MEC’er overudtrykker ErbB2 alene udviste bemærkelsesværdig høj migration hastigheder ved dyrkning oven todimensionale (2D) matricer, mens overekspression af 14-3-3ζ alene mest undertrykt migration oven 2D matricer (sammenlignet med ikke-transformerede MEC’er). Vores resultater antyder også, at co-overekspression af 14-3-3ζ og ErbB2 proteiner letter celle vandrende kapacitet i 3D matricer, som afspejlet i celle migration hastighed. Derudover kan 3D-matricer af tilstrækkelig stivhed betydeligt hæmme vandrende evne delvist transformerede celler, men steg 3D matrix stivhed har en mindre effekt på den aggressive vandrende adfærd udvist af fuldt transformerede celler, der co-overudtrykke både ErbB2 og 14-3-3ζ. Endelig denne undersøgelse viser, at for MEC’er besidder delvis eller fuld transformerende potentiale, der overudtrykker ErbB2 alene viser den største følsomhed cellemigration hastighed til matrix arkitektur, mens de overekspression 14-3-3ζ alene udviser den mindste følsomhed over for matrix arkitektur. I betragtning af den nuværende viden om brystkræft mechanobiology, disse resultater generelt tyder på, at celle motilitet styres af et komplekst samspil mellem matrix mekanik og omdanne potentiale

Henvisning:. Baker EL, Srivastava J, Yu D, BONNECAZE RT, Zaman MH (2011) Cancer Cell Migration: Integrerede roller Matrix mekanik og Transforming Potentiale. PLoS ONE 6 (5): e20355. doi: 10,1371 /journal.pone.0020355

Redaktør: Donald Gullberg, Universitetet i Bergen, Norge

Modtaget: 9. februar 2011; Accepteret: 19. april, 2011; Udgivet: May 27, 2011

Copyright: © 2011 Baker et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev muliggjort af de Forenede Negro College Fund (UNCF) /Merck Graduate Science Research afhandling Fellowship til ELB, den filantropisk Educational Organization (PEO) Scholar Award til ELB, Charles Tate Foundation UT Seed Grant til MHZ og DY, og National Institutes of Sundhed finansiering (1R01CA132633) til MHZ. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

størstedelen af ​​brystkræft dødsfald skyldes metastatiske tumorer; således, at forstå samspillet mellem det cellulære mikromiljø og brystkræft metastatisk potentiale er kritisk vigtigt for udviklingen af ​​effektive behandlinger for denne sygdom. Der er gjort betydelige fremskridt i retning af at afsløre de molekylære mekanismer, der ligger til grund for brystkræft progression [1], [2]; dog kvantitativ karakterisering af de tilknyttede cellulære biofysiske egenskaber forbliver ufuldstændig. Fundamentalt er metastase forløber via migration og invasion af cancerceller gennem variabel ekstracellulære matrix (ECM) miljøer, og undersøgelser vist, at cellemigrering er faktisk følsom til matrix mekaniske egenskaber [3], [4], [5]. Men systemerne niveau sammenhænge mellem matrix mekanik, sygdomsprogression og celle motilitet i brystkræft er ikke godt forstået, navnlig med hensyn til fysiologisk relevante tredimensionale (3D) matrix-miljøer.

I de seneste to årtier , centrale brystkræft biomarkører er blevet identificeret og knyttet til bestemte stadier af sygdommen. To bemærkelsesværdige faktorer er ErbB2 (HER2 /neu) og 14-3-3ζ proteiner, som begge hvis overekspression er korreleret med dårlige kliniske prognose for brystkræftpatienter [6], [7]. ErbB2 og 14-3-3ζ har tilsvarende vist sig at inducere cellulære funktioner in vitro, der er sammenlignelige med de kliniske præsentationer. ErbB2 er en transmembran receptortyrosinkinase af den epidermale vækstfaktor receptor familie af proteiner og er involveret i flere signaleringsveje som modulerer cellevækst, differentiering, apoptose, og andre kritiske cellulære processer [8]. Analogt har MEC’er der er manipuleret til at overudtrykke ErbB2 vist sig at udvise hyperplasi og luminale påfyldning i 3D kultur, dog ikke fuld transformation og invasion [9], [10]. ErbB2 er utvivlsomt en af ​​de mest undersøgte molekyler i området for brystcancer [11] og er en kritisk mål for lægemiddeludvikling. Faktisk givet sin evnen til at give resistens over for visse former for kræft terapi og dens prognostisk værdi, fastlæggelsen af ​​sin status med hensyn til nydiagnosticerede brystkræfttilfælde er blevet en standard praksis [12]. Påfaldende er ErbB2 protein overudtrykt i over 50% af tidlige fase non-invasiv brystkræft (duktalt carcinoma in situ, DCIS) [13]; Men det er overudtrykt i kun ca. 25% af senere stadier invasive og metastatiske brystcancere [7]. Forklaring af disse tilsyneladende inkonsistente ErbB2 udtryk profiler har unddraget forskere til dato; Men resultaterne rapporteret her tyder på, at dette fænomen kan forklares delvist af en mamma epitelcelle (MEC) følsomhed over for matrix arkitektur.

14-3-3ζ protein tilhører en større familie af syv 14- 3-3 regulatoriske proteiner, der er bredt udtrykt, og involveret i en række cellulære homeostatiske processer, herunder en generel celleoverlevelse /anti-apoptotisk mekanisme [14]. Det er blevet vist, at overekspression af 14-3-3ζ giver MEC’er i 3D kultur med en betydelig modstand mod anoikis [15] (en type af apoptose, der opstår, når epitelceller løsnes fra ekstracellulære ligander), som fremmer luminale påfyldning og driver MEC’er dybt transformation [16]. Overekspression af 14-3-3ζ har også vist sig at inducere bemærkelsesværdige morfologiske træk ved epitel-mesenkymale overgang, som er karakteristiske for udvikling hen imod en invasiv fænotype [9], [15], [17]. Endvidere analyser af patientens biopsier viser, at over 40% af metastatiske brystcancere overeksprimerer dette protein [6]. På trods af deres evner til at skænke ikke-transformerede celler med onkogene egenskaber, overekspression af hverken ErbB2 eller 14-3-3ζ alene er tilstrækkeligt til at give et komplet transformation in vitro. Men deres kooperative overekspression er blevet vist, at fremme progression fra ikke-invasiv carcinoma til invasiv cancer in vitro og er også forbundet med progression af DCIS til invasive og metastatisk brystkræft hos patienter [9].

Da tidligere etablerede korrelationer mellem brystkræft biomarkører og metastatisk progression samt den aktuelle viden om substrat-afhængig celle motilitet og celle-matrix interaktioner, forbliver ubesvaret for individuelle MEC’er med hensyn til matrix mekanik følgende grundlæggende spørgsmål: (1) Er MEC motilitet reagerer på 3D matrix stivhed? (2) Er dette lydhørhed relateret til transformerende potentiale? Og (3), er der en sammenhæng mellem celle motilitet og omdanne potentiale, givet en beslutsom matrix arkitektur? I denne undersøgelse har vi kvantitativt undersøgt disse spørgsmål ved at anvende tidsforkortet konfokal mikroskopi for at undersøge virkningen af ​​matrix stivhed og arkitektur om migration hastighed og persistens af individuelle MEC’er der er dyrket oven 2D matricer og dem, der er indlejret i 3D matricer med forskellig elastisk moduli. Vi undersøgte humant afledte MEC’er af varieret transformerende potentiale med hensyn til matrixer formuleret ud fra nativt Type I kollagen, som er den primære strukturelle komponent af bryst-stroma. Vores undersøgelser tilvejebringe nye indsigter i brystkræft mechanobiology ved at påvise, matrix stivhed og arkitektur par med at omdanne potentiale til at styre de migrerende evner MEC’er.

Resultater

For at udforske forholdet mellem brystkræft transformerende potentiale og cellemotilitet i forhold til matrix mekanik, analyserede vi en velkarakteriseret cancer progression serie etableret fra ikke-transformerede, humanafledt MCF10A cellelinie. Vi undersøgte fire MCF10A underlinjer, hvis omfanget af transformerende potentiale er karakteriseret ifølge deres vækst træk og morfologiske træk, når der dannes acinære strukturer i 3D kultur [9]. Som tidligere beskrevet [9], [17], de underlinjer (fig. 1

A

) bestod af [1] 10A.vec-en ikke-transformeret kontrol cellelinie, [2] 10A.ErbB2-a hyperplastisk, apoptose-resistent delvist transformeret cellelinie, der overudtrykker ErbB2, [3] 10A.14-3-3ζ-en depolariseret, apoptose-resistente, og morfologisk abnorme delvist transformeret cellelinie, der overudtrykker 14-3-3ζ, og [4] 10A.ErbB2.ζ-en invasiv, fuldt transformeret cellelinie, der overepxresses både ErbB2 og 14-3-3ζ.

(

A

) Ductal /enkelt lap i tværsnit af MCF10A bryst kræft progression serien: 10A.vec (ikke-transformeret), 10A.ErbB2 (delvist omdannet), 10A.14-3-3ζ (delvist omdannet), og 10A.ErbB2.ζ (fuldt forvandlet). (

B

) Mean cellemigration hastighed

S

oven 2D matricer; p-værdier er med hensyn til

S

af 10A.vec celler. (

C

) Cell befolkning vedholdenhed tid

P

toppen 2D matricer (gennemsnit

R

= 0,87). Alle p-værdier. (*, P ≤ 0,05, **, p≤0.01, ***, p≤0.001) bestemmes ud fra

t

-tests for uparrede prøver

effekt af transformerende potentiale på cellemotilitet oven 2D matricer

cellemotilitet blev først undersøgt i forhold til 2D matrix arkitektur, der er analog med MEC lag i indre overflade af duktalt basalmembranen i den indledende fase af invasion i den underliggende kollagen i-rig stroma in vivo (fig. 1

A

). I dette miljø, MEC’er overudtrykker ErbB2 alene migreret med den hurtigste gennemsnitshastighed

S

(Fig. 1

B

). Ikke-transformerede celler udviste den næsthøjeste grad af motilitet, efterfulgt af underlinjer overekspression 14-3-3ζ (fig. 1

B

). Todimensionale motilitet mønstre af delvist transformerede og fuldt transformerede celler også i overensstemmelse med transwell motilitet adfærd, der tidligere er blevet rapporteret: 10A.ErbB2 celler flyttes med de højeste hastigheder, efterfulgt af 10A.ErbB2.ζ og derefter af 10A.14-3 -3ζ [9]. Persistens tid

P

(opnået fra kurvetilpasning til den vedvarende random walk model [18], se Materialer og fremgangsmåder) af ikke-transformerede celler var større end den af ​​alle underlinjer besidder transformerende potentiale (fig. 1

C

).

Effekt af transformerende potentiale på celle motilitet i 3D matricer

Dernæst celle motilitet blev vurderet i forhold til 3D matrix arkitektur, der er analog med in vivo miljø, hvor genetisk ændret (delvist eller fuldstændigt transformerede) celler har invaderet deres lokale basalmembran og trængte ind i den underliggende stroma (fig. 1

A

). Cell motilitet analyser viste, at omdanne potentiale haft en bemærkelsesværdig effekt på migration hastighed

S

inden for forholdsvis kompatible 3D-matricer (fig. 2

A,

stivhed

G

‘

c

= 104 Pa). Ikke-transformerede MEC’er (10A.vec) udstillet den langsomste gennemsnitshastighed, mens fuldt transformerede MEC’er (10A.ErbB2.ζ) migrerede med den hurtigste hastighed (fig. 2

B

). MEC’er overeksprimerer ErbB2 eller 14-3-3ζ alene, selvom delvist forvandlet, viste ikke en bemærkelsesværdig ændring i motilitet i forhold til 10A.vec celler (Fig. 2

B

) i kompatible 3D-matricer. Desuden migration hastighed

S

i overensstemmende matricer negativt korreleret med kugleform cellemorfologi indeks

Ψ

som vi tidligere rapporteret af disse underlinjer ved dyrkning i de samme 3D matricer [17]. Som vist i fig. 2

B Hotel (indsat) [17],

Ψ

falder som

S

stiger, ifølge MEC transformation profil. I kompatible matricer, cellepopulation vedholdenhed tid

P

var lavest for fuldt invasive celler (fig. 2

E

).

(

A

) Scanning elektronmikrofotografier af kompatible (104 Pa) og stive (391 Pa) 3D matricer; skala bar er 2 um. (

B

) Mean cellemigration hastighed

S

i kompatible 3D-matricer. (Indsat) celle kugleform

Ψ

som taget fra Baker et al. [17]; p-værdier er med hensyn til

S

(Og

Ψ

) i 10A.vec celler. (

C

) Mean cellemigration hastighed

S

i stive 3D matricer; p-værdier er med hensyn til

S

af 10A.vec celler. (

D

) Procent fald i

S

af celler i overensstemmende matricer forhold til celler i stive matricer. De p-værdier, der er vist i sort afspejler forskellen i

S

mellem celler i overensstemmende matricer og de samme celler i stive matricer; p-værdierne, der er vist i rødt afspejle forskellen i% fald i

S

blandt underlinjer. (

E

) Cell befolkning vedholdenhed tid

P

i kompatible og stive 3D-matricer (gennemsnit

R

= 0,87). (

F

) Procent fald i

S

af celler oven 2D matrixer forhold til celler inden overensstemmende 3D matricer. De p-værdier, der er vist i sort afspejler forskellen i

S

mellem celler atop 2D matricer og de samme celler inden overensstemmende 3D matricer; p-værdierne, der er vist i rødt afspejle forskellen i% fald i

S

blandt underlinjer. Alle p-værdier. (*, P ≤ 0,05, **, p≤0.01, ***, p≤0.001) bestemmes ud fra

t

-tests for uparrede prøver

Effekt af 3D matrix stivhed på celle motilitet

i relativt stivere 3D-matricer (fig. 2

En

, stivhed

G

‘

c

= 391 Pa ), cellemotilitet assays afslørede en adfærd signifikant forskellig fra den observeret i overensstemmende matricer. I det stivere matrix miljø, fuldt transformerede MEC’er migrerede hurtigere end alle andre underlinjer (fig. 2

C

). Men delvist transformerede celler (10A.ErbB2 og 10A.14-3-3ζ) migrerede især langsommere end både ikke-transformerede og fuldt transformerede celler. Skiftet i celle motilitet mellem kompatible og stive matricer er yderligere vist som en procent nedgang i migration hastighed, ifølge transformation profil (fig 2

D

.); denne afbildning viser, at blandt de underlinjer hvis migration hastighed var følsom for 3D matrix stivhed, blev motiliteten af ​​fuldt transformerede celler mindst påvirket af stigningen i matrix stivhed. I forhold til celler i kompatible 3D-matricer, celle vedholdenhed tid

P

i stive 3D-matricer (fig. 2

E

) var lavere for celler besidder delvis eller fuld transformerende potentiale, men især højere for ikke-transformerede celler (10A.vec).

integrerede effekter af matrix arkitektur, matrix stivhed, og omdanne potentiale på celle motilitet

Sammenligning migration hastigheder på celler toppen 2D matricer til dem indlejret i lignende 3D matricer viser, at matrix-arkitektur har en signifikant effekt på celle motilitet. Figur 2

F

skildrer dette skift i motilitet som en procent nedgang i hastigheden af ​​celler oven 2D matricer i forhold til dem inden kompatible (104 Pa) 3D matricer. Faktisk er motilitet i 3D matricer væsentligt reduceret for alle celle underlinjer undersøgte; Men af ​​de underlinjer besidder delvis eller fuldstændig transformerende potentiale, celler, der overudtrykker ErbB2 alene (10A.ErbB2) viste den største følsomhed over for matrix arkitektur. Den 10A.ErbB2 delområde oplevet en betydelig 94% reduktion (15 gange reduktion) i celle migration hastighed når i 3D-matricer sammenlignet med, at når disse celler blev knyttet til 2D matricer.

Undersøgelse af 3D Windrose plots ( fig. 3) giver en bred, resumé billede af vandrende karakter udstillet af denne MCF10A progression serie (rækker repræsenterer matrix tilstand, mens kolonner repræsenterer delområde).

XY

-plane konfokale billeder (fig. 4) viser også typiske repræsentative celler og morfologiske træk udstillet af hver af de fire underlinjer, som kan bære en vis association til vandrende data præsenteret her, samt celle stivhed fund, vi har rapporteret tidligere [17]. MECS overekspression 14-3-3ζ alene udstillet rørformede-formede fremspring (fig. 4, grønne pile) [19] på tværs af alle matrix betingelser, mens de co-overekspression både ErbB2 og 14-3-3ζ udstillet tynde, stang-lignende udvidelser ( fig. 4, gule karat) for alle matrix betingelser. Celler, der overudtrykker ErbB2 alene viste minimal stavlignende udvidelser og kun når indlejret i relativt stive (391 Pa) matricer, mens de resterende MEC underlinjer viste lignende grader af fremspring i begge overensstemmende og stive matricer. De hurtigste migrerende celler på 2D matricer (10A.vec og 10A.ErbB2) udstillet ark-lignende cellulære processer i dette miljø (Fig 4, blå parentes.)

Top række lister cellelinje.; venstre kolonne viser matrix tilstand. Celler i 2D matricer udstillet den højeste grad af motilitet, efterfulgt af celler i kompatibel (104 Pa) 3D matricer og derefter af celler i stiv (391 Pa) 3D matricer

Top række lister cellelinje.; venstre kolonne viser matrix tilstand. Gule karat indikerer tynde, stang-lignende cellulære processer. Grønne pile angiver rørformet cellulære fremspring. Blå parentes angiver ark-lignende cellulære fremspring.

Diskussion

Cell motilitet kan være påvirket af en række parametre, herunder ekstracellulære kemiske gradienter [20], matrix mekaniske egenskaber [4] , matrix nedbrydning [21], intracellulær kontraktilitet [5], og celle klæbeevne [22]. I stigende grad er kræftceller blevet genstand for undersøgelser, der udforsker effekten af ​​det ekstracellulære miljø på cellulære homeostase [4], [23], cellulære viskoelasticitet [24], [25], og celle motilitet. Selv om der er gjort betydelige fremskridt med at afdække nogle af de molekylære mekanismer og signalveje, der ligger til grund for brystkræft og andre kræftformer [8], [14], meget mindre om de tilknyttede cellulære biofysiske egenskaber. Det har længe været fastslået, at brystcancer metastase fundamentalt udføres af cellemigrering fra en primær tumormasse gennem det underliggende stroma, og at brystet kollagendensitet er korreleret med brystkræft progression [26]. Desuden kan cancercelle vandrende kapacitet være påvirket af stivheden af ​​ECM [5]. Imidlertid er forholdet mellem den eksterne cellulære mekaniske miljø og motilitet brystcancerceller ikke forstået. Samspillet mellem disse parametre er yderligere forvirret af den fase af brystkræft progression og kan også forsynes med relation til intracellulære mekaniske egenskaber [17]. For at undersøge samspillet mellem matrix mekanik, celle motilitet, og omdanne potentiale i brystkræft, har vi udnyttet tid-bortfaldet konfokalmikroskopi at måle migration hastighed og vedvarende MEC’er der er knyttet til 2D matricer, og dem, der er indlejret i 3D matricer, begge bestående af nativt type i collagen. Ved at undersøge en brystkræft progression række underlinjer der stammer fra en enkelt MEC forælder linje, er vi i stand til direkte at sammenligne kinesis af celler, der besidder varierende transformerende potentiale.

in vivo ekstracellulære mikromiljø er en heterogen medium, der består af flere komponenter, med den relative balance og betydningen af ​​disse komponenter afhængigt af omfanget af cancer progression. I denne undersøgelse har vi undersøgt motilitet MEC’er der har kapacitet til frit navigere deres ECM. For tilfældet med 3D matricer, dette er fysiologisk bedst kan sammenlignes med individuelle MEC’er der har invaderet deres lokale duktal basalmembran og kan migrere inden det underliggende stroma (figur 1

A

.); for tilfældet med 2D matrixer, er dette mest analog med tidlige stadie cancerceller, der kan udvise forøget motilitet langs den indre duktal basalmembranen i den indledende fase af invasion ind i den underliggende collagen I-rig stomi (fig. 1

A

). Vi undersøgte enkeltceller, som er helt i indgreb med matricen (men ikke fastgjort til andre celler) for at eksperimentelt styre graden og typen af ​​celleoverflade vedhæftning; Således MEC’er undersøgte her danner vedhæftede celle-matrix via p1 integriner [27].

Undersøgelse celle migration med hensyn til både 2D og 3D matricer giver et bredt perspektiv af MEC motilitet (fig. 3). Overekspression af ErbB2 er blevet vist tidligere for at skænke MEC’er med forøget proliferativ kapacitet [10], og det har også været forbundet klinisk med tidlig fase brystkræft (DCIS) [9]. Faktisk matrix miljø af tidlige fase brystkræft (DCIS) nærmere ligner en 2D matrix arkitektur end det gør en 3D matrix miljø (fig. 1

A

). Når dyrket oven 2D matricer, MEC’er overudtrykker ErbB2 alene migreret med den hurtigste hastighed (figur 1

B

.); ikke-transformerede celler udviste den næsthøjeste grad af motilitet, efterfulgt af underlinjer overekspression 14-3-3ζ (fig. 1

B

). Den signifikant reducerede migration hastighed 14-3-3ζ-overudtrykkende underlinjer forhold til de resterende to underlinjer antyder, at 14-3-3ζ-medieret nedregulering af E-cadherin [9], [15] kan give en mindre virkning på cellemotilitet oven 2D matricer end på MEC’er der har til opgave at navigere en 3D matrix miljø. Dette understreger igen det komplekse samspil mellem omdanne potentielle og matrix mekanik i styrende celle motilitet. Høj vedvarende ikke-transformerede celler i forhold til de resterende genetisk ændrede underlinjer (fig. 1

C

) angiver, at omdanne potentiale kan give MEC’er med en øget følsomhed over for 2D matrix topografi, som ville blive afspejlet i tilfældigt skiftende celle baner i sammenligning med mere rettet celle bevægelser af ikke-transformerede celler. En øget følsomhed over for matrix topografiske signaler bør være en fordel for celler, der søger at invadere deres lokale basalmembran.

Vores resultater tyder på, at inden for relativt kompatible 3D matricer (104 Pa), transformerende potentiale i forbindelse med morfologiske træk er dominerer faktorer, der påvirker cellemotilitet. Som vist i fig. 2

B

, fuldt transformerede celler (10A.ErbB2.ζ) migrerede med den hurtigste hastighed

S

i dette miljø, efterfulgt af morfologisk ændrede 14-3-3ζ-overekspression celler, og derefter

Sammenligning MEC motilitet i kompatible matricer til den i MEC’er i stivere matricer tyder på, at celle vandrende evne er ikke blot en effekt af at omdanne potentiel; snarere er det styret af en balance af indre celle biofysiske egenskaber sammen med matrix mekanik. Den lille forøgelse af tynde, stavlignende forlængelser udvises af 10A.ErbB2 celler i stivere matricer (fig. 4), selv om subtile, kan bære associering med høj stivhed sensing kapacitet, som vi tidligere har rapporteret af dette delområde [17]. Men selv om morfologiske træk af en given sublinie var ens i 3D matricer af forskellig stivhed (fig. 4), systemet hele migration hastighedsprofiler viser tydelige mønstre i forhold til matrix stivhed (fig. 2

B

og

C

og fig. 3). I begge matrix miljøer, ikke-transformerede MEC’er migrerede langsommere end fuldt transformerede MEC’er, der migrerede med de hurtigste hastigheder. Men i de stivere matricer (391 Pa), delvist transformerede celler (10A.ErbB2 og 10A.14-3-3ζ) migrerede signifikant langsommere end ikke-transformerede celler. Øget matrix stivhed resulterede i et fald migreringsevnen for fuldt transformerede celler, men denne virkning var endnu mere udtalt for delvis transformerede celler (fig. 2

D

). Disse resultater antyder, at tilstrækkelig densitet-afhængig 3D matrix stivhed kan spille en rolle i væsentligt hindre migreringsevnen af ​​delvist transformerede celler; dog kan denne stigning i 3D matrix stivhed ikke være nok til at overvinde den aggressive adfærd, der udvises af fuldt invasive celler, som det fremgår af den eneste moderat reduktion i migration hastighed 10A.ErbB2.ζ celler (Fig. 2

D

). Resultater fra vores forudgående undersøgelse af disse underlinjer viste, at i de stivere matricer, 10A.ErbB2 celler udviser den højeste intracellulære stivhed, mens fuldt transformerede 10A.ErbB2.ζ celler udviser en moderat stivhed, og 10A.14-3-3ζ celler udviser en relativt lav stivhed [17]. I alt betragtning af de nuværende motilitet data sammenholdt med resultaterne af vores tidligere undersøgelser tyder på, at MEC migration i 3D miljøer udbyttet i en optimal balance mellem genetisk transformation profil, intracellulær stivhed, fordelagtige morfologiske træk, og matrix stivhed. Således kan en stigning i celle vandrende hastighed, der ellers kan skyldes delvis eller fuld transformation afbødes delvist af tæthed-afhængige matrix stivhed.

Den endelige analyse af denne undersøgelse (fig. 2

F

) præsenterer en meget provokerende resultat, eftersom ErbB2 onkogen detekteres med lavere frekvens i invasive og metastatiske brystcancere end i tidlige stadie brystkræft. Faktisk er forekomsten af ​​ErbB2-overekspression i invasiv og metastatisk brystcancer er kun

halvdelen

den for fase kræftformer tidlige [9], hvilket har været en forvirrende fænomen. Resultaterne fra vores motilitet assays tyder på, at et skift i matrixarkitektur kan være forbundet med denne adfærd. Når MEC’er overgang fra en ikke-invasiv tidlig fase kræft til en invasiv og derefter metastatisk cancer, de trækker fra oven på en 2D basalmembran overflade til inden for en omgivende 3D stroma og dermed opleve et skift i matrixarkitektur (fig. 1

A

). I denne undersøgelse motilitet 10A.ErbB2 celler viser den største følsomhed over for en ændring i matrix arkitektur, sammenlignet med de andre underlinjer som besidder en delvis eller fuld transformerende potentiale (fig. 2

F

). Heraf følger, at celler, der udviser en signifikant mindsket stromale migreringsevnen kan være mindre tilbøjelige til helt at invadere deres lokale grænser og længere krydse det omgivende stroma til senere manifestere sig som metastatisk brystcancer. Det skal også bemærkes, at overekspression af 14-3-3ζ undertrykte signifikant 2D migration (Fig. 1

B

), mens synergistisk forøgelse 3D migration, når ErbB2 blev også overudtrykkes (fig. 2

B

og

C

). Således motilitet celler, der overudtrykker 14-3-3ζ alene udviste den mindste følsomhed over for matrixarkitektur, sammenlignet med 10A.ErbB2 og 10A. ErbB2.ζ celler (Fig. 2

F

).

Sammenfattende nuværende undersøgelse giver nye indsigter i brystkræft motilitet ved at demonstrere, at omdanne potentielle par med matrix stivhed og arkitektur til at påvirke migration hastighed og vedvarende MEC’er. Talrige tidligere undersøgelser har bidraget væsentligt til den nuværende forståelse ved at undersøge ErbB2 og 14-3-3ζ-medierede virkninger på intracellulær stivhed [17], MEC motilitet i opløselige kemiske gradienter [20], kræftcelle migration med hensyn til ligand tilgængelighed [5] og motilitet-induceret matrix remodeling [28]. Ved at anvende tid-bortfaldet imaging, har vi tilføjet til denne viden ved direkte at måle migration hastighed MEC’er både dyrket oven 2D matricer og indlejret i 3D matricer. Det indbyrdes forhold mellem brystkræft cellemotilitet og substrat egenskaber er komplekse; yderligere afklaring af disse forbindelser kan opstå yderligere fremtidige studier, der undersøger effekten af ​​2D matrix stivhed og matrix protein forfatning på motilitet af de undersøgte her underlinjer. En klarere forståelse af MEC-matrix interaktioner rummer bred løfte der i sidste ende kan lede udviklingen af ​​målrettede behandlinger og kræft-fokuserede translationel forskning.

Materialer og metoder

Cell kultur

motilitet blev udført på stabile underlinjer, der blev etableret som beskrevet tidligere [9] fra det ikke-kræft, humanafledt MCF10A MEC linje (leveret af Dr. Robert Pauley af Karmonos Cancer Institute, Detroit, MI). Cellelinier blev opretholdt i 2D monolagskultur i DMEM /F12 vækstmedier [29] i en fugtig inkubator ved 37 ° C, 5% CO

2 indtil tidspunktet for eksperimenteren.

collagenmatrix forberedelse og karakterisering

Todimensionale matricer blev skabt ved at fortynde høj koncentration Type 1 kollagen til 2 mg /ml under anvendelse af 20 pi ethanol-dialyseret 2,0 um carboxylerede, gul-grønt fluorescerende polystyren tracer kugler (Molecular Probes, Carlsbad, CA) (ca. 2% fast stof) og en balance på 0,01 M HCl; 1,5 ml af opløsningen blev derefter deponeret i brønden af ​​en 35 mm glas bund skål og fik lov at inkubere ved stuetemperatur i 1 time. Efter denne periode blev løsningen aspireret, så kun perle-imprægnerede kollagen frakke, der var klæbet til glasbund (se fig. S1

A

). Retter blev derefter skyllet to gange med PBS og opbevaret ved 37 ° C, 5% CO

2 i 45 min, indtil fluorescensmærkede celler blev deponeret i skålen.

Tredimensionelle matricer blev formuleret fra høj koncentration type i collagen (BD Biosciences, San Jose, CA), som blev fortyndet til to koncentrationer af 2 og 4 mg /ml. Lige dele collagen og neutraliserende opløsning (100 mM Hepes i 2X PBS ved pH 7,3) blev blandet med 20 pi af perlen suspension og en balance på 5 × 10

5 fluorescensmærkede celler suspenderet i vækstmedium til opnåelse af den endelige koncentration [ ,,,0],30] (se fig. S1

B

). Hver matrix-opløsning (1 ml) blev derefter aflejret over overfladen af ​​en 35 mm glasbund skålen (Mattek, Ashland, MA). Matrix opløsninger fik lov at gelere i 90 minutter ved 37 ° C, 5% CO

2, hvorpå 1,5 ml vækstmedier blev aflejret oven på 3D-matricer for at tilvejebringe celler med tilstrækkelige næringsstoffer under en efterfølgende 4,5 timer inkubationsperiode ved 37 ° C, 5% CO

2. Matrix stivhed blev målt ved hjælp af kegle og plade rheometri og kvantificeres i forhold til bulk-shear elasticitetsmodul af kollagen gel

G

‘

c

, der rapporteres som 104 og 391 Pa for 3D Type i collagen geler af koncentrationen 2 og 4 mg /mL, som tidligere [17] beskrevne. I dette manuskript, er matricer af modulus 104 Pa benævnt forholdsvis eftergivende, mens de af modul 391 Pa er beskrevet som forholdsvis stift.