PLoS ONE: MicroRNA Lad-7f Forhindrer Tumor invasion og metastase ved Målretning MYH9 i Human Gastric Cancer

Abstrakt

Baggrund

MikroRNA’er (miRNA) er vigtige regulatorer, der spiller afgørende roller i tumorigenese og tumor progression. En tidligere rapport har vist, at lade-7 familiemedlemmer kan fungere som tumor undertrykkere i mange kræftformer. Gennem miRNA array, fandt vi, at lade-7f blev nedreguleret i de meget metastatisk potentiale mavekræft cellelinjer GC9811-P og SGC7901-M, i forhold til deres forældre cellelinjer, GC9811 og SGC7901-NM; dog mekanismen var ikke klart. I denne undersøgelse, vi undersøge, om lad-7F fungerer som en tumor suppressor at hæmme invasion og metastase i gastrisk kræft.

Metode /Principal

Real-time PCR viste nedsatte niveauer af lad-7f udtryk i metastatisk gastrisk kræft væv og cellelinier, der er potentielt meget metastatisk. Cell invasion og migration blev væsentligt forringet i GC9811-P og SGC7901-M-cellelinier efter transfektion med lad-7f-efterligner. Nude mus med xenograftmodeller af mavekræft bekræftede, at lade-7f kunne hæmme mavekræft metastase in vivo efter transfektion af lentivirus pGCsil-GFP- lad-7f. Luciferase reporter assays viste, at Lad-7f direkte binder til 3’UTR af MYH9, som koder for myosin IIA, og real-time PCR og Western blotting endvidere angivet, at lade-7f nedreguleret ekspression af myosin IIA ved mRNA og protein niveauer .

konklusioner /betydning

Vores undersøgelse viste, at overekspression af lad-7f i mavekræft kunne hæmme invasion og migration af gastriske kræftceller gennem direkte rettet mod tumor metastase-associerede gen MYH9. Disse data tyder på, at lade-7f kan være en roman terapeutisk kandidat til mavekræft, givet sin evne til at reducere celle invasion og metastase

Henvisning:. Liang S, han L, Zhao X, Miao Y, Gu Y, guo C, et al. (2011) MicroRNA Lad-7f Forhindrer Tumor invasion og metastase ved Målretning MYH9 i Human Gastric Cancer. PLoS ONE 6 (4): e18409. doi: 10,1371 /journal.pone.0018409

Redaktør: Donald Gullberg, Universitetet i Bergen, Norge

Modtaget: 27. september 2010; Accepteret: 7 marts 2011; Udgivet: 18 April, 2011

Copyright: © 2011 Liang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 30.801.330, No. 30.871.143, No. 81.030.044)) og National Basic Research Program Kina (nr 2010CB529300, No. 2010CB529306). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er den mest almindelige gastrointestinale malignitet i Østasien, Østeuropa og dele af Central- og Sydamerika, og er den næststørste årsag til kræft-relaterede dødsfald [1]. Udbredt metastaser har været en væsentlig årsag til den dystre resultat af GC patienter. Metastase er en kompleks, multi-trins proces, hvorved cancerceller migrerer fra den primære neoplasme til en fjern [2] placering. Processen starter med primære tumorceller invaderer tilstødende væv, efterfulgt af celler ind i blodbanen (intravasation), translokere gennem vaskulaturen, der kommer ud fra blodkar (ekstravasation) i det omgivende væv parenkym, indledning mikrometastaser og endelig prolifererende at danne makroskopiske sekundær tumorer [3]. En af de kritiske regulatorer der involveret i denne proces er en microRNA (miRNA) [4].

MikroRNA’er (miRNA) er en klasse af endogene og små ikke-kodende regulatoriske RNA’er, der regulerer gener ved post- transkriptionelle niveau [5]. Ældre miRNA kan transskriberet af RNA-polymerase II og er genereret ud fra den sekventielle behandling af primære miRNA udskrifter fra drosha og Dicer; de så tjene som posttranskriptionel regulatorer af genekspression gennem komplementær baseparring til messenger RNA [6]. Mange rapporter viser, at miRNA spiller nøgleroller i forskellige biologiske processer, herunder celledifferentiering, proliferation, apoptose, stress modstand, fedtstofskiftet, tumorigenese, og tumormetastaser [7], [8], [9].

