PLoS ONE: En hurtig og enkel fremgangsmåde for fastsættelse humant normalt og Kræft Nyrer primære cellekulturer fra kirurgiske prøver

abstrakt

Nyrerne er et målorgan for toksiciteten af ​​flere xenobiotika og er også meget modtagelige for udvikling af ondartede tumorer. I begge tilfælde,

in vitro

undersøgelser giver indsigt til celleskader, og repræsenterer hensigtsmæssige modeller til at studere enten mekanismerne bag de toksiske virkninger af flere nephrotoxicants eller terapeutiske tilgange i nyrekræft. Udviklingen af ​​effektive metoder til etablering af humane normale og tumor renale celle modeller er derfor afgørende. I denne undersøgelse er en teknisk enkel og hurtig protokol til isolering og dyrkning af humane proximale tubulære epitelceller og human renal tumorceller fra kirurgiske prøver præsenteret. Tumor og normale væv blev bearbejdet ved anvendelse af den samme metode, baseret på mekanisk disaggregering af vævet efterfulgt af enzymatisk fordøjelse og celle oprensning ved sekventiel sigtning. Den overordnede procedure tager omkring en time. De resulterende cellepræparater har gode levedygtighed og udbytte. Etablering af primære kulturer fra alle prøver blev opnået med succes. Oprindelsen af ​​primære dyrkede celler blev etableret gennem morfologisk evaluering. Normale celler renhed blev bekræftet ved immunfluorescensfarvning og revers transkription-polymerasekædereaktion analyse for ekspression af specifikke markører

Henvisning:. Valente MJ, Henrique R, Costa VL, Jerónimo C, Carvalho F, Bastos ML, et al . (2011) En hurtig og enkel fremgangsmåde for fastsættelse humant normalt og Kræft Nyrer primære cellekulturer fra kirurgiske prøver. PLoS ONE 6 (5): e19337. doi: 10,1371 /journal.pone.0019337

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: December 23, 2010; Accepteret: 28 marts 2011; Udgivet: Maj 4, 2011

Copyright: © 2011 Valente et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Humane proximale tubulære epitelceller (HPTEC) svarer til den vigtigste celletype i den menneskelige kortikale tubulointerstitiumet og, vigtigst af alt, at det vigtigste mål for et stort antal miljøfremmede stoffer, fra misbrugsstoffer for antibiotika, antineoplastiske midler, metaller og mykotoksiner [1] – [5]. Primære kulturer af HPTEC kan give et godt karakteriseret

in vitro

model, fænotypisk repræsentant for HPTEC

in vivo

. Denne

in vitro

systemet er godkendt til undersøgelse på nyre celle funktion, transportprocesser, og cellulære mekanismer i proksimal tubulær skade ved xenobiotika, uden indblanding af andre faktorer, der er knyttet til

in vivo

eksperimenter . Til det formål er det vigtigt at opnå højt beriget HPTEC præparater fra nyrevæv. Adskillige teknikker er blevet beskrevet til isolering og dyrkning af HPTEC. Disse metoder har været baseret på tidskrævende teknikker som isopyknisk centrifugering med Nycodenz eller Percoll [6] – [9], eller selv komplekse mikrodissektions protokoller med eller uden enzymatisk fordøjelse [10], [11]. De største svagheder ved disse metoder indbefatter lave udbytter og arbejdskraft intense procedurer.

Udover xenobiotiske-induceret toksicitet, nyren er også modtagelige for udvikling af godartet (fx oncocytoma) eller ondartet (f.eks renal celle carcinom, RCC) neoplasmer. RCC består 85% af renal kræftformer hos voksne, og mere end 3% af voksne maligniteter. Med mere end 30.000 nye tilfælde diagnosticeres årligt, det er den sjette hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA, der er ansvarlig for cirka 12.000 dødsfald om året [12], [13]. Ifølge dets histologisk udseende, kan RCC opdeles i undertyper: konventionel eller klar celle, papillære, kromofobt, og ufordelt RCC [14], [15]. Clear cell RCC er den mest almindelige form for nyrekræft. Det stammer fra den proximale tubulære epitel, og udgør 80 til 85% af renal celle tumor [12], [15]. Papillært RCC er den anden mest almindelige undertype af nyrekræft, med en forekomst på ca. 10% af renale maligne tumorer, og er kendetegnet ved tumorceller arrangeret i en papillær konfiguration [16], [17]. Kromofobt er en usædvanlig undertype af RCC, med en prævalens på ca. 5% af renale maligne tumorer. Som klar celle RCC, det udvikler sig i renal cortex [18], [19].

