PLoS ONE: Multipotente Kræft stamceller fra menneskelige malignt peritoneal mesotheliom Fremme Tumorigenesis

Abstrakt

Under udviklingen af ​​maligne peritoneal mesotheliom (MPEM), tumor knuder udbrede diffust i maven og tumorer er karakteriseret ved særskilte fænotypiske undertyper. Nylige undersøgelser i faste organer cancere har vist, at cancer stamceller (CSCS) spiller en central rolle i initieringen og fremadskriden af ​​tumorer. Det er imidlertid ikke, om der findes tumorigene stamceller og om de fremmer tumorvækst i MPEM. I denne undersøgelse har vi udviklet og karakteriseret en CSC model for MPEM hjælp stabilt ekspanderbare tumorigene stamceller fra patientens tumorer. Vi fandt morfologisk forskellige populationer af CSCS der deler asymmetrisk eller symmetrisk i MPEM

in vitro

cellekultur. De MPEM stamceller (MPeMSCs) udtrykkelig stamcellemarkører c-myc, NES og VEGFR2 og i nærvær af matrixbestanddele celler danner kolonier sfærer. MPeMSCs er multipotente, differentierer til neuronal, vaskulære og adipøst afkom efter defineret induktion og de differentierende celler udtrykker afstamning-specifikke markører, såsom TUBB3, en tidlig neuronal markør; vWF, VEGFA, VEGFC og IL-8, endotheliale markører; og PPARy og FABP4, fedt-markører. Xenotransplantation eksperimenter ved hjælp MPeMSCs demonstrerede tidligt tumorvækst sammenlignet med stamcellerne. Begrænsende fortynding eksperimenter under anvendelse MPeMSCs og endotele afstamningsceller-inducerede celler afledt af en enkelt MPeMSC resulterede i tidlig tumorvækst i sidstnævnte gruppe, som angiver, at endotel differentiering af MPeMSCs er vigtig for MPEM tumorinitiering. Vores observation, at de MPEM tumorer indeholder stamceller med tumorigent potentiale har stor betydning for forståelsen af ​​cellerne oprindelses- og tumor progression i MPEM og dermed målrettet CSCS kan være en nyttig strategi til at hæmme ondartet progression

Henvisning:. Varghese S , Whipple R, Martin SS, Alexander HR (2012) multipotente Cancer stamceller fra menneskelige malignt peritoneal mesotheliom Fremme tumorigenese. PLoS ONE 7 (12): e52825. doi: 10,1371 /journal.pone.0052825

Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center og Beckman Research Institute, USA

Modtaget: August 13, 2012; Accepteret: November 23, 2012; Udgivet: December 28, 2012 |

Copyright: © 2012 Varghese et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft stem- (lignende) -celler med selv -renewal og tumorfremkaldende potentiale er blevet identificeret i forskellige tumortyper [1] – [3] og nylig dokumentation antyder, at disse celler spiller en central rolle i udviklingen af ​​maligne tumorer. CSC Modellen beskriver eksistensen af ​​en lille delpopulation af plast celler med transdifferentiering potentiale i tumorer. De seneste undersøgelser tyder, at en betydelig del af celler i tumorer opretholde stamcelle egenskaber og endnu mere differentierede celler kan transformeres til stamceller-lignende celler [4], [5]. Hvis dette er tilfældet, kan eliminering af CSCS ikke være en nyttig strategi til reduktion af tumorvækst. Derfor er det vigtigt at udvikle modeller til at forstå CSC biologi og identificere nye strategier for at forhindre malign tumor progression. De mekanismer, der regulerer selv-fornyelse af både CSCS og normale stamceller menes at være ens [6]. I øjeblikket har identificering og isolering af CSCS vid udstrækning været afhængig af specifikke celleoverflademarkører [7], [8], selv om ekspressionen af ​​sådanne markører er afhængig af forskellige faktorer, såsom differentiering af cellernes og niche faktorer. CD133 er blevet anvendt som en formodet stamcelle markør i glioblastom [9] og tyktarmskræft [10], CD34 udtrykkende tumor epitelceller som CSCS i kutane cancer [11], CD44 udtrykkende celler i brystcancer [12], CD26 positive celler er involveret i processen med metastaser, invasionsevne og kemoresistens i tyktarmskræft [13], CD271-positive celler initiere melanom progression og metastase [14] og egenskaberne af CSCS blev identificeret i CD24-positive pleurale mesotheliom celler [15]. Der har imidlertid ikke været nogen beviser for eksistensen af ​​stamceller-lignende celler, der initierer tumorvækst i MPEM. Derfor undersøgte vi tilstedeværelsen af ​​tumorigene lungehindekræft celler med egenskaber CSCS i stabile cellelinier afledt MPEM patient tumorer