Den lad-7 familie er en konserveret familie af miRNA. Lad-7 blev oprindeligt observeret i rundorm Caenorhabditis elegans [10], og fjorten medlemmer er blevet fundet til dato [11]. For nylig blev fundet ekspressionsniveauerne af mange lad-7-familiemedlemmer til at blive reduceret i en række forskellige cancere. For eksempel, lad-7 nedreguleres i lungekræft, melanom, og hoved og hals pladecarcinom, mens overekspression af lad-7 kan inhibere cancercellevækst [12], [13], [14], [15], [16 ], [17], [18]. Adskillige onkogener, såsom RAS, MYC, og HMGA2, er direkte mål for lad-7 [19], [20], [21]. Lad-7f er et medlem af Lad-7 familie. Tidligere undersøgelser har vist, at lade-7f opreguleres i primær brystcancer og fremmer angiogenese [22]; nedregulering i PAH [23] var forårsaget af kronisk hypoxi eller monocrotaline hos rotter, og niveauet blev reduceret i plasma vesikler af NSCLC patienter [24]. Desuden kan lade-7f påvirke celledeling ved at målrette Kallikrein-relaterede peptidaser (KLKs), en familie af serin proteaser, har vist sig at være dysreguleret i flere maligniteter, herunder ovariecancer [25].

Vores lab har tidligere identificeret en gruppe af differentielt udtrykte miRNA mellem GC9811 og GC9811-P celler gennem højt profilerede microRNA chip analyser, indeholder lad-7f [26]. Under den yderligere karakterisering af Lad-7f i forskellige cancer cellelinjer, fandt vi, at lade-7F fungerer som en metastase lyddæmper. Den forøgede ekspression af lad-7f kan undertrykke GC celleinvasion og migration in vitro og in vivo. Ved bioinformatik analyse, identificerede vi, at MYH9, som koder for en myosin IIA tung kæde involveret i fremme af kræft celle migration eller invasion, som en formodet Lad-7f mål. Efterfølgende eksperimenter bekræftede, at lade-7f kan nedregulere myosin IIA udtryk ved at målrette 3’UTR af MYH9, hvilket giver en mulig mål for GC behandling.

Materialer og metoder

Tissue samling

Primære gastrisk tumorvæv, tilstødende ikke-tumor gastriske væv og fjerne metastatisk gastrisk væv blev opnået fra patienter, som gennemgik kirurgi på Xijing Hospital Digestive Diseases i Xi’an, Kina. Alle prøver blev klinisk og patologisk vist skal mærkes korrekt. Patienter, der tilbyder prøver til studiet underskrevet informeret samtykke formularer.

Cell kultur

De humane gastrisk cancer cellelinjer GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM, SGC7901-M blev bevaret i vores eget laboratorium og blev dyrket i RPMI1640 (HyClone), suppleret med 10% føtalt bovint serum. (FBS, GIBCO), 100 enheder /ml penicillin og 0,1 mg /ml streptomycin ved 37 ° C i en fugtig 5% carbondioxid-inkubator

RNA-ekstraktion og real-time PCR

QRT-PCR blev udført for at bestemme ekspressionsniveauerne af potentielle lad-7F målgener. Totalt RNA blev ekstraheret fra væv eller dyrkede celler under anvendelse af TRIZOL-reagens (Invitrogen Life Technologies). Komplementær DNA (cDNA) blev dannet ved anvendelse af en TaqMan Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Real-time PCR analyser blev udført med en TaqMan Micro-RNA assay kit (Applied Biosystems). Primer af lad-7f blev købt fra Ambion (MI0000437). Primer af MYH9 sekvens blev konstrueret ved hjælp af Primer Express Software (Version 1.5). Primeren-MYH9 sekvens: (Fremad) 5’AGAGCTCACGTGCCTCAACG3 «(bagside) 5’TGACCACACAGAACAGGCCTG3′.All protokoller blev udført i overensstemmelse med producentens anvisninger. Udtrykket niveau af Lad-7f blev normaliseret til 5S (Fremad: 5’GATTGAATCGAGCACCAGTTAC3 «

Omvendt: 5’GTCTACGGCCATACCACCCTGAAC3«). Udtrykket niveau MYH9 var normaliserede to18S (Fremad: 5’CGGCTACCACATCCAAGGAA3 «

Omvendt: 5’GCTGGAATATCCGCGGCT3«) PCR og indsamling af data blev udført på en iCycler (Bio-Rad).. Hver prøve blev kørt tredobbelt

