PLoS ONE: Resveratrol inducerer tidlig Ældning i Lung Cancer Cells via ROS-medieret DNA Damage

Abstrakt

Resveratrol (RV) er en naturlig bestanddel af rødvin og druer, der har vist sig at være en potentiel kemoforebyggende og anticancermiddel. Imidlertid er de molekylære mekanismer bag RV anticancer og kemoforebyggende virkninger ufuldstændigt forstået. Her viser vi, at RV behandling inhiberer klonogene vækst af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) celler på en dosis-afhængig måde. Interessant nok blev tumoren-undertrykkende effekt af lav dosis RV ikke forbundet med væsentlige ændringer i ekspression af spaltet PARP og aktiveret caspase-3, hvilket tyder på, at lav dosis RV behandling kan undertrykke tumorcellevækst via en apoptose-uafhængig mekanisme. Efterfølgende undersøgelser afslører, at lav dosis RV behandling inducerer en betydelig stigning i senescens-associerede β-galactosidase (SA-β-gal) farvning og forhøjet ekspression af p53 og p21 i NSCLC-celler. Endvidere viser vi, at RV-induceret suppression af lungekræft cellevækst forbundet med et fald i ekspressionen af ​​EF1A. Disse resultater antyder, at RV kan udøve sin anticancer og kemoforebyggende virkninger gennem induktion af tidlig ældning. Mekanistisk, RV-induceret tidlig ældning korrelerer med øget DNA dobbelt streng pauser (DSBs) og reaktive ilt arter (ROS) produktion i lunge kræftceller. Inhibering af ROS-produktion ved N-acetylcystein (NAC) svækker RV-induceret DNA DSBs og for tidlig ældning. Endvidere viser vi, at RV behandling markant inducerer NAPDH- oxidase-5 (Nox5) ekspression i både A549 og H460 celler, hvilket antyder, at RV kan øge ROS-generering i lungecancerceller gennem opregulere Nox5 ekspression. Sammen disse resultater viser, at lav dosis RV behandling hæmmer lungekræft cellevækst via en tidligere unappreciated mekanisme, nemlig induktion af tidlig ældning gennem ROS-medieret DNA-skader

Henvisning: Luo H, Yang A, Schulte BA. , Wargovich MJ, Wang GY (2013) Resveratrol Fremkalde Præmatur Ældning i Lung Cancer Cells via ROS-medieret DNA Damage. PLoS ONE 8 (3): e60065. doi: 10,1371 /journal.pone.0060065

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: November 30, 2012; Accepteret: 20 Februar 2013; Udgivet: 22 Mar 2013

Copyright: © 2013 Luo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af NIH tilskud CA138313 og HL106451 (www.nih.gov). Dette arbejde blev også delvist understøttet af en American Cancer Society Institutional Research Grant (# IRG-97-219-08). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at ingen konkurrerende interesse eksisterer

Introduktion

Lungekræft er ansvarlig for flere kræftdødsfald i USA end den kombinerede dødelighed colorectal, bryst og prostatakræft [1]. Selv med de nyere avancerede terapeutiske metoder, den 5-årige samlet overlevelse er mindre end 16% og har ikke ændret sig nævneværdigt i mange årtier [1], [2]. Denne dårlig prognose understreger det presserende behov for udvikling af nye strategier for forebyggelse og mere effektiv behandling af denne dødelige sygdom. Naturlige produkter (NPS) er meget brugt af amerikanerne som komplementære og alternative medicin (CAM) til forebyggelse og behandling af forskellige humane sygdomme, herunder kræft [3], [4]. Anvendelsen af ​​NP’er som antitumormidler til forvaltning af humane cancere er en attraktiv idé, fordi de er let tilgængelige og udviser ringe eller ingen toksicitet [3], [5] – [7]. Resveratrol (RV) er en af ​​sådanne NP’er og er blevet vist at udvise både anticancer og kemoforebyggende potentialer [3], [8] – [10]. Imidlertid er de nøjagtige molekylære mekanismer bag RVS kemoforebyggende og anticancer effekter ikke fuldstændigt forstået. Målet med denne undersøgelse var at definere rollen af ​​for tidlig ældning i RV-induceret antitumorvirkninger i lungecancerceller.