malignt peritoneal mesotheliom stammer diffust i serøse foring af bughinden.; Det er en aggressiv kræft med en markant tendens til regionale metastaser. Ved diagnose, er denne kræft generelt fundet på et stadium af diffus malign progression med et stort antal variabelt dimensionerede tumorknuder. Generelt tumorer har en dårligt vaskulariseret tyk indre kerne omgivet af et ydre neovaskulær område. Behandlingsmuligheder såsom kirurgisk cytoreduktion og systemisk kemoterapi kan styre tumor progression hos nogle patienter, men patienten død skyldes overvejende progressiv tumor tilbagefald. Vi har for nylig rapporteret, at aktivering af phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) og pattedyr mål for rapamycin signalering i MPEM er forbundet med forkortet patient overlevelse [16]; disse veje er involveret i stamcelle aktivering og proliferation [17], [18]. PI3K-signalering er også vigtigt for opretholdelse af cellepolaritet i cancerceller [19].

Selvom de afledte MPEM cellelinier overleve på ubestemt tid under passage, i denne undersøgelse anvendte vi tidlig passage-celler afledt fra patientens tumorer til undgå valg af en bestemt delmængde af aggressive tumor initierende celler bevaret under langvarig passage. Her identificerede vi, at en væsentlig del af prospektivt genererede stabile MPEM celler i kultur generere flydende celler med egenskaber af embryonale stamceller, såsom asymmetriske celledeling, selv-fornyelse og multipotency. De tilfældigt udvalgte enkelte MPeMSCs viste klonal progression, fænotypisk diversitet under definerede betingelser og transdifferentiering potentialer. Derfor kan den betydelige plasticitet MPeMSCs bidrager til dannelsen af ​​udviklingsmæssigt forskelligartet cellepopulation findes i tumorer og aggressivitet af tumorer under patologiske progression. Kollektivt, vores undersøgelse afslører, at MPEM havn CSCS og tumor progression skyldes selv-fornyelse og differentiering af CSCS.

Resultater

morfologisk forskellige populationer af MPeMSCs der deler Asymmetrisk eller symmetrisk, og Express Stem Cell Markers