Vector konstruktioner og lentivirus Production

PRI-lad-7f sekvens blev konstrueret som følger:. (Forward) HSA-lad-7f-1-Xho IF GGGCCCGCTCTAGACTCGAGATATTTGCATGTCGCTATGTG (Reverse) HSA-lad-7f-1- BamH IR CGCGGCCGCCTAATGGATCCAAAAAAGGCACAGTCGAGGCTGATC. Sekvensen blev amplificeret og klonet ind i pGCsil-GFP-vektoren (GENECHEM) til generering pGCsil-GFP- lad-7f. Negativ kontrol var pGC FU-RNAi-NC-LV. Virus emballage blev udført i HEK 293T-celler efter cotransfektion af 20 ug pGCsil-GFP-let-7f vektor med 15 ug af emballagen plasmid pHelper 1.0 Vector og 10 ug af hylsteret plasmid pHelper 2.0 Vector anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen). Vira blev høstet 48 timer efter transfektion, og virustitere blev bestemt.

Oligonucleotid byggeri

Lad-7f efterligner, lad-7f hæmmer og negativ kontrol siRNA oligonukleotider chemosynthesized (Shanghai GenePhama Co, Ltd). De anvendte oligonukleotider i disse studier var har-lad-7F efterligner: 5’UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU3’and 5’CUAUACAAUCUACCUCAUU3 «;

Efterligner negativ kontrol: 5’UUCUCCGAACGUGUCACGUT3’and5’ACGUGACACGUUCGGAGAATT3«, har-let-7f inhibitor: 5’AACUAUACAAUCUACUACCUCA3 ‘. MircoRNA inhibitor negativ kontrol: 5’CAGUACUUUUGUGUAGUACAA3 ‘Salg

Cell transfektion Salg

Celler blev dyrket til 80% til 90% konfluens efter at være blevet podet i plader med 6 brønde og blev transficeret med Lipofectamine 2000 (Invitrogen. , Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. For transient transfektion blev cellerne i hver brønd i en plade med 6 brønde transficeret med 12,5 pi miRNA inhibitor eller 7,5 pi miRNA mimic oligonukleotider. Efter 48 timers transfektion blev cellerne høstet til yderligere eksperimenter. For stabilt transficerede celler, blev celler transficeret med lentivirus ved 30% -50% konfluens. Målceller (1 x 10

4), herunder GC 9811-P og SGC7901-M-celler, blev inficeret med 1 x 10

6 rekombinante lentivirus-transducerende enheder i nærvær af 6 ug /ml polybren (GENECHEM) .

invasion assay

invasiv evne af cellerne blev analyseret under anvendelse Transwells (8 um porestørrelse, Corning Costar Corp.). Transbrøndene blev anbragt i 24-brønds plader. Først blev 0,1 ml Matrigel (50 ug /ml, BD Biosciences) tilsat på pladens overflade, og inkuberet i 2 timer, og derefter blev supernatanten fjernet. Frisk trypsiniseret og vaskede celler (GC9811, GC9811-p, SGC7901-NM, SGC7901-M) blev suspenderet i RPMI1640 indeholdende 1% føtalt bovint serum. Derefter 100 pi af cellesuspensionen (1 x 10

5 celler) blev tilsat til det øvre kammer af hver indsats, der var beklædt med Matrigel. Dernæst blev 450 pi RPMI1640 indeholdende 10% føtalt bovint serum tilsat til det nedre rum, og cellerne fik lov til at invadere i 24 timer-48 timer ved 37 ° C i en CO 5%

2 befugtet inkubator. Efter inkubation blev cellerne fikseret med 95% absolut alkohol og farvet med krystalviolet. Celler på den øvre overflade af filteret blev fjernet med vatpinden og cellerne, som havde invaderet i den nederste overflade af filteret, blev talt og afbildet under et omvendt mikroskop (Olympus Corp. Tokyo, Japan) ved × 200 forstørrelse over ti tilfældigt felter i hver brønd. Hvert forsøg blev udført tre gange.