Cellulær ældning er en tilstand af permanent cellecyklusstop der kan udløses af en række spændinger, herunder DNA-skader, telomer afkortning og oxidativ stress [11] – [13]. De to store kategorier af cellulær ældning er replikativ senescens og stress-induceret tidlig aldring (SIPS). Replikativ senescens blev først beskrevet af Hayflick og Moorhead i humane fibroblaster efter celler undergik omfattende replikation som følge af serielle kultur passager [14]. Efterfølgende blev det konstateret, at celler også kan undergå SIPS som svar på DNA-beskadigende midler, såsom ioniserende stråling og kemoterapeutika [11] – [13], [15]. Celler, som undergår SIPS skelnes morfologisk fra replikativt aldrende celler og udviser mange af de karakteristika tilskrives replikativ senescens, såsom øget senescens associeret β-galactosidase (SA-β-gal) aktivitet og forøget p53 og p21-ekspression [11] – [13] , [15] – [17]. Skønt kortere telomere blev anset for at være den væsentligste årsag til replikativ senescens, kan for tidlig ældning forekomme i en telomerase- og telomer afkortning-uafhængig mekanisme [18], [19]. Senescens begrænser levetiden og proliferativ kapacitet af celler, derfor induktion af senescens betragtes som en vigtig mekanisme til forebyggelse af kræft [20] – [22]. Endnu vigtigere er ny dokumentation vist, at terapi-induceret ældning er en kritisk mekanisme til mange anticancermidler inhibere væksten af ​​tumorceller [11], [12], [23]. Interessant nok er det blevet vist, at behandling-induceret aldring kan opnås ved meget lavere doser kemoterapi end dem, der kræves for at inducere apoptose, hvilket indikerer, at høje doser af anticancer middel kan forårsage apoptose henviser lavt niveau behandlinger primært inducerer senescens i cancerceller [12] . Sammenlignet med de traditionelle apoptoseinducerende strategier, kan denne lave tilgang dosis reducere bivirkningerne ved anticancerterapi og således forbedre livskvaliteten for kræftpatienter. Derfor er det vigtigt at forstå, om lavdosis RV kan undertrykke lungekræft cellevækst via induktion af tidlig ældning.

RV er en ikke-toksisk naturlig polyphenolisk forbindelse findes i overflod i druer, rødvin, morbær og andre spiselige planter. Nylige kliniske forsøg har vist, at RV er veltolereret og relativt sikker til brug i mennesker [5] – [7]. RV er blevet vist at inhibere proliferation af en række forskellige cancerceller via inaktivering af forskellige celleoverlevelsesforløb herunder PI3-kinase /AKT pathway [24]. RV er også blevet vist at udvise potentielle kemoforebyggende aktivitet i flere kræftfremkaldende-induceret tumormodeller, herunder bryst-, tarm, lever, spiserør og colon [3], [25], [26]. Endvidere er det blevet rapporteret, at RV behandling inhiberer pancreas cancervækst og forbedrer de anticancer effekter af gemcitabin eventuelt via undertrykkelse af NF-КB aktivering og nedregulering af ekspressionen af ​​cyclin D1, COX-2, ICAM-1, MMP-9 og survivin i tumorvæv [27]. Skønt tidligere undersøgelser har indikeret, at RV, ved høje doser, kan inhibere proliferation af cancerceller ved at inducere apoptose [28] – [31], en stor udfordring for brugen af ​​denne CAM er, at koncentrationen af ​​RV kræves for at inducere apoptose i tumorceller

in vitro

er for stor til at opnå

in vivo

i et klinisk miljø [5] – [7], [32]. Da induktion af senescens kræver en meget lavere koncentration af anticancermidler og således frembringer færre uønskede bivirkninger [12], forsøgte vi at undersøge, om lavdosis RV behandling kunne hæmme væksten af ​​cancerceller gennem induktion af tidlig ældning. I den foreliggende undersøgelse viser vi, at lav dosis RV behandling fører til en betydelig stigning i senescens-associerede β-galactosidase (SA-β-gal) farvning og forhøjet p53 og p21 ekspression i NSCLC-celler, hvilket antyder, at anticancervirkning af RV er væsentlighed henføres til induktion af degeneration i lunge kræftceller. Mekanistiske undersøgelser viser, at RV-induceret aldring er forbundet med øget DNA DSBs og ROS produktion i lunge kræftceller. Desuden vores data viser også, at inhibering af ROS-produktion ved NAC dæmper RV-induceret DNA DSBs og for tidlig ældning. Tilsammen disse resultater viser, at lav dosis RV behandling forårsager for tidlig ældning i lungekræft celler via ROS-medieret DNA-skader, som fremhæver et væsentligt bidrag af ældning induktion til RV anticancer effekter.