Blandt de stabile MPEM cellelinjer genereret, Meso-CL1 var PTEN negativ

(neg), mens Meso-CL2 og Meso-CL3 var PTEN udtrykke cellelinjer (fig. S1). Selv om alle tre MPEM cellelinjer genereret stamceller med selvfornyelse der løsnes og flyde i kultur før adhærent vækst, Meso-CL1 har tilbøjelighed til at generere tumorxenoplantater upon subkutan eller intraperitoneal implantation hos immunkompromitterede mus og blev anvendt til at generere en MPEM CSC model . Generelt mammale CSCS danne multiple aggregater af kugleformede kolonier i kultur [20]; kolonidannelse var begrænset, da MPeMSCs blev dyrket under standard adhærente celle dyrkningsbetingelser. Imidlertid blev klonal sfære dannelse aktiveres, når cellerne blev dyrket i en Matrigel plade. Lysmikroskopi undersøgelser har identificeret to morfologisk forskellige populationer af CSCS i MPEM kultur; celler med eller uden et ydre indkapslende dækker, både udstillet asymmetrisk eller symmetrisk division. For at demonstrere, at de isolerede celler opretholder stamceller egenskaber, vi uropført time-lapse studier på levende celler i kultur og immunofluorescens studier i formaldehyd-faste celler og fandt, at cellerne delt både asymmetrisk og symmetrisk (fig. 1A, B). I en asymmetrisk deling, celler delt ulige generere en stor stamcelle og en lille celle generelt betegnes som progenitorceller. Pulse-chase forsøg under anvendelse thymidinanalogen BrdU har vist, at under asymmetrisk celledeling template-DNA mærket med BrdU efter en lang impuls, der udelukkende adskilt i den nye stamcelle, hvorimod det nyligt syntetiserede DNA kondenseret inden den differentierende celle. Derudover har vi også fundet, at begge datterceller under symmetrisk celledeling delte template-DNA’et (fig. 1C). En anden morfologisk forskellig befolkning CSCS blev identificeret i MPEM kultur med en indkapsling ydre dækker, der dannes af de parentale celler som mørke boble-lignende fremspring. De nydannede celler løsrevne fra forældrenes celle og svævede i kultur og celler ‘hatched’-out fra det ydre dække at initiere vækst. På grund af den flydende karakter af disse celler, time-lapse studier var forgæves; imidlertid de lette og fluorescerende mikroskopi beviser tyder på, at cellerne også delt asymmetrisk eller symmetrisk (fig. 2A). Som fundet i andre cancercellelinier, har vi også identificeret store multi-kerneholdige adhærente celler i cellekultur, der genererer en eller flere stamceller typisk oprindelse fra kernen uden fuldstændig cytokinese af den parentale celle (fig. 2B).

(A) Time-lapse billeder af asymmetrisk og symmetrisk celledeling i MPeMSCs. Asymmetrisk celledeling (pile) genererer to ulige celler (øverste panel); symmetrisk celledeling (pile) genererer to identiske celler (nederste panel). Cellestørrelse vist i uM. Tid (timer: minutter) bemærkede i nederste venstre hjørne. Scale bars: 20 uM. (B) Fluorescerende billeder af asymmetrisk (øverste felt) og symmetrisk (nederste panel) celledeling i MPeMSCs. Hoechst nuklear farvning viser asymmetrisk og symmetrisk deling af celler. (C) DNA adskilt asymmetrisk under celledeling (øvre panel). Celler dyrkes i BrdU i flere passager (pulsen periode), og efter en lang puls BrdU fjernes fra cellekulturen (jagten); BrdU retention i de delende celler blev undersøgt under anvendelse af anti-BrdU-antistof. I en asymmetrisk celledeling, template-DNA mærket med BrdU adskilt i den nye datter stamcelle henviser det nyligt syntetiserede DNA uden BrdU etiket kondenseret inden den differentierende celle. Under symmetrisk celledeling BrdU mærket adskilt DNA tilfældigt inden for de datterceller (nederste panel).

(A) Dannelse af MPeMSCs med kapselskrumpning dækker og mulig asymmetrisk og symmetrisk stamceller division. a, b, CSCS stammer fra de parentale celler som mørke boble-lignende fremspring (pile). Celler løsnes og flyde i kulturen og MPeMSCs “luge ud” af kapslen (pile). c, Asymmetrisk celledeling i kapselformede stamceller. Asymmetrisk delende celler stammer fra kapslen (øvre panel, pile) eller cellerne deler ulige sammen med kapslen genererer to ikke-identiske celler (nederste panel). d, Symmetric celledeling af en kapsulært stamcelle. Scale barer: 100 px. e, f, Fluorescerende billeder af asymmetrisk (e) og symmetrisk (f) celledeling af indkapslede celler. Pile angiver den ydre kapsel tildækning af celle (B) en, MPeMSCs stammer fra kernen af ​​en flercellede celle; den nydannede celle bevæger sig gennem cytoplasmaet og frigøres fra den parentale celle. B, Oprindelse af flere CSCS fra en flercellede celle. c, Fluorescerende billeder af en flercellede celle.