RCC ætiologi er endnu uidentificeret, udvikle enten som en sporadisk form eller som en arvelig sygdom, og uanset subtype, det er beskrevet som meget modstandsdygtige over for konventionelle radio-, kemo- og immunterapi regimer [12], [15], [20]. Derfor er opdagelsen af ​​nye strategier for terapeutisk intervention er fortsat en prioritet. I denne henseende har cellekultur af human renal tumorceller (HRTC) vist sig at være en passende in vitro model til undersøgelse af terapeutiske fremgangsmåder i RCC [15], [21] – [23]. Desuden sideløbende studier i tumor cellekulturer, er det nødvendigt at teste toksiciteten af ​​potentielle terapeutiske midler i de normale counterpart celler. Derfor er det det vigtigste mål med denne undersøgelse at præsentere en enkel og hurtig metode til fastsættelse af humane nyre primære kulturer, både normal (HPTEC) og tumoral (HRTC), fremstillet af samme organ.

procedure præsenteret heri er blevet tilpasset fra tidligere etablerede metoder [6], [9], [24] – [26] og bruges til at behandle normale og tumorvæv. Den er baseret på mekanisk disaggregering af vævet efterfulgt af enzymatisk fordøjelse og celle oprensning ved sekventiel sigtning. Denne teknik tillader separation af en cellulær fraktion, der er stærkt beriget med HPTEC eller HRTC fra henholdsvis normal renal cortex og tumoral nyrevæv, med langt højere udbytte og cellelevedygtighed end andre etablerede isoleringsprocedurer. Den overordnede procedure er teknisk enkel, så dens let implementering i cellekultur laboratorier.

Materialer og metoder

Materialer

Følgende materialer blev opnået fra GIBCO ™ Invitrogen (Barcelona, Spanien), medmindre andet er angivet

Cellekulturmedium:. Dulbeccos modificerede Eagles medium med næringsblanding F-12 (DMEM /F-12) og GlutaMAX-i ™ suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS ), penicillin /streptomycin (50 U /ml /50 ug /ml), fungizon (2,5 ug /ml), og humant transferrin (5 ug /ml).

Hanks pufrede saltopløsning (HBSS) uden CaCl

2 og MgCl

2

collagenaseopløsning:. opløses 50 mg collagenase type 2, 315 U /mg (Worthington, Lakewood, NJ) i 25 ml ikke-suppleret dyrkningsmedium og filtersteriliseret med 0,22 um filter. Bruges frisk

0,05% trypsin-EDTA-opløsning

Frysning løsning:.. 90% FBS og 10% dimethylsulfoxid

Inkubation fartøj:. Autoklaveres 250 ml Pyrex® glas med kappe kolbe (Vidrolab 2, Gandra, Portugal) med en magnetisk bar i det. Temperaturen af ​​collagenase opløsning i reservoiret holdes på 37 ° C ved cirkulation varmt vand gennem kappen af ​​kolben

Collagen overtrukne kolber (fig. 1):. 75-cm

2 plast kultur kolber overtrukket natten over ved 37 ° C med en 40 ug /ml opløsning af kollagen G fra bovin kalveskind (Biochrom AG, Berlin, Tyskland) i PBS.

Sterile celle sier med sigtestørrelser på 100, 70, og 40 pm (BD Falcon ™, BD Biosciences, USA).

0,4% Trypan blå opløsning (Sigma Aldrich, St. Louis, MO).