Resultater

RV hæmmer væksten af ​​lungecancerceller på en dosis-afhængig måde

Tidligere undersøgelser har indikeret, at højere doser af RV behandling kan hæmme proliferationen af ​​tumorceller ved at inducere apoptose [28] – [31], men en stor udfordring for denne apoptose-forårsager strategi er, at koncentrationen kræves for at inducere apoptose i tumorceller

in vitro

ikke nås

in vivo

[5] – [7], [32]. Derfor er det vigtigt at bestemme, om lavdosis RV behandling påvirker væksten af ​​tumorceller. Til dette formål, vi behandlede A549 og H460 lungekræft celler med forskellige lave doser af RV (0-50 uM) at undersøge, om RV behandling har indflydelse på koloni dannelsen af ​​NSCLC celler. Klonogene overlevelse assays vist, at selv så lav som 10 uM RV behandling kan væsentligt undertrykke kolonidannende aktivitet af A549 og H460-celler (fig. 1A, 1B og 1C). Dataene viser også, at RV-induceret suppression af kolonidannelse korrelerer godt med koncentrationerne af RV, hvilket antyder, at RV behandling inhiberer klonogene vækst af NSCLC-celler på en dosis-afhængig måde. Salg

(A) Klonogene overlevelse assays viser, at antallet af cancer celleafledte kolonier falder med RV dosis. (B) Resultaterne af klonogene assays blev normaliseret til klonogene overlevelse af kontrol A549-celler og er udtrykt som% af kontrol. (C) Resultaterne af klonogene assays blev normaliseret til klonogene overlevelse af kontrol H460 celler og er udtrykt som% af kontrol. **,

s

. 0,01 vs. kontrol

Lav dosis RV hæmmer lungekræft cellevækst via en apoptose-uafhængig mekanisme

Selv om det har været vist, at højere doser (100-200 uM) af RV behandling kan inducere apoptose i tumorceller [28] – [31], var det uvist, om lavdosis RV undertrykker væksten af ​​lungecancerceller gennem induktion af apoptose. Fordi aktiveret caspase-3 og kløvet PARP er veldokumenterede målinger af apoptose [33], [34], undersøgte vi, om lav dosis RV behandling har indflydelse på ekspressionen af ​​aktiveret caspase-3 og kløvet PARP i A549 og H460 celler. Som vist i figur 2, viste Western blotting data, lav dosis RV behandling ikke medføre nogen væsentlige ændringer i ekspressionen af ​​spaltet PARP og aktiveret caspase-3 i enten A549 eller H460 celler. I modsætning hertil camptothecin (CPT) behandling resulterede i en markant stigning i spaltet PARP og aktiveret caspase-3-ekspression i både A549 og H460-celler (fig. 2A og 2B). Disse resultater antyder kraftigt, at lav dosis RV inhiberer lungekræft cellevækst via en apoptose-uafhængig mekanisme.

(A) Western blot assays blev udført for at bestemme ekspressionen af ​​aktiveret caspase-3 og spaltes PARP i A549-celler. Actin blev anvendt som en loading kontrol. (B) Western blot assays blev udført for at bestemme ekspressionen af ​​aktiveret caspase-3 og spaltes PARP i H460 celler. Actin blev anvendt som en loading kontrol.