Næste vi fastslået, om de isolerede MPeMSCs virkelig stammede fra forældrenes maligne mesothelial celler. Vi vurderede ekspressionen af ​​et kendt mesotheliom markering, MSLN, og fundet en robust ekspression af genet i begge MPeMSCs og parentale MPEM celler (fig. 3A). Stamcellen egenskaber af de isolerede MPeMSCs blev yderligere bestemt ved ekspressionen af ​​kendte stamcellemarkører herunder NANOG, SOX2, OCT4, c-MYC og KLF4 (fig. 3B). Interessant mønstret for ekspression af tidlige stamceller markører var ens i begge parentale celler og MPeMSCs hvorimod c-myc-ekspression var betydeligt højere i MPeMSCs sammenlignet med parentale celler. Omvendt er den pluripotente stamcelle markering, CD133 og endotheliale stamcellemarkører, CD31 og CD144, kunne ikke påvises i MPeMSCs (fig. 3C).

(A) Relativ mRNA ekspression af mesothelin (MSLN) og (B) de stamceller markørgener i forældrenes MPEM celler og i MPeMSCs. c-myc-ekspression var signifikant højere (*

s

0,05) i MPeMSCs mens andre stamcelle markører viste forholdsvis lignende mønster af udtryk i begge grupper. (C) Flowcytometri evaluering af human CD133, CD31 og CD144 viste, at proteinerne ikke udtrykkes i MPeMSCs. Bar diagrammer er udtrykt som middelværdi ± SEM.

Multiple Lineage Induktion i MPeMSCs

multipotency er kendetegnende for stamceller. Men det ikke er blevet endeligt påvist, at CSCS kan opnå flere skæbner upon afstamning induktion. At demonstrere evnen af ​​MPeMSCs at opnå flere skæbner, CSCS blev dyrket i de neuronale, vaskulære og adipøse differentieringstilstande. Når sub-sammenflydende vedhæftende MPeMSCs blev behandlet med trans-retinsyre, efterfulgt af tilsætning af neural differentiering medium, celler differentierede til neuron-lignende celler med typisk neuronal morfologi. Fluorescerende billeddannelse og qPCR studier af mRNA-ekspression viste, at de neuronal cellelinje-inducerede celler udtrykte neurale stamcelle markør NES og en tidlig neuronal markør TUBB3; imidlertid viste BEX1 ingen signifikant forskel mellem MPeMSCs og neurale differentierede celler (fig. 4A). De flydende neurale stamceller fra de neuronale differentierede celler blev indsamlet og dyrket i flere generationer til at demonstrere selv-fornyelse og mange af disse celler viste typiske neuronale morfologi.

(A) Differentiering af MPeMSCs i neuron-lignende celler i det neurale differentiering medium (pil). Immunofluorescens og relative mRNA ekspression undersøgelser viser, at differentierede neuronale celler udtrykker den neurale stamceller markør nestin og en tidlig neuronale markør βIII-tubulin (*

s

0,01). (B) Endothelial differentiering af MPeMSCs on a Matrigel overflade danner rørformede net (pile). Fluorescerende imaging viser, at celler udtrykker det endotel stamceller markør, VEGFR2, og optagelse af Dil-AcLDL af differentierede endotelceller. Relative mRNA ekspression undersøgelser viser, at VEGFR2 og VEGFR3 udtryk under endotel differentiering faldet væsentligt (*

s

0,05), mens de udtryk for endotel cellemarkører, vWF, VEGFA, VEGFC og IL-8 signifikant forøget (*

s

0,001). (C) En enkelt MPeMSC danne en koloni kugle på en Matrigel overflade efterfulgt af grundig proliferation af MPeMSCs. Scale bars 100 px. (D) MPeMSCs differentieret i adipocytter (Oil Red) og (F) udtrykker adipocyt markører PPARy og FABP4 (*

s

0,01) i fedt- differentierede celler sammenlignet med kontroller. Bar diagrammer er udtrykt som middelværdi ± SEM; ND, ikke påviselig.