AccuGENE® 1X PBS (Lonza Laboratories, Verviers , Belgien)

immuncytokemisk farvning:.. muse monoklonalt anti-pan cytokeratin-antistof, gede-anti-muse-IgG-FITC-antistof, og Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)

RT-PCR-analyse:. RNeasy Mini RNA isolering (Qiagen, USA) og RevertAid ™ H Minus først Stand Synthesis kit (Fermentas, Danmark)

Etik Statement

Denne undersøgelse blev godkendt af det portugisiske Oncology Institute-Porto etiske komité. Alle interviewede patienter gav skriftligt informeret samtykke.

Tissue Collection

menneskelige nyre vævsprøver blev opnået fra i alt 6 patienter (3 hanner og 3 hunner) undergår radikal nefrektomi for renalcellecarcinom på Portugisisk Oncology Institute-Porto (IPO-Porto). Patient gennemsnitsalder var 62 ± 5 år. Vævsprøver (ca. 10 g hver) blev opsamlet fra områder makroskopisk identificeret som normalt (i cortex) eller tumoral umiddelbart efter prøven ekstraktion, af en ekspert uropathologist. Arten af ​​disse områder blev efterfølgende bekræftet ved histopatologisk vurdering af spejl prøver. Væv blev anbragt i adskilte sterile 50-ml rør med iskold dyrkningsmedium og derefter overført til en cellekultur laboratorium på is.

Alle prøver undergik efterfølgende rutine vævsbehandling (formalin fiksering og paraffinindlejring). Histopatologisk analyse af sektioner for at vurdere, hvilken form for nyrekræft, sortering og iscenesættelse blev udført ved Institut for Patologi, IPO-Porto.

HPTEC og HRTC Isolation Protocol

Nedsat celle isolation fandt sted inden for 30 minutter af nyrevæv samling. Alle efterfølgende procedurer blev udført i en cellekultur flow hætte, under sterile betingelser. For at undgå celle krydskontaminering, anbefaler vi håndterer normale og tumor prøver i to individuelle væv-kultur hætter. Hvis dette ikke er muligt, så bør styrkes følgende retningslinjer: kun én kirurgiske eksemplar bør anvendes i en cellekultur hætte til enhver tid (i løbet af denne tid holde andet væv på is i en steril beholder), hætten skal rengøres inden indførelsen af ​​de andre kirurgiske prøven, og flasker eller portioner af medium bør være dedikeret til brug med kun normale eller tumorceller.

i laboratoriet kultur kabinet, overføre vævet til en 60-mm Petriskål. Ved hjælp af pincet og saks, dissekere fra (i) den fibrøse kapsel og tilstødende medulla fra cortexvæv og (ii) noget fedt, blodpropper og bindevæv fra tumorvæv.

Skær vævsprøven i små stykker med skalpeller.

Overfør væv fragmenter til et sterilt 50 ml centrifugerør, skyl dem kraftigt med iskold HBSS (indeholder EGTA der løsne celle vejkryds via calcium chelaterende handling) og dekanter supernatanten. Gentag dette sidste trin, indtil opløsningen er fri af blod.

Hæld supernatanten, overføre fragmenterne til en ren 60-mm petriskål og fint hakke vævet i ca. 1 mm

3 stykker med skalpeller.

Resuspender små fragmenter i 25 ml forvarmet ikke-suppleret dyrkningsmedium og kombinere det med collagenaseopløsningen (1 mg /ml slutkoncentration) i inkubationsbeholderen. Inkuber i 20 minutter ved 37 ° C under forsigtig omrøring.

Før fordøjede væv på den første sigte (100 um) i en 50-ml centrifugerør. Den samme fremgangsmåde anvendes derefter på følgende sier (70 og 40 um). Sigtning gennem 100 um sigte tillader fjernelse af enhver ufordøjet fibrøst væv, hvorimod funktionen af ​​de 70 og 40-um-sigter er at fjerne kontaminerende rørformede fragmenter og glomeruli, henholdsvis.

Vask de sigtede cellerne ved centrifugering (400

g

, 5 min ved 4 ° C), og pellet resuspenderes i HBSS. Gentag denne proces to gange mere, og derefter resuspender cellepelleten i dyrkningsmedium med kosttilskud. Bestem celle nummer og levedygtighed i et Neubauer hæmocytometer ved hjælp af trypan blå opløsning.