RV inducerer præmatur ældning i lungecancerceller

Det er blevet foreslået, at induktionen af ​​for tidlig ældning er en vigtig mekanisme, hvorved ioniserende stråling og mange kemoterapeutiske midler udøver deres anticancer effekter [11] – [13], [15], [17], [23]. Således har vi forsøgt at undersøge, om lav dosis RV behandling inducerer tidlig ældning i NSCLC celler. Fordi øget SA-β-gal-aktivitet er en veletableret biomarkør for senescens [16], undersøgte vi, om lavdosis RV behandling inducerer præmatur ældning i A549 og H460 celler ved SA-β-gal-farvning. Som vist i figur 3A indikerer resultaterne, at antallet af SA-β-gal-positive aldrende celler markant forøges i RV-behandlede versus kontrol A549 og H460 celler. Derudover er den procentdel af SA-β-gal-positive celler stiger med dosen af ​​RV, hvilket antyder, at RV behandling inducerer præmatur ældning i lungecancerceller på en dosis-afhængig måde (fig. 3B og 3C).

(A) SA-β-gal-farvning steg med RV doser i både A549-celler (øvre panel) og H460-celler (nederste panel). (B) Procentdelen af ​​SA-β-gal-positive aldrende celler i RV-behandlede og kontrol A549-celler er præsenteret som gennemsnit ± SEM. (C) Procentdelen af ​​SA-β-gal-positive aldrende celler i RV-behandlede og kontrol H460 celler præsenteres som middelværdi ± SEM. (D) Western-blot-assays blev udført for at bestemme ekspressionen af ​​p53, p21 og EF1A i A549-celler. Actin blev anvendt som en loading kontrol. (E) Western blot assays blev udført for at bestemme ekspressionen af ​​p53, p21 og EF1A i H460 celler. Actin blev anvendt som en loading kontrol. *,

s

0,05 vs. kontrol; **,

s

. 0,001 vs. kontrol

Vi undersøgte også ekspressionsniveauerne af p53 og p21, to vigtige molekyler involveret i reguleringen af ​​ældning [12], [15], [17], [35], i RV-behandlede NSCLC celler. Western blotting-data viste, at ekspressionsniveauerne af p53 og p21 blev signifikant forøget i RV-behandlede celler sammenlignet med kontrol A549 og H460-celler (fig. 3D og 3E). Disse resultater antyder, at p53-p21-vejen er involveret i RV-induceret for tidlig ældning i lungecancerceller. Interessant vores data viser også, at RV behandling signifikant nedregulerer ekspressionen af ​​EF1A i A549 og H460-celler (fig. 3D og 3E), hvilket antyder, at EF1A kan spille en vigtig rolle i reguleringen af ​​RV-induceret for tidlig ældning i NSCLC-celler.

RV behandling forårsager DNA-skader og øger ROS produktion i lunge kræftceller

Mange kemoterapeutiske stoffer og stråling dræber tumorceller via induktion af DNA-skader. Phosphoryleret H2AX (γH2AX) er en robust markør for DNA DSB’er [36]. For at bestemme om DNA beskadigelse bidrager til RV-induceret anticancer effekter, udførte vi γH2AX foci assays for at undersøge, om RV behandling forårsager DNA DSB’er i lungecancerceller. Som vist i figur 4, vore data viser, at RV behandling resulterer i en betydelig stigning i dannelsen af ​​γH2AX foci i både A549 og H460-celler (fig. 4A, 4B og 4C). Dannelsen af ​​γH2AX foci er en vigtig surrogat af DNA DSB’er [36], viser disse resultater for første gang, at anticancervirkning af RV skyldes i det mindste delvis til RV-induceret DNA-skader i NSCLC-celler.

(A) DNA-DSB’er blev bestemt ved γH2AX immunofluorescens-mikroskopi som tidligere beskrevet (16). Repræsentative immunfluorescerende billeder af γH2AX foci i RV-behandlede A549 og H460 celler præsenteres. (B) Procentdelen af ​​γH2AX foci positive celler i RV-behandlede A549-celler er præsenteret som gennemsnit ± SEM. (C) Procentdelen af ​​γH2AX foci positive celler i RV-behandlede H460 celler præsenteres som middelværdi ± SEM. (D) Niveauerne af ROS blev målt ved DCF-DA farvning og flow cytometrisk analyser på 24 timer efter RV behandling. Niveauerne af ROS i RV-behandlede A549 celler præsenteres som fold ændring i forhold til niveauerne i kontrol- celler. (E) Niveauerne af ROS i RV-behandlede H460 celler præsenteres som fold ændring i forhold til niveauerne i kontrol- celler. *,