Cell migration

evne GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM, og SGC7901-M-celler til at migrere blev påvist under anvendelse Transwells [8-um pore størrelse, Corning Costar Corp]. Transbrøndene blev anbragt i 24-brønds plader. Frisk trypsinbehandlet og vaskede celler blev suspenderet i RPMI1640 indeholdende 1% føtalt bovint serum. 5 × 10

4 celler /brønd blev placeret i top kammer i hver indsats (BD Biosciences, NJ), og den ikke-coatede membran. 450 pi RPMI1640 indeholdende 10% føtalt bovint serum blev tilsat til de nedre kamre. Efter inkubering i 24 timer-48 timer ved 37 ° C i en CO 5%

2 befugtet inkubator blev cellerne fikseret med 95% absolut alkohol og farvet med krystalviolet. Cellerne i det indre kammer blev fjernet med en vatpind og cellerne fastgjort til undersiden af ​​membranen blev talt og afbildet under et omvendt mikroskop (Olympus Corp. Tokyo, Japan) ved × 200 forstørrelse over ti tilfældige felter i hver brønd . Hvert eksperiment blev udført tre gange.

In vivo metastase assay

I in vivo metastase assays, de stabile cellelinier GC9811-P og SGC7901-M blev høstet fra vævskultur-kolber efter transfektion med lentivirus pGCsil-GFP- lad-7f og styre pGCsil-GFP ved anvendelse af trypsin og vasket tre gange med PBS. Derefter 2 × 10

6 celler blev suspenderet i 0,2 ml serumfrit RPMI1640 for hver mus (seks i hver gruppe, Fale BALB /c-nu /nu, 6-8 uger gamle), og cellerne blev injiceret i halevene. Efter fire uger efter injektion, blev musene aflivet. Levervævet blev observeret med det blotte øje, og antallet af synlige tumorer i leveren overflade blev talt. Levervæv blev inddelt i serielle sektioner, fast med phosphatbufret neutralt formalin, farves med hematoxylin og eosin og undersøgt histologisk. Nøgne mus blev manipuleret og plejet efter NIH Animal Care og brug Udvalg retningslinjer i Experiment Animal center for Fjerde Military Medical University (Xi’an, Shanxi-provinsen, PR Kina).

Luciferase Reporter Assay

For at undersøge om MYH9 ekspression blev reguleret af lad-7f blev en dual-luciferase reporter assay udføres. 3’UTR af MYH9 indeholdende Lad-7f bindingssted blev amplificeret ved PCR. Forstærkning af MYH9 anvendt følgende primere: (Fremad) XhoIF: 5’CCGctcgagGCCTCTTCTCCTGCAGCCTG 3 ‘(Reverse) NotIR: 5’ATAAGAATgcggccgcTCGTAGCACATGGTTCTCTTTATTG 3’

Som en negativ kontrol, det muterede bindingssted af 3′-UTR sekvens (ved hjælp af reverse komplement af bindingsstedet) blev amplificeret ved anvendelse af primerne: (Fremad) mutlet7MYH9F: 5’TTGCAATCACACGTGGTGTGGAGTCACACCTCTGCCCCTTGG3 «(bagside) mutlet7MYH9R: 5’CCAAGGGGCAGAGGTGTGACTCCACACCACGTGTGATTGCAA 3 ‘. Produkter blev regenereret via agarosegelelektroforese og klonet ind i luciferase reporter PsiCHECK vektor (Promega, Madison, WI). Alle konstruktioner blev verificeret ved sekventering. Log fase GC9811-P-celler blev podet i 24-brønds plader og cotransficeret med Let-7F inhibitorer eller kontrol, og luciferase journalister bruger Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen), efter anvisningerne. Efter 48 timers inkubation blev ildflue og Renilla luciferase aktivitet målt med det dobbelte luciferase reporter assaysystem (Promega).

Western Blot

Celler blev vasket to gange med iskold PBS og skrabet over i RIPA-buffer (50 mM Tris-HCI pH 7,4, 1% (volumen /volumen) Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM leupeptin, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4) med frisk tilsat protease inhibitor cocktail (Roche) i 15 minutter på is, derefter centrifugeret ved 13.000 rpm i 10 min, og supernatanterne blev opsamlet. Ti mikrogram af hver prøve blev løst ved anvendelse af 6% SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran (Bio-Rad, Hercules, CA). Båndene blev inkuberet med 10% fedtfri tørmælk i Tris-bufret saltvand-0,1% Tween-20 for at blokere de ikke-specifikke bindingssteder og inkuberet med et primært antistof: kanin polyklonalt anti-human myosin IIA (fortyndet 1:500; Cell Signaling Technology ) natten over ved 4 ° C. Efter genopvarmning og gentagen vask tre gange, 15 min for hver enkelt, blev membranerne inkuberet med peberrod-peroxidase-konjugeret anti-kanin sekundært antistof (Santa Cruz Biotechnology), fortyndet 1:2000 i to timer ved stuetemperatur. Båndene blev detekteret anvendelse af et forstærket kemiluminescens-system (Amersham Biosciences).

Immunhistokemi

To væv arrays blev købt fra SHANXI Chaoying BIOTEKNOLOGI CO., LTD. En var gastrisk cancer væv og matches tilstødende normale mave væv, den anden var mavekræft væv og matches lymfeknudemetastase .Tissue arrays blev afvokset i 60 ° C i 2 timer, høj temperatur antigen recovery for 10 minutter, rehydreret, inkuberet i 10% normalt gedeserum i 1 time, derefter inkuberet med kanin polyklonalt anti-human myosin II A (fortyndet 1:100; Cell Signaling Technology) natten over ved 4 ° C. Objektglassene blev vasket i PBS tre gange i 5 min hver. Vævene blev inkuberet i gede-anti-kaninserum (DAKO) i 1 time, skyllet med PBS. Snit blev påvist under anvendelse af DAB og modfarvet med hæmatoxylin. Den farvningsintensitet blev scoret med en fire-trins skala (0, 1+, 2+ eller 3+), og procentdelen af ​​positive celler blev estimeret ved tre forskellige patologer (0 = ingen, 1 = 1%, 2 = 1 -10%, 3 = 10-30%, 4 = 30-70%, 5 = 70% af tumorcellerne). Samlede gennemsnitlige score blev derefter inddelt i fire kategorier: negativ (ingen påviselig farvning når evalueret i forhold til uspecifik baggrund farvning, svag (+), moderat (++) eller stærk (+++) og sammenlignet ved hjælp af Mann-Whitney test

Statistisk analyse

t-test (to-halet), One-way ANOVA og Mann-Whitney-test blev anvendt til at analysere in vitro og in vivo-data ved hjælp af SPSS 12.0 software (Chicago, IL , USA) P-værdi. 0,05 blev defineret som statistisk signifikant *

P

. 0,05; **

P

. 0,01

Resultater

niveauet af lad-7f udtryk blev ofte faldt i human GC metastatisk cellelinjer og væv

Vi har undersøgt de mRNA ekspressionsniveauerne af lad-7f i to par menneskelige gastrisk cancer cellelinjer, GC9811, GC9811 -P og SGC7901-NM, SGC7901-M. Som vist i figur 1A, ekspression af lad-7f var lavere i GC-celler, GC9811-P og SGC7901-M, med høj metastatisk potentiale, mens lad-7f blev mere stærkt udtrykt i GC celler, GC9811 og SGC7901-NM, med lavt metastatisk potentiale. For yderligere at validere rolle lad-7f i gastrisk kræftceller metastase, vi sammenlignet ekspressionsniveauerne af lad-7f i friske humane gastrisk cancer vævsprøver med metastaser fra otte individer (tabel S1), til normale gastrisk væv (NG), primær mavekræft væv (GC) og fjerne metastatisk gastrisk kræft væv (MC) henholdsvis ved real-time PCR. Interessant nok var der bemærkelsesværdigt nedregulering af lad-7f i MC og GC, sammenlignet med lade-7f ekspression i NG (figur 1B). Vi observerede, at enten tabet af eller nedsat ekspression af lad-7f i tumorer og deres metastatiske væv resulterede i forøget metastase i gastrisk cancer væv. Resultaterne alle foreslog, at ekspressionen af ​​Lad-7f var negativt korreleret meget tæt sammen med nedsat GC metastaser og kan spille en afgørende rolle i patologiske processer. Vi har således givet klinisk og cellulære konceptuelle bevis for en metastatisk skifte i udvikling kræft, der tyder på en central rolle for ekspressionen af ​​lad-7f i udviklingen af ​​kræft.