Figur 1 viser en skematisk fremstilling af den samlede procedure.

Cell Culture Protocol

Seed de isolerede celler på collagen-coatede 75 cm

2 dyrkningskolber ved en densitet på 5 x 10

4 celler /cm

2 og inkuberes i en fugtig atmosfære af 95% luft /5% CO

2 ved 37 ° C. (Bemærk: RPMI 1640 medium med kosttilskud kan anvendes alternativt at dyrke HRTC)

Skift mediet 24 timer efter første såning og ved 48 timers intervaller derefter

Tillad cellerne til at vokse, indtil. -80% konfluens inden de subkultiveres eller frosset.

Når dyrket som beskrevet ovenfor, cellerne når konfluens i ca. 10-13 dage efter podning.

Cell subkultur protokol

Fjern celledyrkningsmediet og vask cellemonolaget med enten forvarmet HBSS eller PBS og 1 ml trypsin-EDTA at svække celleadhæsion til kolberne overflade.

Tilføj nok trypsin-EDTA-opløsning at dække kolben overflade og inkuberes ved 37 ° i 3 min. Observere cellerne under et inverteret optisk mikroskop for at sikre tilstrækkelig Cellefrigørelse.

Afslut trypsin handling ved tilsætning af 10 ml suppleret vækstmedium og resuspender løsnede celler ved gentagne gange pipettering over overfladen af ​​dyrkningskolbe.

Overfør resuspenderede celler til et centrifugerør, kolben med medium skyl, og tilsæt de skyllede celler til et centrifugerør. Seed cellesuspensionen i ny 75-cm

2 kolber på en 1:03 subkultur forhold.

Under disse betingelser HPTEC ud over den første passage rækkevidde sammenløb i 3-5 dage, og HRTC i 7 dage.

Cell Kryopræservering, Optøning og -genudpladning protokollen

efter trypsinisering, overføre løsrevne celler til et centrifugerør og pelletere cellerne ved centrifugering (400

g

, 5 minutter ved 4 ° C).

Resuspender pellet fra hver kolbe i 3 ml frysning opløsning.

Overfør 1 ml cellesuspension til 2 ml kryoglas og fryse øjeblikkeligt ved -80 ° C .

at reseed suspensionerne cellerne hurtigt optøet ved tilsætning forvarmet suppleret medium og overført til et 15-ml centrifugerør.

pelletere cellerne ved centrifugering ved 400

g

, i 5 minutter.

pellet resuspenderes i varmet dyrkningsmedium, og overført til 75 cm

2 kolber, et hætteglas pr kolbe.

HPTEC og HRTC er held kryopræserveres fra både isolerede celler og cellesuspensioner opnået efter trypsinisering, at opretholde en normal vækst efter optøning.

Morfologisk Evaluering

Monolagskulturer afledt af alle 12 primære isolater (6 normal, 4 klar celle RCC og 2 kromofobt RCC) og den tilsvarende første tre passager blev undersøgt ved lysmikroskopi under et inverteret optisk mikroskop. En udødeliggjort proksimale tubulus epitel celle linje stammer fra menneskelig nyre normal voksen, HK-2-cellelinje (ATCC, CRL-2190), blev også undersøgt til sammenligning.

immuncytokemisk farvning for Cytokeratin

Til undersøge den epitheliale oprindelse opnåede normale og tumor nyreceller blev reaktiviteten til anti-cytokeratin-antistof vurderet i suspensioner fra passagerne 1 til 3. To immortaliserede cellelinier afledt fra normal (HK-2) og tumor (A-498) human nyre blev anvendt som positive kontroller

Kort fortalt HPTEC eller HRTC blev dyrket til ca. semiconfluence på plader med 24 brønde (indledende densitet: 1,0 × 10

5 celler /brønd)., vasket med sterilt PBS, fikseret til 20 minutter i 4%

p-

formaldehyd og permeabiliseret i 5 minutter i 1% Triton X-100 opløsning. Efter blokering med 1% bovint serumalbumin, 0,4% Triton X-100 og natriumazid blanding 4%, cellerne blev inkuberet natten over ved 4 ° C med monoklonalt muse-anti-pan cytokeratin-antistof (1:100), og derefter med ged anti-muse IgG-FITC-antistof (1:100) i 2 timer ved stuetemperatur. Efter skylning med PBS blev kerner modfarvet med 5 ug /ml Hoechst 33258 i 5 minutter og derefter vasket med PBS igen. Billeder blev taget med et fluorescens mikroskop (Nikon, Eclipse E400). Passende negative kontroller blev inkluderet for at sikre en positiv antistofreaktivitet.

Reverse transkriptase-PCR (RT-PCR) Analyse for specifikke markører

Hjulophæng (ca. 3,0 × 10

6 celler hver) af første passage normale celler fra 4 donorer blev analyseret ved RT-PCR for at bekræfte oprindelsen og renheden af ​​isolaterne. Derfor blev mRNA-ekspression af tre karakteristiske proteiner evalueres: uromodulin (distale tubulære celler), Aquaporin 3 (opsamlingskanal celler) og aminopeptidase A (proximale tubulære celler). Kort beskrevet blev RNA ekstraheret fra alle prøver med RNeasy Mini RNA-isolering kit, og koncentrationer blev bestemt under anvendelse af et ND-1000 NanoDrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, USA). cDNA blev fremstillet fra RNA under anvendelse af RevertAid ™ H Minus First Stand syntesekit og derefter amplificeret ved RT-PCR under anvendelse af tidligere offentliggjorte primere sekvenser og respektive udglødningsbetingelser [27]. Glyceraldehyd 3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) blev anvendt som husholdning genet, en blanding af nyreceller som den positive kontrol for alle proteiner analyserede, og vand som negativ kontrol. RT-PCR-produkter blev påsat denaturerende 2% agarosegeler, farvet med ethidiumbromid og visualiseret under en UV-transilluminator.

Resultater

Histopatologi

De HRTC kulturer blev afledt fra RCC klar celle (4 tilfælde) eller kromofobt (2 sager) undertyper. De klare tilfælde celle RCC blev komponeret af celler i acinære eller alveolær arrangement, som udviste den karakteristiske optisk klar cytoplasma med særskilte cellemembraner, variabel nuklear størrelse og synligheden af ​​nucleoli (fig. 2A). De kromofobt RCC sager blev præget af store celler, med lidt eosinofil cytoplasma, fremtrædende cellemembraner og uregelmæssigt formede kerner (Fig. 2B). Begge sager farves diffust i cytoplasmaet med Hales kolloidt jern pletten.

(A) Klar celle renalcellecarcinom, og (B) kromofobt renalcellecarcinom.

Karakteristik af primær celle kulturer

tabel 1 opsummerer de vigtigste karakteristika for hver donor, og de tilsvarende isolater. Metoden giver præparater af renale celler med fremragende celle levedygtighed (96,5 ± 1,4% og 89,7 ± 4,1% for normale og tumor renale celler, henholdsvis) og udbytter (18,7 ± 6,9 × 10

6 HPTEC /g kortikale væv og 3,1 ± 4,7 × 10

6 HRTC /g tumoral væv). Tidsforbrug, fra den indledende samling af de nyre prøver til såning af isolater, tog ca. 1 time.

Etableringen af ​​primære kulturer blev succesfuldt opnået fra alle tolv vævsprøver (6 fra normal cortex plus 4 fra klar celle RCC og 2 fra kromofobt RCC). Alle blev holdt i kultur i mindst tre passager. Primære isolerede celler, normale og tumor-afledte, nåede sammenløb inden for cirka 10 dage. Efter den første passage, normale nyreepitelceller udviste en større tilbøjelighed til at proliferere

in vitro

end tumorceller. Alle primære kulturer (første og subkulturer) var fri for fibroblastisk tilgroning.

Under fase-kontrast mikroskopi, sammenflydende primære kulturer af normale renale celler viste en meget homogen morfologi. HPTEC i kultur udviser en brosten udseende (fig. 3A), karakteristisk for epitelceller ligesom HK-2-celler (fig. 3B). Dannelse af typiske kupler (hemicysts) var synlig, når HPTEC kulturer blive meget sammenflydende, indikerer transepitelialt stoftransport af monolagene.

(A) Primær HPTEC, (B) HK-2-cellelinje, (C) primær klar celle RCC, og (D) primær kromofobt RCC. Forstørrelse:. 400x

HRTC blev effektivt isoleret fra klar celle og kromofobt RCC og karakteriseret ved deres fladtrykt polygonale morfologi og tilstedeværelse af lipidvesikler i cytoplasmaet. Disse tumor undertyper kunne skelnes med antallet og størrelsen af ​​de vesikler: klare celler præsentere hele cytoplasma besat af flerdimensionelle vesikler (figur 3C.), Mens der i kromofobt celler vesiklerne dukkede op i mindre mængder og dimension, og cytoplasmaet er ikke ” tom “som i clear cell RCC (fig. 3D). Lys mikroskopisk udseende af primære isolater (normale og tumor) og de følgende tre passager var ikke mærkbart anderledes. Cytokeratin blev udtrykt i alle RCC primære kulturer (fig. 4), der bærer deres epitelial oprindelse.

Hoechst 33258, anti-cytokeratin antistof farvning, og fusionerede billeder med dobbelt farvning af primær dyrkede HPTEC, klar celle og kromofobt RCC-celler. HK-2 og A-498-celler blev anvendt som kontrol af humane normale og tumor epitelceller nyreceller hhv. Forstørrelse:. 200x

For yderligere at karakterisere de proximale tubulus celler i primær kultur blev ekspression af specifikke markørproteiner evalueret af immuncytokemisk farvning med monoklonalt muse-antistof mod humant cytokeratin og RT-PCR-analyse for uromodulin, aquaporin 3, og aminopeptidase A. Disse celler udtrykte cytokeratin ensartet, som var svarende til den i HK-2-celler (fig. 4), hvilket således bekræfter sin epitel karakter. RT-PCR-analyse af HPTEC primære kulturer fra 4 patienter blev udført. Alle fire isolater bevares molekylære egenskaber af HPTEC, der viser høj ekspression af aminopeptidase A, den karakteristiske protein af proximale tubulære celler (fig. 5). Endvidere cellerne havde meget uge eller manglede ekspressionen af ​​den distale, rørformede og opsamlingskanal markører, uromodulin og aquaporin 3.

Uromodulin (distal tubulus markør), aquaporin 3 (opsamlingskanal markør), og aminopeptidase A (proksimal tubulus markør) i den primære dyrkede HPTEC afledt fra 4 donorer og HK-2 celler. RNA isoleret fra en blanding af nyreceller blev anvendt som en positiv kontrol og vand som negativ kontrol. Angivelse af glyceraldehyder-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) blev anvendt som et hus-føring gen.

Diskussion

Flere

in vitro

nyre forberedelser er anvendt for fysiologiske og toksikologiske undersøgelser, herunder isoleret perfunderet nyre, nyre skiver, nephron segmenter, cellelinjer og primære kulturer [28]. Blandt disse cellekultur tilbyder fordelene ved tilgængeligheden af ​​større antal celler og facilitet til at udføre flere og gentagne forsøg over lange tidsperioder. Brugen af ​​etablerede cellelinjer for toksikologiske undersøgelser kan udgøre mange begrænsninger i forhold til primære kulturer. Faktisk kan værdien af ​​toksikologiske undersøgelser udført på væsentlige transformerede celler være tvivlsom. Det er velkendt, at immortaliserede cellelinjer undergår dedifferentiering (dvs. tabet af den oprindelige celle specificitet) som følge af langvarig passage

in vitro

[29], og har egenskaber, der ikke findes i deres væv af oprindelse på grund af deres immortalisering. Derfor kan en ændret cellulær respons på giftstoffer ses. I modsætning hertil primære kulturer bevare mange af fænotypiske karakteristika oprindeligt væv, herunder normale fysiologiske funktioner, og derfor kan være meget relevante modeller for gen-opdagelse, målvalidering, test af lægemidler, og udvikling af biomarkører. Desuden udnytter multiple donorer for prøver af væv til at generere uafhængige isolater af primære celler tillader forskerne at påvise konsekvente reaktioner mellem individer.

Selvom flere forfattere tidligere har rapporteret metoder til isolering og primær kultur af HPTEC [6], [9], [11] og HRTC [12], [14], en udbredt anvendelse af disse menneskelige kultur præparater er blevet hæmmet af beskedne udbytter og nedsat cellelevedygtighed.

i denne undersøgelse beskriver vi en optimeret metode til etablering af humane primære cellekulturer fra både normale og tumorvæv, der er høstet fra patientens prøven umiddelbart efter radikal nefrektomi procedure. Af note er, at prøvetagning, så snart efter resektion som muligt er en vigtig faktor for at opnå cellesuspensioner med høj levedygtighed, da der er en klar nedgang i mængden af ​​succes dyrket materiale længere væv forbliver de

ex vivo

[ ,,,0],24].

Da proksimale tubuli placering er begrænset udelukkende til den renale cortex, kulturer oprettet ved hjælp af celler isoleret ved progressiv enzymatisk dissociation fra yderste cortex af den normale menneskelige nyre. Hakning prøven i små stykker giver god fjernelse af røde blodlegemer i løbet af de første vasketrin og maksimerer enzymatisk fordøjelse. Passende valg af enzym, inkubationstid, temperatur og koncentration for optimal fordøjelse skal indhente den bedste væv dissociation uden overdreven ødelæggelse. Collagenasefordøjelse vides at være mindre skadelige for epitelceller end fordøjelse med andre enzymer (trypsin) og under betingelserne i vores protokol giver cellesuspensioner med højere udbytter og levedygtighed end anført for tidligere isoleringsprocedurer. Sekventiel filtrering af collagenase fordøje gennem en serie sigter med aftagende maskestørrelser fjerner rørformede fragmenter og glomeruli, og efterlader materiale, der giver udvækst af renale epitelceller med en proximal fænotype sandsynligvis på grund af deres høje proliferative potentiale. Derudover det første medium forandring, 24 timer efter udpladning, minimerer binding af andre ikke-epitelceller.

En procedure bør være relativt enkel og hurtig at minimere skade membran under isolering og tid, der kræves, før cellerne kan være anvendes til forsøg. Dette opnås i vores fremgangsmåde som den ikke omfatter tidskrævende trin som Percoll densitetsgradientcentrifugering [6], [9], eller kompleks microdissection [10], [11] eller immunomagnetiske teknikker [30]. Proceduren tager næsten en time at udføre, således at en hurtigere etablering af primære cellekulturer i forhold til forrige HPTEC eller HRTC kultur protokoller.

Etableringen af ​​primære kulturer blev succesfuldt opnået fra alle kirurgiske prøver. blev opnået i alt 12 forskellige renale primære kulturer. Blandt disse kulturer, 6 var fra normal cortex, 4 fra klar celle RCC og 2 fra kromofobt RCC. I vores fremgangsmåde, tumor primære kulturer tage længere tid at nå subkonfluens ud over den første split end de normale cortex primære kulturer. De normale cortex primære kulturer præsenteret en homogen morfologi, mens de primære tumor kulturer havde en mere heterogen morfologi. De normale renale cellekulturer udviste en epitelial morfologi, der var konsistent med rapporterede karakteristika for HPTEC [9], [24], [25]. Optisk mikroskopisk analyse op til tredje passage viste, at denne differentierede morfologi ikke ændrede på subkultur. Vi forsøger ikke at kontrollere levetiden af ​​primære normale eller tumor kulturer, fordi det er velkendt, at en variation af fænotype sker ved højere passager [26], [29], [30]. Væksten mønster og morfologi af HK-2 celler ikke adskiller sig fra primær kulturperler HPTEC, som vurderet ved lysmikroskopi. Vigtigt er det, blev fibroblast forurening ikke observeret i vores kortsigtede primære kulturer, men kan være et problem efter længere primær kultur eller yderligere subkulturer. For at overvinde dette problem er det blevet anbefalet substitution af L-valin ved D-valin og L-arginin med L-ornithin i HPTEC medium [6] eller anvendelse af hormon-suppleret serumfrit dyrkningsmedium [9].

tilstedeværelsen af ​​specifikke markører blev etableret for at karakterisere de HPTEC primære kulturer. Især blev epitel karakter HPTEC kulturer bekræftet ved immuncytokemi med positiv farvning for cytokeratin og den proksimale tubulære oprindelse ved RT-PCR med klart udtryk for den proximale tubulus børste enzym aminopeptidase grænserne A. Desuden er disse celler viste meget svag eller fraværende ekspression af den distale, rørformede og samlerørene markører, uromodulin og aquaporin 3 hhv. Disse resultater viser, at vores primære HPTEC kulturer stammede fra proksimale tubule celler, uden væsentlig forurening af celler fra andre dele af nephron. Således er vores metode gør det muligt at isolere og vokse stærkt differentierede primære kulturer, som udtrykker specifikke proximale tubulære proteiner.

cytologisk homogenitet vores HPTEC primære kulturer blev bedømt ved immuncytokemisk farvning for cytokeratin op til tredje passage, og i alle forekomster reaktionerne var homogene i intensitet og havde identiske profiler.

Cell karakteriseringen i denne undersøgelse bekræfter andre undersøgelser, der viser, at HPTEC kulturer bevarer de differentierede karakteristika PTC i op til tre passager [9], [31] . Denne

in vitro

model kan anvendes til undersøgelser vedrørende nyreskade, herunder miljøfremmede-induceret toksicitet i HPTEC derfor eliminerer behovet for ekstrapolation fra dyr cellekulturer og mere repræsentativ for renale celler

in vivo

end etablerede nyre cellelinjer.

af note er, at disse renale celler af proksimale tubulus kan dyrkes i permeable membran filter understøtter, hvilket resulterer i celler, der morfologisk og funktionelt bedre repræsenterer deres

in vivo

modstykker. Celler dyrket i disse membran understøtninger bruges til at undersøge proximale transportsystemer samt virkningen af ​​forskellige xenobiotika på både apikale og basolaterale side af den proximale tubulære celler [32].

Fremgangsmåden blev også effektivt anvendes til isolering af HRTC fra to morfologisk og genetisk distinkte undertyper af RCC, nemlig klare celle og kromofobt RCC. Begge typer udvikler fra humane renale corticale celler. Dog er klare celle RCCS menes at stamme fra epithelet af proksimale komplicerede tubuli, mens kromofobt RCCS synes at stamme fra den kortikale segment af indsamling kanal [33]. Mens primære kulturer af normale epitel celler af proksimal oprindelse udgør en meget homogen morfologi blev betydelig morfologiske heterogenitet blandt klare celle RCC kulturer noteret. Dette resultat er i overensstemmelse med tidligere rapporter, der viser variationer i deres størrelse og form [34]. Cellerne præsenterede de forventede histologiske karakteristika, der er beskrevet i tidligere undersøgelser [18], [19], [35].

Metoden viste sig at være teknisk enklere, hurtigere og med en højere succesrate for etablering af tumor primære kulturer fra kirurgiske prøver end den fastlagte for tidligere isoleringsprocedurer [12], [14]. Primære kulturer fra RCC kræftformer er nyttige værktøjer til at studere de biokemiske og molekylære ændringer i forbindelse med den neoplastiske status. Desuden er udviklingen af ​​RCC kulturer, sammen med deres tilsvarende normale modparter, kan give en mere realistisk model for udvikling og afprøvning af nye terapeutiske modaliteter.

Som konklusion præsenterer vi en nyttig og enkel fremgangsmåde til vellykket etablering af primære kulturer afledt af friske humane normale kortikale og tumorvæv. Den kombinerer forskellige teknikker allerede er beskrevet i litteraturen, og resulterer i en optimeret isolation metode, hvilket giver cellepræparater med fremragende levedygtighed og nyttiggørelse.