s

0,05 vs. kontrol; **,

s

. 0,01 vs. kontrol

Vi og andre har vist, at ROS spiller en kritisk rolle i formidling genotoksisk stress-induceret DNA-skader [37], [ ,,,0],38]. Derfor vi hypotese, at RV kan forårsage DNA DSB’er via øget ROS produktion i NSCLC celler. For at teste denne hypotese undersøgte vi, hvis RV behandling har indflydelse på ROS produktion i lunge kræftceller. DCF-DA-farvning og flow-cytometriske assays viste, at niveauerne af ROS markant blev forhøjet i RV-behandlede A549 og H460 celler sammenlignet med kontrolceller (fig. 4D og 4E). Disse resultater antyder, at RV kan fremkalde lungekræft celle tidlig ældning via ROS-medieret DNA-skade.

NAC dæmper RV-induceret DNA-skader og for tidlig ældning i lungecancerceller Salg

Selvom vores data har vist at RV-induceret DNA-beskadigelse er forbundet med forøget ROS-produktion i NSCLC-celler (fig. 4), det har endnu ikke fastlagt, hvis hæmning af ROS produktion under anvendelse antioxidanter kan forebygge RV-induceret DNA-skader og for tidlig ældning. Til dette formål har vi præinkuberet celler med NAC før RV behandling for at bestemme, om NAC kan dæmpe RV-induceret DNA DSBs og for tidlig ældning i lungecancerceller. Som vist i figur 5A, vore data viser, at forbehandling med NAC signifikant hæmmer dannelsen af ​​RV-induceret γH2AX foci i A549 og H460 celler. Endvidere SA-β-gal-farvning viser, at procentdelen af ​​RV-induceret præmature aldrende celler reduceres væsentligt i NAC-behandlede celler (fig. 5D og 5E). Tilsammen disse fund kraftigt støtte den hypotese, at RV inducerer lungekræft celle tidlig ældning via ROS-medieret DNA-skader.

(A) DNA DSBs blev bestemt ved γH2AX immunfluorescent mikroskopi som tidligere beskrevet (16). Repræsentative immunfluorescerende billeder af γH2AX foci i A549 og H460 celler præsenteres. (B) Inhibering af ROS ved NAC (5 mM) formindsker RV (30 uM) -induceret γH2AX foci i A549-celler. (C) Inhibering af ROS ved NAC (5 mM) formindsker RV (30 uM) -induceret γH2AX foci i H460 celler. (D) Inhibering af ROS ved NAC dæmper RV-induceret for tidlig ældning i A549-celler. (E) Inhibering af ROS ved NAC dæmper RV-induceret for tidlig ældning i H460 celler. **,

s

0,001 vs. kontrol.

#,

s

. 0,01 vs. RV

RV inducerer Nox5 udtryk i lunge kræftceller

Dernæst vi forsøgt at bestemme de mekanismer hvorved RV inducerer ROS generation i kræftceller. Det blev rapporteret, at øget intracellulær cyklisk AMP (cAMP) kan bidrage til mitokondrie ROS akkumulering [39]. Interessant, en nylig undersøgelse fra Park et al. har vist, at RV behandling øger niveauerne af cAMP i muse C2C12 celler [40]. At afgøre, om RV ændrer cAMP niveauer og til gengæld inducerer ROS generation i lungekræft celler, vi har registreret cAMP niveauer i A549 og H460 celler efter forskellige gør af RV behandling. VVM resultater viser, at RV behandling har ingen signifikant virkning på cAMP-niveauer i A549-celler (Figur S1a). Mere interessant er de data, at RV inhiberer niveauerne af cAMP i H460 celler (Figur S1B). Disse resultater tyder på, at cAMP ikke kan være en nøglespiller i mediere RV-induceret ROS generation i lunge kræftceller.