Vi næste vurderede evne MPeMSCs til dannelse endotelceller. MPeMSCs udtrykke VEGFR2, en endothelial progenitor cellemarkør. Embryonale stamceller positive for VEGFR2 danner vaskulære stamfædre og omdanne til modne blodkar [21]. For at undersøge differentieringen af ​​MPeMSCs til endotel afstamning blev celler dyrket i dyrkningsskåle overtrukket med kælder-membran matrixkomponenter (Matrigel). På Matrigel, celler induceret endotel celledifferentiering og dannede rørformede net. Genekspressionsstudier i endotel slægt-inducerede celler sammenlignet med MPeMSCs afslørede, at VEGFR2 og VEGFR3 udtryk blev væsentligt reduceret i celler under endotel differentiering mens ekspressionen af ​​vWF, VEGFA og VEGFC blev opreguleret i differentierende celler. Tilsvarende pro-angiogen faktor, IL-8 udviste en stigning på 10 gange i løbet af endothelial celledifferentiering sammenlignet med MPeMSCs. For yderligere at validere endotel differentiering blev celler inkuberet med lav densitet lipoprotein, Dil-AcLDL, og fandt optagelse af lipoproteiner ved endotheliale differentierede celler (fig. 4B). I Matrigel MPeMSCs også danne koloni sfærer efterfulgt af den omfattende proliferation af celler (fig. 4C). De prolifererende celler generere flere klonale kugler i

in vitro

cellekultur lette den hurtige spredning af endotel stamceller.

For at afgøre, om MPeMSCs differentiere til adipocytter blev cellerne udsat for trans-retinsyre efterfulgt af adipose differentiation medium og testet for intracellulær neutralt lipid akkumulering. Lipidaflejringer blev identificeret i fedt- differentierede celler. Kontrol- og differentierede celler blev yderligere analyseret for kendte adipocyt markører ved hjælp af qPCR og fandt en signifikant opregulering af PPAR og FABP4 (fig. 4D, F).

Tumor Dannelse fra encellede MPeMSCs

Vores indledende undersøgelser under anvendelse MPEM parentale celler har vist, at injektioner af 3 × 10

6 Meso-CL1-celler var i stand til at generere både subkutane og intraperitoneale tumorer hos immunkompromitterede mus henviser Meso-CL2 og Meso-CL3 var ikke-tumorigene. I subkutant injicerede mus, Meso-CL1 celler konsekvent genereret først håndgribelig tumor på dag 30 efter tumor celle transplantation mens lignende injektioner af MPeMSCs tog kun 15 dage til at udvikle den første håndgribelig tumor. Omvendt transplantation af neurale afstamningsceller-inducerede celler udviste tumor palpering på dag 35 hvilket viser, at både parentale celler og neurale differentierede celler havde lignende tumorigene potentiale. Undersøgelser har vist, at injektioner af tumorceller suspenderet i Matrigel har højere frekvenser af tumordannelse [22]. Vores

in vitro

studier viste, at Matrigel forfremmet endotel differentiering og aktivering af angiogene faktorer i endotel differentierede celler. Derfor er det muligt, at et lille antal MPeMSCs kunne generere tumorer inden en endotel niche. For at teste betydningen af ​​endotelceller differentiering af MPeMSCs på tumorvækst, udførte vi begrænsende fortynding eksperimenter. Fem hundrede celler afledt af en enkelt umarkeret MPeMSC injiceret med Matrigel genereret tydelige tumorer i mus på dag 59 efter tumorcelle transplantation henviser mus modtog et lige stort antal celler suspenderet i PBS voksede ikke tumorer under en to måneders periode (fig. 5A) hvilket indikerer, at endotel differentiering af CSCS er centralt for tumorvækst. For at teste

in vivo

transdifferentiering af endotelceller afledt fra MPeMSCs blev tidlige tumorer afledt af endotheliale afstamningsceller-rettet celler co-injiceret med Matrigel analyseret for ekspression af NES og TUBB3 og fandt, at celler udtrykker både neuronale proteiner ( fig. 5B).

(A) parentale celler, hvorfra MPeMSCs afledt blev injiceret subkutant (n = 8) i den højre flanke af athymiske nøgne mus (nu /nu). Første håndgribelig tumor optrådt på dag 30 efter tumorcelleinjektion. Lignende injektioner af MPeMSCs (n = 8) genererede palpable tumorer på dag 15 (slut-stadie tumorer er vist). I begrænsende fortynding eksperimenter blev celler afledt af en enkelt MPeMSC delt og dyrket enten i en Matrigel plade til at inducere endotel differentiering eller i en ordinær celle kultur plade med LIF holdigt medium. Fem hundrede celler dissocieret fra den første gruppe blev resuspenderet i Matrigel og injiceret subkutant (n = 8). Tumorer blev først fundet ved palpering på dag 59 (mus med 60 dages tumorvækst efter tumor palpation er vist), hvorimod tilsvarende injektioner af MPeMSCs (n = 10) resuspenderet i PBS ikke generere tumorer. (B) Hematoxylin og eosin (H NES og TUBB3.