(A) De gennemsnitlige fold-ændringer i lade-7f genekspression i GC9811 og GC9811-P (til højre). Den gennemsnitlige fold-ændringer af Lad-7f genekspression i SGC7901-NM og SGC7901-M (til venstre). T-test, n = 3. (B) Den relative ekspression af lad-7f til 5S. *

P

0,05. **

P

0,01. envejs ANOVA, n = 8. Real-time PCR viser, at den relative ekspression af lad-7f i otte tilstødende ikke-kræft gastriske vævsprøver, og i gastriske cancercellelinier GC9811, SGC7901-NM er højere end i deres primære mavekræft og fjerne gastrisk metastase prøver og det store potentiale metastase mavekræft celle GC9811-P og SGC7901-M.Each prøve blev analyseret i tre eksemplarer og normaliseret til 5S. Fold ændring blev beregnet ved 2-

ΔΔ

Ct.

Lad-7f hæmmede de invasive og metastatiske evner GC celler in vitro

Fordi Lad-7F handlinger som en omrører i invasion og metastatiske processer, undersøgte vi virkningerne af faldet lad-7f om ugunstigt metastatiske cellelinier og øget lad-7f på mere-metastatiske cellelinier. For at opnå dette, korte interfererende RNA (siRNA) oligonukleotider af Lad-7f blev konstrueret og indført i GC9811 celler og SGC7901 -Nm celler til metastase analyser in vitro, som GC9811-lad-7f-siRNA celler, SGC7901-NM-lad-7f -siRNA celler og kontrol celler. Samtidig mimic-let-7F og negative kontroller oligonukleotider blev også konstrueret og indført i GC9811-P-celler og SGC7901-M-celler for metastase in vitro-assays som GC9811-P-let-7f-efterligner celler, SGC7901-N-har lad -7f-efterligner celler og kontrol celler. Udtømning af lad-7F væsentligt forringet evne GC9811 celler at migrere og invadere gennem Matrigelcoatede membraner eller ikke-Matrigelcoatede membraner mod serumholdigt medium i en modificeret Boyden kammer assay (figur 2A). Forøget ekspression af lad-7F undertrykte signifikant evne GC9811-P-celler til at migrere og invadere gennem Matrigelcoatede membraner eller ikke-Matrigelcoatede membraner mod serumholdigt medium i en modificeret Boyden kammer assay (figur 2B), sammenlignet med kontrolcellerne. Lignende resultater blev fundet i SGC7901-NM-celler (figur 3A) og SGC7901-M-celler (figur 3B), mens lad-7f knockout i GC cellelinjer resulterede i højere invasion og migration satser.

(A) Invasion og migration assay. Repræsentative områder af invasiv (op) eller migration (ned) celler på membranen (venstre). (Forstørrelse på × 200). invasive eller migration gennemsnitlige celleantal pr felt (højre). Den invasive eller migration celle antal GC9811 celler transficeret med Lad-7f-hæmmere er drastisk end transficeret med negativ kontrol. * P 0,05, t-test, n = 10. (B). Den invasive eller migrering celle antal GC9811-P Celler transficeret med Lad-7f-efterligner er drastisk reduceret end transficeret med negativ kontrol. * P 0,05, t-test, n = 10.

(A) Invasion og migration assay. Repræsentative områder af invasiv (op) eller migration (ned) celler på membranen (venstre). (Forstørrelse på × 200). invasive eller migration gennemsnitlige celleantal pr felt (højre). Den invasive eller migration celle antal SGC7901-NM transficeret med Lad-7f-hæmmere er drastisk end transficeret med negativ kontrol. * P 0,05, t-test, n = 10. (B) Den invasive eller migrering celle antal SGC7901-M-celler transficeret med lad-7F-efterligner er faldet drastisk end den, der er transficeret med negativ kontrol. * P 0,05, t-test, n = 10.

Lad-7f hæmmer tumor invasion og metastase i en nøgen mus xenotransplantationsmodel

GC9811-P eller SGC7901-M tumorceller transficeret med lentivirus pGCsil-GFP- lad-7f eller negativ kontrol pGCsil-GFP blev injiceret i nøgne mus og musene blev aflivet fire uger efter vaccination. Antallet af metastatiske Nodi blev dramatisk reduceret i de nøgne mus injiceret med pGCsil-GFP- lad-7F transficerede celler, sammenlignet med de negative kontroller (figur 4A, 4B). Disse data giver stærke beviser for, at lade-7f kan hæmme tumor invasion og metastase in vivo.

GC9811-P og SGC7901-M-celler blev transficeret med lentivirus pGCsil-GFP-lad-7f eller negativ-kontrol lentivirus pGCsil- GFP, og derefter injiceret i nøgne mus via halevenen, som beskrevet i Materialer og Metoder. Dyr blev aflivet 4 uger efter injektion. (A) Repræsentative anatomiske billeder af liv fra mus injiceret med GC9811-P- pGCsil-GFP eller GC9811-P- pGCsil-GFP- lad-7f (til venstre). Det gennemsnitlige antal synlige tumorknuder i leveren (højre). P 0,01. T-test, n = 6. (B) Repræsentative anatomiske billeder af liv fra mus injiceret med SGC7901-M – pGCsil-GFP eller SGC7901-M – pGCsil-GFP- lad-7f (til venstre). Det gennemsnitlige antal synlige tumorknuder i leveren (højre). P 0,01. T-test, n = 6.

Lad-7f nedregulerer myosin IIA udtryk ved direkte målrette sin 3’UTR

For yderligere at udforske den mekanisme, hvormed lad-7f undertrykker GC invasion og metastase, analyserede vi potentielle nedstrøms tumormetastase-relaterede målgener i silico. Vi fokuserede på lad-7F målgener, især de gener, der var migration og /eller invasion-relaterede, og fandt, at myosin IIA, inddraget i udviklingen af ​​cancer cellemigrering eller invasion, kan være målgenet af lad-7f. I et forsøg på at fastslå, om myosin IIA reguleres af lad-7f gennem direkte binding til dens 3’UTR, konstrueret vi fuldlængde vildtype og mutant fragmenter af MYH9 mRNA 3’UTR og indsat dem i regionen umiddelbart nedstrøms for et luciferasereportergen (figur 5A). Efterfølgende lad-7F efterligner oligoer blev co-transficeret med forskellig luciferase 3’UTR-konstruktioner ind GC9811-P-celler. Vi fandt, at lade-7f faldt den relative luciferaseaktivitet i vildtype 3’UTR af MYH9 (figur 5B). Men luciferaseaktivitet ikke falde kraftigt i UTR’er med mutante bindingssteder, sammenlignet med de mut-type modstykker (figur 5C). Disse data understøtter, at MYH9 er direkte mål for lade-7f.

(A) Predicted duplex-dannelse mellem human MYH9 3’UTR (øverst) og har-let-7f (nederst) og sekvensen af ​​bogstav 7f-bindingssted i MYH9 3’UTR og mutant (mut) MYH9 3’UTR. Luciferaseaktivitet af MYH9 3’UTR (B) eller mut MYH9 (C) 3’UTR reportergen i GC9811 celler inficeret med den lad-7f, lad-7f-inhibitor, tom eller efterligner oligo. Analyserne viste, at luciferaseaktiviteter i gruppen signifikant var faldet i forhold til de af de mutante og negative kontrolgrupper. * P 0,05. (D) Udtrykket af MYH9 blev analyseret ved QRT-PCR. MYH9 blev reduceret i GC9811 celler og SGC7901 celler transficeret med lad-7F-efterligner i forhold til GC9811 celler og SGC7901 celler transficeret med lad-7f -negativ kontrol. (E) lad-7f undertrykker de endogene proteinniveauer af MYH9, som påvist ved Western blot. Stabil transducerede SGC7901-NM og GC9811 celler ektopisk udtrykker Lad-7f blev anvendt til Western blot-analyse. Effekt af lad-7f på MYH9 i GC9811 celler (øverst). Effekt af lad-7f på MYH9 i SGC7901-NM-celler (nederst).

RT-PCR viste, at ekspressionen af ​​MYH9 i GC9811 celler og SGC7901-NM-celler transficeret med lad-7F-efterligner er nedreguleret i forhold til de celler transficeret med kontrol konstruktioner (figur 5D). Western blotting-resultater viste ekspression af myosin IIA i GC9811 og SGC7901-NM-celler transficeret med lad-7f-efterligner er nedreguleres sammenlignet med dem transficeret med negativ kontrol (figur 5E). Furthmore, Real-time PCR viser, at mRNA relative udtryk for MYH9 i GC væv og fjern metastatisk væv er nedreguleret i forhold til deres normale tilstødende ikke-kræft prøver (figur 6A). Immunhistokemi viste at ekspressionen af ​​myosin IIA i GC lymfeknudemetastase opreguleres sammenlignet med dets primære GC væv (tabel 2; figur 6C; fig S1B), og det er opreguleret i GC væv sammenlignet med dets matchede tilstødende normale mave væv (tabel 1, figur 6B, figur S1A) .Disse data viser, at lade-7f kan nedregulere mRNA ekspressionen af ​​MYH9 og kan undertrykke protein oversættelse af det

(A) Real-time PCR show. at den relative ekspression af MYH9 i otte fjerne gastriske metastase prøver er højere end i deres primære gastrisk cancer og tilstødende ikke-kræft gastriske vævsprøver. Hver prøve blev analyseret i tre eksemplarer og normaliseret til 18S. (B) Ekspression af MYH9 i primær gastrisk cancer (Ca) og dens tilstødende normale mave væv (N) ved IHC. (C) Ekspression af MYH9 i primær gastrisk cancer (Ca) og dens matchede lymfeknude metastaser væv (M) af IHC. Vejviser

Diskussion

I nærværende undersøgelse, viste vi, lad-7f udtryk i metastatisk GC cellelinjer blev nedreguleret i forhold til lade-7f udtryk i ikke-metastatiske GC celler. Ektopisk udtryk og siRNA knockdown af Lad-7f bekræftet sin invasion-undertrykke aktivitet in vitro og in vivo. Desuden viser vi, at MYH9 er et direkte mål for lad-7f og dette Lad-7f medieret undertrykkelse af MYH9 er afhængig af dens 3′-UTR. Derfor er disse resultater fremhæver betydningen af ​​lad-7f som en tumorsuppressor i celleinvasion og metastase ved at målrette MYH9 i gastrisk cancer.

Nylige undersøgelser viser, at miRNA kan virke som aktivatorer eller inhibitorer af tumormetastase [27] . For eksempel, microRNA-10b [28], MIR-373 og MIR-520C [29], [30] stimuleret cancer cellemigration og invasion i brystcancer. Derudover kan MIR-155 fremmer tumorinvasion og metastase i brystcancer ved nedregulere sit mål, RhoA [31] og fremme tumorinvasion og metastase i pancreas kanalen carcinoma ved at undertrykke ekspressionen af ​​TP53INP1 [32]. Den miRNA-200 familie (miRNA-200a, miRNA-200b, miRNA-200c, miRNA-141 og miRNA-429) kan hæmme tumor invasion og metastase ved at regulere EMT [33]. MIR-126 viste sig at inhibere celleadhæsion, migrering og invasion delvist gennem suppression af CRK i en in vitro model af ikke-småcellet lungekræft [34]. Det er blevet vist, at MIR-29c er betydeligt reduceret i meget invasiv og metastatisk nasopharyngeal carcinom [35]. MIR-218 inhiberer invasion og metastase af gastrisk cancer ved at målrette Robo1 receptoren [26]. Skønt mange undersøgelser er blevet udført for at undersøge mekanismen for miRNA og tumormetastase, mekanismen var ikke klart. Vigtigst er få undersøgelser blevet udført på mekanismerne i GC metastaser regulering af microRNA.

Lad-7f gen er placeret på 9q22.3, og er involveret i en række fysiologiske og patologiske processer, herunder angiogenese [36], immunocyt differentiering [37], replikativ senescens [38], vækststandsning [39], pulmonal arteriel hypertension og carcinogenese [23]. Lad-7f nedreguleres i flere maligniteter. En meget karakteriserede eksempel er renalcellecarcinom, hvor Lad-7f nedregulering førte til et betydeligt fald i kallikrein (KLK) udtryk [40]. KLKs kan også blive ramt af lad-7f i æggestokkræft [25]. I papillær thyreoideacancer, reduceret ekspression af lad-7f kan være en væsentlig molekylær begivenhed i RET /PTC malign transformation [41]. I tilfælde af primær brystcancer blev imidlertid let-7f opreguleret sammenlignet med normale hosliggende tumorvæv [22]. I vores undersøgelse, vi viste, at lade-7f også nedreguleres i MC væv og GC cellelinier med høj metastatisk potentiale, og vi nærmere den mekanisme, hvormed Lad-7f reduceret tumor invasion og metastase.

MYH9 er genet for non-muscle myosin tung kæde IIA (NMHCIIA), hvis mutationer er ansvarlige for en kompleks lidelse navngivet MYH9-relateret sygdom, kendetegnet ved en kombination af forskellige fænotypiske træk [42]. NMMHC-IIA, 1960 aminosyrepolypeptid, med et oversat molekylvægt på 220 kDa, er et konventionelt, ikke-sarcomerisk myosin udtrykt i de fleste celler og væv.