De NADPH oxidaser (NOXS) er en familie af transmembrane enzymer, der genererer superoxid og andre ROS [41] . For bedre at forstå, hvordan RV inducerer ROS generation i kræftceller, undersøgte vi, hvis RV behandling har nogen indflydelse på ekspressionen af ​​Nox1, Nox2, NOX3, Nox4 og Nox5 i NSCLC celler. Real-time RT-PCR resultater viser, at Nox1, 2 og 5 er rigeligt udtrykt i både A549 og H460 celler, hvorimod Nox 3 og 4 er knap påviselig i lungecancerceller (figur S2). Overraskende, vores data viser, at RV behandling selektivt øger Nox5 udtryk i både A549 og H460-celler (fig. 6A og 6C), tyder på, at RV-induceret ROS generation i cancerceller sandsynligvis tilskrives øget Nox5 udtryk. I betragtning af de vigtige roller antioxidant enzymer såsom mitokondrie superoxiddismutase (SOD) og thioredoxin (TXN) modulering intracellulær ROS balance [42], besluttede vi at bestemme, om RV behandling påvirker ekspressionen af ​​SOD og TXN i lungecancerceller. Den real-time PCR-data viser, at RV behandling kun forårsager en beskeden stigning (mindre end 2 gange) i SOD2 udtryk i A549 celler, men har ingen effekt på ekspressionen af ​​SOD1, SOD2 og TXN mRNA i H460 celler (fig. 6B og 6D). Sammen antyder disse data, at RV kan fremkalde ROS generation i kræftceller via opregulering Nox5 udtryk.

(A) Celler blev behandlet med 50 pM af RV eller DMSO som kontrol køretøj. Fireogtyve timer efter RV behandling blev ekspressionsniveauerne af Nox1, Nox2, og Nox5 mRNA’er bestemt under anvendelse real-time RT-PCR. (B) Ekspressionsniveauerne for SOD1, SOD2 og TXN i A549 celler blev bestemt ved real-time RT-PCR. (C) Ekspressionsniveauerne for Nox1, Nox2, og Nox5 i H460-celler er vist som gange ændring (middel ± SEM). (D) Ekspressionsniveauerne for SOD1, SOD2 og TXN i H460 celler præsenteres. **,

s

. 0,001 vs. kontrol

Diskussion

Cellular ældning er en tilstand af permanent cellecyklusstop der kan udløses af en række af spændinger, herunder DNA-skade, telomer afkortning og oxidativ stress. Senescens begrænser levetiden og proliferativ kapacitet af celler, derfor induktion af senescens betragtes som en vigtig mekanisme til forebyggelse af kræft [20] – [22]. Endnu vigtigere er voksende beviser vist, at terapi-induceret ældning er en kritisk virkningsmekanisme for mange kemoterapeutiske stoffer og strålebehandling [11], [12], [15], [17], [23]. Men bidrag ældning induktion til RV anticancer og kemoforebyggende virkninger er ikke godt belyst. Her giver vi eksperimentelle data til påvisning, at lav dosis RV behandling hæmmer væksten af ​​lungekræft celler via en apoptose-uafhængig mekanisme. Resultaterne viser, at RV kan udøve sin anticancer og kemoforebyggende aktiviteter via induktion af senescens i cancerceller. I overensstemmelse med vores observationer, Rusin et al. også rapporteret, at RV behandling inducerer senescens-lignende fænotype i cancerceller [43]. Dette er et vigtigt resultat, fordi induktion af senescens, i modsætning til apoptose, kræver meget lavere koncentration af RV, hvilket tyder RV kunne være nyttigt klinisk. Desuden disse undersøgelser understreger betydningen af ​​senescens induktion ved mediering RV kemoforebyggende og anticancer effekter.