Diskussion

Det vigtige fund fra denne undersøgelse er at identificere CSCS med karakteristisk asymmetrisk stamcelle division og tumorgenicitet i humane MPEM tumorer. Til dato CSC markører er ofte blevet brugt til at identificere og isolere stamceller fra tumorer. Der er imidlertid ikke stamcellemarkør vist sig at være en universel markør for CSCS. Defineret kultur af MPeMSCs afledt af patientens tumorer fremmet selvfornyelse, kolonidannelse og multilineage differentiering bekræfter en stamcelle fænotype. Det særlige ved MPeMSCs end andre CSCS er, at cellerne sjældent danner klonale sfærer i regelmæssig Tilhænger cellekultur, og derfor den enkelte celledeling mønster kan visualiseres ved hjælp af mikroskopi, som hjælper med at identificere og isolere CSCS. Asymmetrisk celledeling er karakteristisk for embryonale stamceller og vores time-lapse undersøgelser viste, at MPeMSCs deler asymmetrisk og datterceller arver distinkte cytoplasmatiske komponenter [23] for at danne stamceller og differentierende celler. Denne iagttagelse blev yderligere understøttet af procedure BrdU mærkning pulse-chase og fandt, at skabelon-DNA’et bevarer inden datter stamcelle. Desuden fandt vi symmetrisk celledeling i MPeMSCs genererer celler med omtrent lige store størrelser. Bortset fra disse karakteristiske stængel celledelinger, MPeMSCs vise en anden mekanisme til stamceller proliferation ved at generere celler indkapslet i en membranøs ydre dækker. Disse celler generelt flyde i kultur, og vise både asymmetrisk og symmetrisk division. Betydningen af ​​kapselskrumpning stamceller dannelse skal undersøges nærmere. Det er muligt, at dannelsen af ​​sådanne indkapslede celler er niche homeostase afhængig, og som tillader CSCS at proliferere hurtigt og overleve under ugunstige niche betingelser. De unikke morfologiske karakteristika ved disse celler kan også anvendes til identifikation CSCS

in vitro

. De afledte MPeMSCs signifikant udtryk for MSLN, en fremtrædende markør for lungehindekræft [24] indikerer, at CSCS stammer fra forældrenes lungehindekræft celler. De stamcellemarkører testet i både parentale celler og MPeMSCs viser ligheder i deres ekspression, med undtagelse af MYC oncogenet, og denne sammenhæng i genekspression viser, at parentale celler også have potentiale for dedifferentiering [5]. Myc oncoprotein som aktiveres i flere tumortyper [25] er betydeligt opreguleret i MPeMSCs; MYC-genet er vigtigt for stamcelleproliferation og til opretholdelse af pluripotente egenskaber af stamceller [26], [27].

