PLoS ONE: E2A forudsiger Prognose af tyk- og endetarmskræft Patienter og Regulerer Cancer Cell Growth ved Målretning miR-320a

Abstrakt

Baggrund og formål

Transkriptionel faktor E2A er afgørende for en normal udvikling og differentiering af B og T-lymfocytter. Dysregulering af E2A fører til leukæmi og tumorigenese af nogle solide tumorer. Ekspressionen og kliniske betydning af E2A samt dets rolle i kolorektal cancer (CRC) er stadig ukendt. Denne undersøgelse har til formål at vurdere E2A udtryk i CRC væv, evaluere sin prognose værdi, og undersøge sin rolle i tyktarmskræft cellevækst.

Metoder

E2A udtryk i CRC væv og normal slimhinde blev opdaget af immunhistokemisk farvning; Kaplan-Meier overlevelse kurve og Cox regression model blev anvendt til at evaluere den prognostiske værdi af E2A. Lentivirus blev anvendt til konstruktion af E2A stabilt bankede-down celler. MTT-assay blev anvendt til at detektere celleproliferation ændringer; celle cyklus blev analyseret ved flowcytometri; og kromatin immunofældning (chip) blev anvendt til at validere den forudsagte bindende mål for E2A

Resultater

Angivelse af E2A var lavere i CRC væv end normalt slimhinde.; lav E2A ekspression korrelerede med avanceret TNM stadie og større tumorstørrelse, og forudsagde dårlig prognose af CRC patienter. E2A knockdown resulterede i øget celledeling sats og cellecyklus acceleration. Chip assay viste miR-320a var et direkte mål for E2A og opregulering af miR-320a i E2A nedreguleret celler kunne vende celle spredning og cellecyklus ændringer forårsaget af E2A mangel.

Konklusioner

E2A er en uafhængig prognostisk faktor for CRC patienter og mål miR-320a til at regulere celledeling af tyktarmskræft celler

Henvisning:. Huang A, Zhao H, Quan Y, Jin R, Feng B, Zheng M (2014) E2A forudsiger Prognose for tarmkræft Patienter og Regulerer Cancer Cell Growth ved Målretning miR-320a. PLoS ONE 9 (1): e85201. doi: 10,1371 /journal.pone.0085201

Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA

Modtaget: 3. september 2013; Accepteret: November 25, 2013; Udgivet: 13 Jan 2014

Copyright: © 2014 Huang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (NSFC, 30.873.000). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

pattedyr E2A-gen er placeret på kromosom 19 og er ikke vævs-specifikt og ubikvitært udtrykt i en lang række celletyper. Gennem alternativ splejsning, E2A-genet koder to isoformer, E12 og E47 (samlet betegnet som E2A-proteiner), som begge har den grundlæggende-Helix-loop-helix (bHLH) domæne og kunne regulere gentranskription ved binding til E-box DNA sekvenser, CAGGTG. Selvom bredt udtrykt, E2A er ikke afgørende i nogle organogeneses som skelet- eller hjerte- myogenese, erythropoiese, chondrogenese, og neurogenese [1], men spiller en vigtig rolle i udviklingen og differentiering af B [2], [3] og T-lymfocytter [4 ]. E2A mangelfuld mus viste en anholdelse på pro-B-celle stadie under B udvikling celle [3] og transgene udtryk for enten E12 eller E47 kunne delvist redde B lymfopoiese indledning; på samme måde, E2A mangel førte til en blok på det tidligste stadium af T-celle udvikling [4] og forstyrret thymocyt positiv selektion [5]. Desuden har E2A vist sig at være involveret i nogle cellulære aktiviteter, herunder celledifferentiering [6], proliferation [7], apoptose [8], cellecyklus [9] og epitelial-mesenkymale overgang (EMT) [10].

Ud over sin afgørende rolle i normal B og T-celle udvikling, E2A deltager også i tumorigenese. Undersøgelser havde rapporteret den veletablerede rolle E2A i leukemogenesis: to fusionsproteiner, E2A-HLF [11] og E2A-PBX1 [12], begge indeholdende transaktiveringsdomænet af E2A og DNA-bindende domæne af HLF eller PBX1, kunne føre til pro-B-celle akut lymfoblastisk leukæmi (ALL) hos unge og præ-B-celle ALL hos børn henholdsvis [13]. Desuden har E2A vist sig at være involveret i onkogenese af faste tumorer, enten som onkogen eller tumor-suppressor gen. Tilstedeværelse af E2A-PBX1 fusionsprotein i lungekræft blev for nylig rapporteret, og det korreleret med samlet overlevelse af patienter med lunge-adenocarcinom in situ [14]. Øget ekspression af E2A blev påvist i brystkræft [15], [16] og prostatakræft [17], hvoraf det blev fundet at fremme onkogenese. Imidlertid mus med null mutation af E2A var modtagelige for spontant udviklede thymiske lymfomer [18] og tab af E2A i primær effusion lymfom førte til apoptose resistens [19], hvilket tyder på den alternative rolle E2A som en tumor-suppressor gen. Endvidere har E2A ekspression blevet foreslået at være af diagnostisk værdi i visse undertype af gastrisk MALT (mucosa-associeret lymfoidt væv) lymfom [20]. Tilsammen kan E2A fungere som en tumor-suppressor gen eller som et onkogen i forskellige kræftformer.

udtryk for E2A i kolorektal cancer (CRC) og dens prognostiske værdi er ikke blevet drøftet før, og det er stadig uvist, om E2A fremmer eller undertrykker udviklingen af ​​CRC. I denne undersøgelse til vores viden, for første gang, vi undersøgte den kliniske betydning af E2A i CRC og fandt sin nytte som en prognostisk markør; Desuden fandt vi E2A undertrykte tumorvækst ved at målrette miR-320a i tyktarmen kræftceller, viser sin tumor-undertrykkende rolle i CRC.

Metoder

Patienter og kliniske prøver

i alt 98 patienter med tarmkræft blev inkluderet; patienterne blev behandlet med kirurgi mellem juni 2007 og januar 2008 Shanghai minimalt invasiv kirurgi Center. Patienter blev udelukket, hvis de: havde modtaget neoadjuverende kemostråleterapi; havde inoperable kolorektal kræft; havde tumorer i andre organer; var usandsynligt at blive interviewet i follow-up. Demografiske og klinisk-patologiske data blev udvundet af diagrammet gennemgang. Patienterne blev interviewet telefonisk til tre måneder, seks måneder, og derefter årligt efter operationen. Tumor prøver blev skåret umiddelbart efter kirurgiske prøver ‘fjernelse under operationerne og derefter fikseret med formalin og opbevaret ved 4 ° C i to uger før næste behandling; normale væv blev defineret som mucosa placeret mindst 5 cm væk fra tumoren margin og skæres, faste, bevares og behandles som ovenfor. Denne undersøgelse blev foretaget med de skriftlige informerede samtykke fra alle tilmeldte patienter før operation og i henhold til protokollen er godkendt af Etisk Komité Ruijin Sygehus Shanghai Jiao Tong University School of Medicine.

Immunhistokemi og scoring

immunhistokemi farvning blev udført som protokol tidligere beskrevet [21]. Kort fortalt efter fiksering med formalin, blev vævene indlejret med paraffin, klippe, og monteret på dias. Derefter blev objektglassene vasket med xylen til afparaffiniser, med gradueret ethanol at rehydrere, inkuberet med citratbuffer til at hente antigen, og blokeret med 3% H

2O

2 for at inaktivere endogen peroxidase. Objektglas blev inkuberet med E2A primært antistof (Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA; 1:200 fortynding) ved 4 ° C natten over, efterfulgt af inkubering med peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret gede-anti-kanin sekundært antistof (Santa Cruz) i 30 min ved stuetemperatur. Kompleks visualisering blev udført med en 2-Solution DAB Kit (Invitrogen). Negative kontroller blev opnået ved at erstatte E2A primære antistof med præimmunt kaninserum.

Slides blev undersøgt af to forskere (Huang og Quan) uafhængigt. Scoring anvendte kriterier var som tidligere beskrevet med mindre modifikationer. Farvningsintensitet blev scoret som 0 (ingen farvning), 1 (svag farvning), 2 (moderat farvning), og 3 (stærk farvning); positive celler på hver sektion blev bedømt som 0 (under 10%), 1 (10% -25%), 2 (26% -50%), og 3 ( 50%). Det endelige resultat var et produkt af snesevis af intensitet og positiv celle i hvert dias. Slides med score 0-3 blev defineret som lav udtryk og 4-9 så høj ekspression.

Cell kultur

Tyktarmskræft cellelinjer LOVO, HCT116, Caco-2, HT29, SW480, og SW1116 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) og subdyrket og konserveret ved Shanghai Institute of Digestive Surgery; normal menneskelig colon slimhindeepitelet celle NCM460 er venligst doneret af Jingqing Zeng (Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, den donator købte NCM460 cellelinje fra Incell Corporation, LLC, San Antonio, TX, USA). LOVO blev dyrket i F-12K Nutrient Mixture Medium (Corning Cellgro®, MA, USA), HCT116 og HT29 i McCoys 5A (Corning Cellgro®), SW480 og SW1116 i Leibovitz ‘L-15 (Corning Cellgro®), og NCM460 i DMEM (Corning Cellgro®). Alle dyrkningsmedium ovenfor blev tilsat 10% føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Caco-2 blev dyrket i Minimum Essential Medium (Corning Cellgro®) med 20% FBS. Celler blev anbragt i inkubatoren (Heracelles, Tyskland) ved 37 ° C, i en fugtig atmosfære med 5% CO

2.

Protein udvinding og Western blot

Celler blev høstet på et sammenløb af 80% med RIPA (Solarbio, Beijing, Kina) og koncentrationen protein blev bestemt med BCA protein Assay Kit (Thermo Scientific, USA) ved at måle OD

562 ved hjælp mikropladelæser (Epoch, BioTek, Winooski, USA) . Western blot blev udført ifølge tidligere rapporteret protokol [22] og primære antistoffer anvendt blev E2A (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA). GAPDH (Kangchen, Shanghai, Kina) blev anvendt som lastning kontrol.

RNA og microRNA isolation, QRT-PCR

I alt celle RNA’er udvundet ved hjælp Trizol reagens (Invitrogen) og totale celle microRNA’er ( miRNA) blev ekstraheret med Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). RNA revers transkription blev udført ved anvendelse PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time (Takara, Shiga, Japan). MRNA-niveauet af E2A (fremadrettet: 5′-CCACT TCACT GAGTC GCACAG-3 ‘; revers: 5′-GTCTC TCCCG AAGGA GGCATA-3′) blev evalueret ved QRT-PCR, ved anvendelse af SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems); RNA niveau af GAPDH (frem: 5’-GGAGC GAGAT CCCTC CAAAAT-3 ‘; omvendt: 5′-GGCTG TTGTC ATACT TCTCA TGG-3’) blev anvendt til normalisering. Ekspressionen af ​​MIR-320a blev evalueret ved QRT-PCR under anvendelse af Taqman microRNA RT Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), TaqMan miRNA tests (Applied Biosystems), og Taqman universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) i overensstemmelse med producentens anvisninger; U6 miRNA-niveau blev brugt til normalisering.

Lentiviral transfektion for stabile udtryk kloner

E2A /shRNA-eGFP-lentivirus partikler og E2A /sh-negative kontrol (shNC) -eGFP-lentivirus partikler , nemlig E2A /shRNA-LV og E2A /shNC-LV, blev købt fra Novobio (Shanghai, Kina). shNC blev syntetiseret med de samme baser af shRNA men med krypterede sekvens. Lentiviral transfektion og cellescreeningssystemet blev udført ifølge producentens anvisninger for at etablere den E2A stabilt nedreguleret og stabilt NC transefected SW480 kloner, dvs. SW480 /shE2A og SW480 /shNC. Transfektion effektivitet blev evalueret ved visuel undersøgelse af procentdelen af ​​eGFP-udtrykkende celler under fluorescensmikroskop (Olympus, Tokyo, Japan), western blot, og QRT-PCR.

transient transfektion

plasmider, PEZ-M29-E12 (plasmid kodende isoform E12), PEZ-M29-E47 (plasmid kodende isoform E47), PEZ-M29-NC (plasmid med negativ kontrol-sekvens) og vektor kontroller blev indkøbt fra Genecopoeia (Rockville, MD, USA) og valideret af sekventering; miRNA-320a efterligner (dobbelt-strengede RNA molekyler efterligner miR-320a) og efterligner nationale koordinatorer (negativ kontrol-sekvenser baseret på C. elegans microRNA har minimal sekvens identitet i human) blev købt fra GenePharma (Shanghai, Kina). Celler af log-fase blev høstet og udsået i 6-brønds plader ved en densitet på 4 * 10

5 celler /brønd, 24 timer før transfektion. Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) blev anvendt til transfektion, i overensstemmelse med producentens anvisninger. Effektivitet af transient transfektion blev undersøgt ved western blot eller QRT-PCR. Celler transficeret med vektorer blev anvendt som kontrol.

Celleproliferationsassay

Cell proliferationsassay blev udført med Cell Counting Kit-8 (CCK8) (Dojindo, Kumamoto, Japan). Kort beskrevet blev celler fordøjet med trypsin (Beyotime, Shanghai, Kina), vasket med phosphatbufret saltvand (PBS) to gange, filtreret med en si (BD Falcon), resuspenderet i RIPA 1640 medium, talt og fortyndet til en slutkoncentration på 5 celler /pl. Derefter celler blev podet i plader med 96 brønde, 200 pi (1000 celler) per brønd, i sixplicate og anbragt i inkubatoren i 6 dage. Levedygtige celler blev kvantificeret ved hvert 24 timer interval med CCK8, i overensstemmelse med producentens protokol, og absorbansen ved 450 nm blev målt ved hjælp af mikropladelæser (Epoch, BioTek).

Cell cyklus analyse

Før analyse blev celler (2 x 10

6) blev høstet 48 timer efter transient transfektion, såvel som de tilsvarende kontroller. Derefter blev cellerne vasket to gange med iskold PBS, fikseret med 75% ethanol og opbevaret ved 4 ° C natten over. Ved analyse blev celler vasket med PBS to gange og behandlet med RNase ved 37 ° C i en time, efterfulgt af farvning med propidiumiodid i 30 minutter i mørke. Cellecyklusanalyse blev derefter gennemført med flowcytometri (FACSCalibur, Becton Dickinson, MD, USA).

chromatin immunpræcipitationsassay

EZ-chip ™ chromatin immunoprecipitation Kit (Millipore, Billerica, MA, USA ) blev købt til at udføre chippen assayet ifølge producentens protokol. Kort fortalt blev en 15 cm cellekultur plade af SW480-celler (ca. 80% konfluens) fikseret med 1% PFA (Sigma). Derefter blev cellerne lyseret, sonikeret for forskydning DNA og immunpræcipiteret med anti-E2A (Santa Cruz) og kontrol antistof (IgG). Derefter blev protein /DNA-krydsbinding vendes, og DNA blev oprenset for følgende PCR, under anvendelse af Takara Ex Taq Hot Start Version (Takara).

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse SPSS 15.0 softwaren. Korrelationen af ​​kliniske faktorer med E2A ekspression blev undersøgt ved Pearson korrelationsanalyse. Virkningen af ​​E2A på overlevelse blev vurderet ved anvendelse af Kaplan-Meier-kurve og log-rank test. Univariate og multivariate Cox ‘proportionale farer model blev brugt til at vurdere virkningerne af E2A udtryk og klinisk-patologiske parametre på 5-års OS og DFS hhv. Students t-test blev anvendt til at analysere forskelle mellem to grupper og envejs ANOVA blev anvendt i forbindelse med data bestod af mere end to grupper. En to-tailed værdi på

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Angivelse af E2A korreleret med CRC patologiske stadier

For det første, vi evaluerede ekspressionen af ​​E2A-protein i CRC væv og normal slimhinde ved immunhistokemi (figur 1). Kolorektale tumor prøver opnået fra 98 CRC patienter og normal slimhinde tilgængelig fra 43/98 patienter blev undersøgt. De demografiske og klinisk-patologiske parametre for alle inkluderede patienter blev vist i tabel 1. Af de 98 patienter, blev høj ekspression af E2A påvist i 35/43 normale slimhinde og 39/98 tumorvæv (

P

0,01) . Farvning af E2A i normal slimhinde præsenteret i kernen og cytoplasmaet begge, men i cancervæv, E2A-farvning var overvejende nuklear (figur 1). Vigtigere, ekspression af E2A faldt som CRCs advanced (Figur 1E-H). Vi gjorde derefter en korrelationsanalyse at studere sammenhængen mellem E2A udtryk og de klinisk-patologiske faktorer. Som vist i tabel 2, blev lav udtryk for E2A signifikant associeret med højere TNM stadie (

P

0,01) og større tumor størrelse (

P

= 0,035), men var ikke relateret til patienter alder (

P

= 0,761), køn (

P

= 0,655), tumor histologi (

P

= 0,985), eller tumor (

P

= 0,120). Således vil kunne blive involveret i udviklingen og progressionen af ​​CRC E2A

Repræsentative billeder af IHC vises som:. (A) HE farvning af normal slimhinde; (B) HE farvning af CRC væv; (C) høj E2A udtryk (brun farve) præsenteres som nukleare og cytoplasmatisk farvning i normal slimhinde; (D) lav E2A ekspression i normal slimhinde; (E-H) trin I (E) til trin II (F), III (G), og IV (H) CRC væv med forskellige E2A farvningsintensiteter; E2A optrådte overvejende kerne. Billeder blev taget under 200 × forstørrelse. Vejviser

Lav udtryk for E2A forudsagde dårlig prognose af CRC patienter

For at undersøge den prognostiske værdi af E2A, vi brugte Kaplan -Meier 5-års overlevelse kurve for at vise forskellene i resultaterne mellem lave og høje E2A udtryk CRC patienter. Som vist i figur 2, patienter med forhøjet E2A ekspression havde længere 5-års samlet overlevelse (OS) og sygdomsfri overlevelse (DFS) end patienter med lav ekspression. Den 5-årige OS og DFS for høj E2A udtryk patienter var 84,6% og 82,1%, og for patienter med lav E2A-ekspression var 47,5% og 42,4% (

P

= 0,000, til OS og DFS begge). Dernæst vi ansat af Cox-regressionsmodel til at undersøge den prognostiske værdi af E2A. I univariat analyse blev TNM stadie og E2A udtryk sig at være prædiktiv for OS og DFS; mens i multivariat analyse, begge faktorer ligeledes forventes dårligere kliniske resultater (tabel 3). Derfor E2A udtryk syntes at være en nyttig prædiktiv faktor for prognosen for CRC patienter

(A) OS til høj og lav E2A udtryk patienter.; (B) DFS for høje og lave E2A udtryk patienter. Patienter med højt E2A udtryk har gunstigere OS og DFS (

P

= 0,000, for OS og DFS begge).