Det er blevet veletableret, at induktionen af ​​DNA-ødelæggelse er en central mekanisme, gennem hvilken mange anticancermidler herunder ioniserende stråling dræber tumorceller [13], [15], [38], [44]. Af de forskellige typer af DNA-skader, DNA DSBs er de mest cytotoksiske på grund af deres store potentiale til at forårsage celledød og /eller cellecyklus arrest. Således blev en øget kapacitet af DNA skader reparation i tumorceller menes at være en vigtig bidragyder til terapi-modstand under kræftbehandling [45]. Interessant nok er det blevet vist, at mange DNA-beskadigende midler, såsom ioniserende stråling kan inducere DNA-skade-medieret tidlig ældning i kræftceller, hvilket antyder, at disse terapeutiske midler kan udøve deres anticancer effekter via DNA beskadigelse-medieret tidlig aldring [13], [ ,,,0],15]. Selvom vores data har vist, at RV inducerer præmatur ældning i lungecancerceller på en dosis-afhængig måde, var stort set ukendt, hvis DNA-beskadigelse er involveret i RV-induceret senescens i tumorceller. Denne undersøgelse viste, at γH2AX brændpunkter, en vigtig surrogat af DNA DSB’er, markant blev forøget i RV-behandlet NSCLC celler i forhold til kontrol celler. Disse data antyder, at DNA-beskadigelse-induceret for tidlig ældning kan bidrage til de anticancer effekter af RV. Overensstemmelse med vores observationer, blev det konstateret, at RV kan inducere plasmid DNA-brud i nærvær af Cu (II) og under oxidative betingelser [46]. Disse resultater understøtter den hypotese, at lavdosis RV behandling undertrykker væksten af ​​lungecancerceller via DNA beskadigelse-induceret for tidlig ældning.

Aktivering af p53-p21-vejen ved DNA-skade er blevet vist at være en kritisk mekanisme bag SIPS [12], [15], [17], [18]. Her viser vi, at RV-induceret for tidlig ældning er forbundet med forøget ekspression af p53 og p21 i NSCLC-celler, hvilket antyder, at aktivering af p53-p21-vejen kan spille en vigtig rolle i modulering RV-induceret senescens i lungecancerceller. Mere vigtigt blev det også konstateret, at RV-induceret senescens korrelerer godt med et signifikant fald i EF1A ekspression i A549 og H460 celler. Disse nye resultater viser for første gang, er at nedregulering af EF1A involveret i RV-induceret for tidlig ældning i lungecancerceller. I overensstemmelse med disse observationer har en nylig undersøgelse foreslået, at nedsat ekspression af EF1A er en potentiel biomarkør for tidlig ældning [47]. Men der vil være behov, yderligere undersøgelser for at definere den præcise rolle EF1A i modulerende RV-induceret tidlig ældning i kræftceller.

Mange anticancermidler og ioniserende stråling ødelægge tumorceller hovedsagelig gennem generering af ROS [48]. Desuden øgede ROS kan udløse oxidative DNA-skader og forårsage DNA DSBs, hvilket fører til for tidlig ældning [37]. For at bestemme rollen af ​​ROS i RV-induceret for tidlig ældning i lungecancerceller, undersøgte vi niveauet af ROS i RV-behandlede A549 og H460 celler under anvendelse DCF-DA farvning og flowcytometriske assays. Dataene viser, at RV-induceret aldring er forbundet med forøget ROS produktion og DNA DSB’er i lungecancerceller, hvilket antyder, at RV kan inducere præmatur ældning i lungecancerceller via ROS-medieret DNA-beskadigelse. Det vigtige bidrag af ROS til RV-induceret DNA-skader og for tidlig ældning blev yderligere bekræftet af de bemærkninger, at hæmning af ROS produktion af NAC dæmper RV-induceret DNA-skader og ældning i NSCLC celler. I overensstemmelse med disse observationer blev en pro-oxidant effekt af RV også observeret i U937-leukæmiceller og er karakteriseret ved nedbrydning af GSH og en stigning i ROS produktion [49]. Endvidere tidligere undersøgelser af Hadi og medarbejdere viste også, at RV kan øge ROS-generering og ROS-induceret DNA-skader i humane perifere lymfocytter [50], [51]. Sammen disse resultater viser, at lav dosis RV hæmmer væksten af ​​lungekræft celler via induktion af ældning gennem ROS-medieret DNA-skader.

Det er værd at bemærke, at der er beviser for, at RV kan fungere som en ROS scavenger i normale celler til at beskytte mod ioniserende stråling-induceret oxidativt stress og vævsskade [52], hvilket antyder, at RV kan have forskellige virkninger på ROS produktion i normale versus cancerceller. Eftersom afvigende redoxsystemer ofte observeres i mange tumorceller [48], [53], [54], er det muligt, at RV selektivt kan undertrykke væksten af ​​tumorceller med ringe eller ingen toksicitet over for normale celler på grund af deres differential redox status. Efter aftale med denne hypotese, vores data viser, at RV behandling ikke har nogen signifikant effekt på ekspressionen af ​​SOD1, SOD2 og TXN i H460 lungekræft celler, selv om det blev rapporteret, at RV kunne fremkalde en betydelig (mere end 6 gange) forøgelse i SOD2 ekspression i normale celler [55]. Endnu vigtigere, vores undersøgelser viser for første gang, at RV selektivt øger Nox5 udtryk i NSCLC celler, hvilket antyder, at RV kan fremkalde ROS generation i kræftceller via opregulering Nox5 udtryk.

Materialer og metoder

reagenser

Resveratrol (Trans-3, 4 ‘, 5-trihydroxystilnene) og alle andre kemikalier blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO). Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) og andre dyrkningsmedier blev opnået fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Kanin-anti-humant p53-antistof og kanin-anti-humant EF1A monoklonalt antistof blev købt hos Cell Signaling (Danvers, MA). Muse-anti-humant p21 monoklonalt antistof blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology. Monoklonalt β-actin-antistof blev købt hos Sigma. En senescens-associerede β-galactosidase (SA-β-gal) farvning kit blev købt hos Cell Signaling. Den muse-anti-phospho-histon H2AX (γH2AX) monoklonalt antistof blev købt fra Millipore (Billerica, MA). TRIzol-reagens og SuperScript III første-stativ syntesesystem blev indkøbt fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Cyklisk AMP (cAMP) EIA kit blev købt fra Cayman Chemical (Ann Arbor, MI).

cellelinjer og kultur

Humant ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinier A549 og H460 blev indkøbt fra American Type Culture Collection. A549-celler blev dyrket i DMEM medium indeholdende 10% FBS, 2 mM L-glutamin og 100 mikrogram /ml penicillin-streptomycin (Invitrogen). H460 celler blev dyrket i RPMI-1640-medium indeholdende 10% FBS, 2 mM L-glutamin og 100 mikrogram /ml penicillin-streptomycin (Invitrogen).

Klonogen overlevelse assay

klonogene assays var udført for at bestemme virkningerne af RV behandling på kolonidannende evne NSCLC-celler. Kort fortalt, A549 og H460 lungecancer-celler blev dyrket ved lav densitet i nærvær af forskellige koncentrationer af RV eller DMSO som vehikelkontrol i 60 mm skåle i 10 til 12 dage for at tillade dannelse cellekolonier. Kolonier blev fikseret og farvet med 0,5% krystalviolet (Sigma) i methanol i 30 min. Antallet af kolonier (≥ 50 celler) blev scoret med en mikroskopi.

Ældning-associeret β-galactosidase (SA-β-gal) farvning

In situ-farvning af SA-β-gal blev udført under anvendelse af en senescens β-galactosidase-farvning kit (Cell Signaling) som tidligere beskrevet [56].

Western blotting-analyse

A549 og H460-celler blev behandlet med forskellige doser af RV eller DMSO som kontrol. Totale celleproteiner blev fremstillet 24 timer efter behandling under anvendelse cellelyse-buffer (Cell Signaling) suppleret med en cocktail af proteinaseinhibitorer (Sigma). Western blotting-analyse blev udført som tidligere beskrevet [56]. Kort fortalt blev halvtreds mikrogram proteinprøver opløst på 10% Mini-Protean TGX geler (Bio-Rad) og overført til 0,2 uM PVDF-membran (Millipore). Blots blev blokeret med 5% fedtfri mælk i 1-2 timer ved stuetemperatur og derefter probet med primære antistoffer og inkuberes ved 4 ° C natten over. Efter grundig vask med TBS-T, blev blots inkuberet med passende HRP-konjugeret sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. Proteinbånd blev påvist ved anvendelse af et ECL Plus Western Blotting Detection System (GE Healthcare Life Science).

Immunfluorescerende mikroskopisk analyse af γH2AX foci Salg

Celler blev dyrket på 4-brønds kammerobjektglas natten over, og næste dag behandlet med RV eller DMSO (køretøj kontrol). Ved udgangen af ​​ønskede behandlinger tidspunkter blev celler fikseret med iskold 4% paraformaldehyd i 10 minutter og vasket to gange med PBS. Derefter blev cellerne permeabiliseret med 0,2% Triton X-100 /PBS på is i 10 min.