Nylige rapporter om stamceller-lignende celler afledt af glioblastoma tyder på, at CSCS differentiere til endotelceller under tumorvækst [28], [29]. For yderligere at bekræfte tilstedeværelsen af ​​stamcelle-fænotype i MPEM testede vi multipotency af MPeMSCs ved at dyrke dem i flere differentieringstilstande. Celler blev først dyrket i serum-minimeret neuronal differentiering betingelser og fandt, at MPeMSCs differentieret til celler med typisk neural morfologi og udtrykt neuronale markører. Vi identificerede NES som et vigtigt neuronal stamcellemarkør i MPeMSCs og dets ekspression blev også fundet i xenotransplantattumorer indikerer, at neuronal differentiering af endotelceller er muligt under tumorvækst. Tilsvarende endothelial stamcellemarkør VEGFR2 ekspression var også markant høj i MPeMSCs; i en matrix niche celler differentieret i endotelceller [9] med typiske rørformede netværk tyder MPeMSCs er uløseligt programmeret til endotel differentiering. Denne direkte bidrag MPeMSCs til tumorvaskulaturen kan være vigtigt for den hurtige og diffus tumorvækst fundet i MPEM patienter. Neurale stamceller er ektodermal oprindelse henviser endotelceller stammer fra mesoderm. Imidlertid kan endotelceller-lignende celler afledes fra neurale stamceller [30]. I vores undersøgelser (upublicerede data) når neurale differentierede celler blev podet i en Matrigel plade, celler differentierede til endotelceller med typiske rørformede net indikerer transdifferentiering af afstamningsceller-begået celler. Det er blevet rapporteret, at endotelceller transdifferentiate ind mesenchymalceller at inducere stamceller-lignende egenskaber [31]. Kliniske undersøgelser har vist, at fordelene ved antiangiogen terapi for kræft er begrænsede, og i mange tilfælde antiangiogene terapier resulterer i en indledende reaktion efterfulgt af tumor tilbagefald [32]. I denne sammenhæng vaskulær differentiering af CSCS bopæl i tumorerne kan have en central rolle i hastigt påfyldning endotelceller.

Ingen undersøgelse hidtil har behandlet, at en bestemt celletype initierer tumorvækst hos patienter. Vores første xenotransplantation undersøgelser med anvendelse af leukæmi hæmmende faktor (LIF) behandlet udifferentierede MPeMSCs viste en tidlig tumor induktion i mus, der beviser, at MPeMSCs er tumorigent. Selvom MPeMSCs ikke danner koloni sfærer i adhærerende cellekultur, enkelt cellekultur i en matrix plade genereret koloni sfærer viser stamcelle-fænotype af de afledte celler. I denne undersøgelse frembragte vi en CSC tumormodel hjælp af et begrænset antal celler prolifererede fra en enkelt MPeMSC. Data fra denne undersøgelse, når de ses sammen med

in vitro

beviser støtter en model, hvor MPeMSCs resuspenderes i Matrigel fremmer aggressiv tumorvækst hovedsagelig på grund af endotel differentiering af CSCS fordi alle injicerede mus udviklede palpable tumorer ca. 60 dages tumor celle injektion. Omvendt tumor palpering var ikke tydelig i mus injiceret med udifferentierede MPeMSCs resuspenderet i PBS. Selvom celler med tumorigent potentiale ligeligt fordelt i to grupper, de matrixkomponenter fremmet kolonidannelse og den hurtige induktion af endotel afstamning. I tumorer endotelceller dedifferentiere eller transdifferentiate at danne mere Stem-lignende celler eller andre særskilte celletyper, der kan bidrage til en tidlig tumorvækst. Det er blevet vist, at mikromiljøet omkring neovaskulatur af tumorer er stærkt proliferative og CSCS er blevet fundet i tæt nærhed til endotelceller [33]. Sammen vores data tyder på, at multipotency og plasticitet MPeMSCs kan være en medvirkende faktor til MPEM tumorvækst hos patienter. Yderligere undersøgelse af faktorer i forbindelse med CSC proliferation og afstamning differentiering kan give vigtig indsigt i udviklingen af ​​MPEM og kan give et grundlag for udviklingen af ​​mere effektive terapeutiske indgreb.

Materialer og metoder

Cell Lines, Cell Culture og Isolering af MPeMSCs

MPEM cellelinier (Meso-CL1, Meso-CL2 og Meso-CL3) blev afledt fra humane MPEM tumorer indsamlet på institution review board godkendte protokoller fra National Cancer Institute og informeret samtykke blev opnået fra alle patienter for brugen af ​​tumorprøver, herunder produktion af cellelinier [15]. Celler blev dyrket i RPMI-1640 (RPMI; Gibco) suppleret med 10% volumen /volumen FBS (Atlanta Biologicals) under standard cellekultur betingelser i en befugtet 5% CO2 inkubator ved 37 ° C. Cellerne blev bekræftet som lungehindekræft ved immunhistokemi for kendte lungehindekræft markører og ved elektronmikroskopi og blev karakteriseret for

in vitro

vækst egenskaber og

in vivo

xenograft vækst. Selv om alle tre MPEM cellelinjer genereret flydende stamceller, Meso-CL1, PTEN

(neg) cellelinie med potentiale til at generere både subkutane og intraperitoneale tumorer i athymiske nøgne (nu /nu) mus blev anvendt til undersøgelsen. Vi aktiveret stamcelle generation i MPEM celler ved podning dem på sub-konfluent tæthed at minimere celle-til-celle forankring i 5% v /v FBS-RPMI (serum-reducerede medium). Under disse betingelser MPeMSCs stede i det parentale cellepopulation generere flydende stamceller, som derefter blev opsamlet og dyrket i nærvær af LIF at opretholde dem i en udifferentieret tilstand. De flydende MPeMSCs indsamlet fra LIF behandlede cellekultur blev anvendt til efterfølgende eksperimenter. For alle eksperimenter MPeMSCs blev dyrket i fravær af LIF, medmindre andet er angivet.

Short-Time Live-Cell Imaging og Immunofluorescens

For at bestemme, at de isolerede flydende celler var CSCS, vi først studerede stamceller division i levende celler ved time-lapse studier bruger mikroskopi (Olympus IX71); billeder blev taget med CellSens software. For immunofluorescens blev celler fikseret med 4% paraformaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur, og derefter behandlet med 0,2% Triton X-100 (Sigma) i PBS i 10 minutter med undtagelse af påvisning af celleoverfladeproteiner. Celler blev vasket, med PBS og blokeret med 5% BSA i PBS indeholdende 0,25% NP-40 i 30 minutter ved stuetemperatur. Celler blev derefter inkuberet med et af følgende primære antistoffer: Alexa Fluor konjugeret monoklonalt anti-α-tubulin (1:1000, Millipore), Alexa Fluor konjugeret Phalloidin (1:1000; Invitrogen), Hoechst 33342 (1:5000; Sigma) , anti-nestin (anti-NES, 1:250, Millipore), anti-βIII-tubulin (anti-TUBB3; 1:1000; Covance), anti-vascular endothelial growth factor receptor (anti-VEGFR) 2 (1:200 ; Cell Signaling), anti-CD133 /1-allophycocyanin (APC, 1:100; Miltenyi Biotech). De følgende sekundære antistoffer fra Molecular Probes (Invitrogen) blev anvendt: Alexa Fluor konjugeret mus eller kanin-anti-IgG (1:1000). Sekundære antistoffer alene eller mus IgG1 tjente som kontrol for uspecifik binding. Billeder blev taget med enten Olympus CKX41 fluorescerende mikroskop udstyret med F-View II CCD digitalkamera eller bruge Olympus 1 × 81 mikroskop med en FluoView-1000 konfokal laserscanner.

BrdU Mærkning og Chase

for yderligere at bestemme den asymmetriske celledeling i MPeMSCs søgte vi at teste segregation af template-DNA under mitotisk celledeling anvendelse af 5-brom-2-deoxyuridin (BrdU) puls-chase [34]. Kort fortalt blev MPeMSCs behandlet med 1 uM BrdU (Sigma) i flere passager at sikre, at DNA-strenge blev mærket med BrdU i langt de fleste celler. Efter en lang puls BrdU blev fjernet fra cellekulturen og blev undersøgt for mønsteret BrdU mærkning under celledeling. Celler blev fikseret i 70% ethanol og inkuberet i 2 N HCI indeholdende 0,5% Triton X-100 i 1 time. og blokeret med 5% BSA indeholdende 0,25% NP-40. Celler blev vasket og inkuberet med anti-BrdU-FITC-antistof (BD Biosciences) natten over ved 4 ° C, vasket og modfarvet med DAPI. BrdU mærkning mønster i celler blev vist ved hjælp af Olympus 1 × 81 mikroskop med en FluoView-1000 konfokal laserscanner.

RNA Forberedelse, Real-time kvantitativ PCR og Western Blotting

Total RNA blev ekstraheret fra celler ved hjælp Trizol (Invitrogen) og forbehandlet med DNase. I alt 1 ug RNA blev revers transkriberet til cDNA med revers transkriptase III (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner.