PLoS ONE: Følsomhed af kræftceller til trunkeret Difteri Toxin

Abstrakt

Baggrund

Difteri toxin (DT) er blevet anvendt som en potentiel anti-cancer middel til målrettet levering af cytotoksisk behandling til ellers ubehandlelig neoplasi. DT er en yderst potent toksin, som indtastning af et enkelt molekyle i en celle kan være dødelig. DT er målrettet mod cancerceller ved at slette cellereceptor-bindende domæne og kombinere de resterende katalytiske del med målretning proteiner, der selektivt binder til overfladen af ​​cancerceller. Det er blevet antaget, at “receptorless” DT kan ikke binde sig til og dræbe celler. I den foreliggende undersøgelse rapporterer vi, at “receptorless” rekombinant DT385 er i virkeligheden cytotoksisk til en bred vifte af kræft cellelinjer.

Metoder

In vitro

cytotoksicitet af DT385 var målt ved celleproliferation, cellefarvning og apoptose assays. For

in vivo

undersøgelser blev kyllingechorioallantoinmembranen (CAM), der anvendes til at evaluere effekten af ​​DT385 på angiogenese. CAM’en og musemodel blev anvendt til at evaluere effekten af ​​DT385 på HEp3 og Lewis lungecarcinom (LLC) tumorvækst, henholdsvis.

Resultater Salg

18 humane cancercellelinier testet, 15 var påvirket af DT385 med IC

50 spænder fra 0,12 til 2,8 uM. Endvidere høje koncentrationer af DT385 undladt at påvirke væksten standsede celler. Den cellulære toksicitet af DT385 skyldtes inhibering af proteinsyntese og induktion af apoptose.

In vivo

, DT385 formindsket angiogenese og nedsat tumorvækst i CAM-systemet, og hæmmede den subkutane vækst LLC tumorer hos mus.

Konklusion

DT385 besidder antiangiogen og antitumoraktivitet og kan have potentiale som et terapeutisk middel

Henvisning:. Zhang Y, Schulte W, Pink D, Phipps K, Zijlstra a, Lewis JD, et al. (2010) Følsomhed af cancerceller til Trunkerede difteritoksin. PLoS ONE 5 (5): e10498. doi: 10,1371 /journal.pone.0010498

Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, USA

Modtaget: 5. november 2009; Accepteret: 14. april 2010. I Udgivet: 5 maj 2010

Copyright: © 2010 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Nova Scotia Health Research Foundation (NSHRF). YZ understøttes af en studentship fra Cancer Research Training Program, Dalhousie University. JDL er støttet af tilskud # 018.176 fra NCIC /Terry Fox Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

difteritoksin (DT) syntetiseres i

Corynebacterium diphtheriae

som et enkeltkædet enzym af 535 aminosyrer med en molekylvægt på 63.000 [1], [2]. DT består af tre centrale domæner: amino-terminal C, eller katalytiske, domæne (rest 1-186); den mellemliggende T eller transmembrane, domæne (resterne 202-381); og carboxylterminale R eller receptor-bindende, domæne (resterne 391-535). Det katalytiske domæne er forbundet til T-domænet af en arginin-rige loop og en let reducerbar disulfidbro (som forbinder C186 til C201). DT har vist sig at indtaste toksin-sensitive pattedyrceller ved receptormedieret endocytose, som involverer interaktionen af ​​receptor-bindende domæne af proteinet med et transmembrant celleoverflade forløber for heparinbindende epidermisvækstfaktor-lignende vækstfaktor [3] [4]. Efter binding til denne celleoverfladereceptor, er DT endocytose og smugles en sur vesikulær rum, hvor den undergår en pH-afhængig konformationel ændring, spaltning og frigivelse af det katalytiske domæne. T-domænet indsættes i den vesikulære membran og den resulterende kanal er anvendt til translokationen af ​​den katalytiske domæne til cytosolen. Der er den katalytiske subunit katalyserer ADP-ribosylering af elongeringsfaktor 2, hvilket resulterer i inhibering af proteinsyntese og celledød (gennemgået i [5]).

En række afkortede rekombinante DT-proteiner er blevet produceret hvori receptorbindende domæne er genetisk erstattet af ligander, som selektivt kan målrette maligne celler. Disse fusionsproteiner repræsenterer en ny klasse af cytotoksiske midler, der i modsætning chemotherapeuticDT er blevet vist at indtaste toksin-sensitive pattedyrceller ved receptormedieret endocytose, som involverer interaktionen af ​​receptor-bindende domæne af proteinet med narkotika, dræbe målceller ved at hæmme proteinsyntese og derved inducere apoptose [6]. Disse fusionsproteiner omfatter DT508-MSF [7], DT486-IL-2 [8], DT486-GM-CSF [9], DT390-IL3 [10], DT388-GM-CSF [11] – [13], DT388 -IL-3 [14], [15], DT385-VEGF [16], [17] og DT388 kombineret med ATF domænet af uPA [18]. Blandt de resulterende stoffer, har DT388IL-3 vist en vis løfte i kliniske forsøg [19], [20], mens DT389-IL-2 rekombinant toksin (DAB389-IL-2, denileukin diftitox-Ontak) er blevet godkendt af FDA til klinisk anvendelse i fremskredent stadium kutant T-celle lymfom (gennemgået i [21] – [23]

det er almindeligt anerkendt, at effektiviteten af ​​de DT fusionsproteiner ligger i evnen af ​​den målsøgende ligand komponent til. dirigere DT for cancerceller resulterer i målrettet cellulær toksicitet. Desuden forventes fjernelsen af ​​DT-receptor-bindende domæne til at resultere i et trunkeret DT der ikke er i stand til at interagere med sin receptor på overfladen af ​​eukaryote celler og derfor ude af stand til at binde til og dræbe celler. Dette koncept er blevet forstærket af den rapport, den afkortede DT (DT385) ikke er cytotoksisk [16].

i den aktuelle undersøgelse, viser vi, at i modsætning til tidligere rapporter, den rekombinante afkortede DT , DT385 er cytotoksisk for mange cancerceller. Vi observerede også, at DT385 hæmmer væksten af ​​humane og muse-tumorer. Vores resultater etablere effektiviteten af ​​DT385 som et potentielt antitumormiddel.

Materialer og metoder Salg

cellelinier

Humant navlestrengsveneendotelceller (HUVEC) blev opnået fra Cell Applications, Inc. og dyrket i en endotelcelle-vækstmedium med fuld væksttilskud (cell Applications, Inc.). Bovin pulmonal endotelceller (BPAEC) og menneskelig dermale mikrovaskulære endotelceller (HDMEC) blev opnået fra Lonza og blev dyrket i en EBM medium plus EGM SingleQuots af vækst kosttilskud og EBM-2 medium plus EGM-2 SingleQuots af vækst kosttilskud (Lonza) , henholdsvis. Gliom cellelinjer U-87 MG og U251 blev venlig at give af Dr. V. Wee Yong (University of Calgary, Calgary, Alberta, Canada). Den humane epidermoide carcinom cellelinie HEp3 var en generøs gave fra Dr. Andries Zijlstra (Vanderbilt University, USA). Muse embryonale fibroblast (MEF) celler blev isoleret fra musefostre og blev anvendt ved deres tidlige passager (mindre end passagen 4). U-87 MG, U251, HEp3 og MEF-celler blev dyrket i DMEM indeholdende 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (FBS, Invitrogen) og 1% penicillin-streptomycin blandinger (Invitrogen). Alle andre cellelinjer blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) og blev dyrket i DMEM, MEM eller RPMI (Invitrogen) indeholdende 10% (volumen /volumen) føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin blandinger ifølge ATCC anvisninger. Alle celler blev dyrket i en inkubator ved 37 ° C indeholdende 5% CO2. Alle endotelceller og primære fibroblastceller blev opretholdt og anvendt før den niende passage.

Induktion og oprensning af rekombinante proteiner

Plasmidet pET17b-DT385 udtrykker “receptorless” DT385 var generøst tilvejebragt af Dr. Sundaram Ramakrishnan (Department of Pharmacology, University of Minnesota Medical School, Minneapolis, MN). Plasmidet pET17b-p22 blev konstrueret ved kloning human plasminogen fragment p22 i pET17b (EMD Biosciences) til Ndel- og BamHI-restriktionssteder. Plasmidet pLIC-DT385-p22 blev konstrueret ved kloning human plasminogen fragment p22 i plasmidet pLIC-DT385 på Ncol- og Hindlll-restriktionssteder, mens plasmidet pLIC-DT385 blev konstrueret ved at indsætte DNA, der koder DT385 men mangler stopkodonen i pET -30 EK /LIC-vektoren efter fabrikantens protokol (Novagen). Plasmidet pSUMO koder cDNA for SUMO (små ubiquitin-relaterede modifikator, Saccharomyces cerevisiae, Smt3 genet) blev venligst leveret af Dr. Kaisong Zhou (Dalhousie University). Alle plasmidkonstruktioner blev bekræftet ved DNA-sekventering (DalGEN, den Dalhousie University DNA-sekventering facilitet). Rekombinant p22, blev SUMO, DT385, og DT-p22 udtrykt i

E. coli

og oprenset ved Ni-NTA affinitetssøjle (Qiagen), samles og dialyseres natten over mod phosphatbufret saltvand (PBS). Alle rekombinante proteiner blev oprenset som et enkelt bånd som afsløret ved SDS-PAGE-analyse. LPS blev fjernet fra oprensede proteiner ved hjælp polymyxin B perler (Detoxi-Gel Endotoxin Fjernelse Gel, Pierce) ifølge producentens instruktioner. Flere passager gennem kolonnen blev udført indtil LPS niveau var mindre end 30 EU /mg.

Cellelevedygtighed assay

Cellelevedygtighed blev vurderet af Cell Titer96 Aqueous One Solution celleproliferationsassay (MTS-assay -Promega) under anvendelse af fabrikantens protokol. IC

50 værdier blev beregnet ved ikke-lineær mindste kvadraters montering af dosis-respons-kurver ved hjælp af open source computerprogram QTI PLOT. Data blev analyseret med de fire-parameter logistisk ligning f = (a – d) /[1 + (x /c) b] + d, hvor

en

er den asymptotiske maksimum,

b

er en skråning parameter,

c

er værdien ved vendepunktet (IC

50) og

d

er den asymptotiske minimum. For en kontrol blev 0,4 uM eller 1,2 uM DT385 tilsat til vævskulturmedium i fravær af celler efterfulgt af inkubation med MTS /PMS reagens. Reduktion af MTS blev ikke observeret under disse betingelser, hvilket bekræfter, at DT385 ikke har ændret på denne analyse.

krystalvioletfarvning

Celleproliferation blev også evalueret med krystalviolet farvning. Ved afslutningen af ​​behandlingen med DT385 blev celler fikseret med 100% methanol og farvet med 0,5% krystalviolet i 20% methanol i 15 minutter ved stuetemperatur. Farvede celler blev fotograferet ved 25 ganges forstørrelse på et Zeiss Axiover 200 inverteret mikroskop (Carl Zeiss, Tyskland).

Apoptose og nekrose Assay

Apoptotisk og nekrotiske celler blev visualiseret med apoptose og nekrose assay kit (Biotium, Inc) ifølge producentens protokol. Farvede celler blev fotograferet på et Zeiss Axioplan II fluorescensmikroskop (Carl Zeiss, Tyskland), med passende filter indstillinger for fluoresceinisothiocyanat (FITC) og Texas Red fluorescens. Digitale billeder blev forarbejdet i Adobe Photoshop (Adobe Inc.).

Proteinsyntese assay

U-87 MG eller Hela-celler blev podet i et forhold på 1:10 i 1 ml DMEM plus 10% FBS pr brønd i en 12-brønds plade natten over. Celler blev behandlet med 1 pM DT385 i den angivne tid, inkuberet i 15 minutter ved 37 ° C med 0,5 ml mærkning medium (methionin-frit DMEM, 10% dialyseret FBS og 50-100 pCi Pro-Mix L – [

35 -S] – (Amersham)), og cellelysater analyseret ved SDS-PAGE. Radioaktive bånd blev visualiseret ved radiografi under anvendelse af en phosphorimager efter eksponering natten over på en phosphor-skærm. Til kvantificering, [

35S] inkorporering blev målt ved væskescintillationstælling.

kyllingechorioallantoinmembranen (CAM) angiogenese-assay

antiangiogene aktivitet af proteiner blev testet på CAM’et som beskrevet [24]. Ved analyse tumorinduceret vaskularisering, 50.000 HEp3 celler erstattet bFGF /VEGF som den angiogene stimulus [25]. Fire implantater blev anbragt på hver CAM og ti embryoer blev anvendt til hver eksperimentel forbindelse.

CAM tumorvækstassay

HEp3-GFP tumorceller (100.000 celler /10 pi DMEM medier) blev påført direkte til et filter-disc slitagestøv område af CAM af 9 dage gamle kyllingefostre, som beskrevet af [26]. Kyllinger blev inkuberet under standardbetingelser indtil dag 15, når tumorer blev afbildet og sorteret for tilfældig fordeling at kontrollere og behandlingsgrupper. Daglige systemiske intravenøse injektioner af DT385 (2 ug i 50 pi PBS) eller PBS (50 pi) blev udført på dag 15, 16 og 17. På dag 18 blev tumorer udskåret, befriet for CAM og derefter vejet. Alternativt blev fluorescerende (GFP) Hep3 tumorer afbildet

in vivo

hjælp af en Zeiss Lumar fluorescens stereomikroskop. Omridset af tumoren blev bestemt under anvendelse af fluorescens-signalet af tumorcellerne (GFP kanal (EX470 /em525)). Konkret blev Volocity software kalibreret til at vælge områder med fluorescens intensitet svarende til 1 eller flere standardafvigelser over baggrunden. Arealet af tumoren blev defineret og beregnet ved anvendelse Improvision Volocity software (Perkin Elmer, Inc.). (Version 5.3.0 Build 0). En måleenhed (1 mm) blev kalibreres ved hjælp af gitter af et hæmocytometer. Bestemmelsen af ​​tumor volumen antager formen til at være hemiellipsoidal og ligningen for tumor volumen: V = π /6 • (længde) • (bredde) • (højde), hvor højden = 1.63√ (længde • Bredde). Data blev analyseret ved hjælp af Students t-test.

Mus tumor model

Alt animalsk arbejde blev udført på dyret facilitet Dalhousie University i overensstemmelse med de retningslinjer, der er anført i pasning og anvendelse af Laboratorie Dyr efter Dalhousie University. Alle undersøgelser blev godkendt af Dalhousie Animal Research Ethics Board. Kvinde 6- til 8-uger gamle C57BL6 /J-mus (Jackson Laboratories) blev anvendt. Tumorer blev induceret ved subkutan injektion af LLC-celler (10

6 celler) i 100 pi sterilt PBS. Tydelige tumorer blev etableret tre til fire dage efter injektion, hvorefter musene blev randomiseret til to forsøgsgrupper, dem, der modtog rekombinant SUMO (kontrol), og dem, der modtog rekombinant DT385 behandling. SUMO og DT385 blev administreret til mus, peritumoralt på dag 5 (25 ug i 100 pi PBS), og på dag 9, 12 og 15 (10 ug i 100 pi PBS hver injektion).

Protein mærkning med FITC

DT385 og BSA var FITC-mærket under anvendelse af EZ-label FITC proteinmærkningsreagenset Kit ifølge producentens protokol (Pierce).

Ammoniumchlorid udvaskning undersøgelser

U87-celler blev inkuberet i fravær eller nærvær af DT385 (2 uM) alene eller i kombination med 10 mM ammoniumchlorid. Mediet blev fjernet på forskellige tidspunkter og erstattet med frisk medium. For seksogtredive timer efter tilsætningen af ​​testforbindelser blev cellelevedygtighed målt ved MTS-assayet.

Statistical Analysis

Betydningen af ​​dataene blev bestemt under anvendelse af t-test (one-tailed ). P-værdier for 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Karakterisering af DT385

Nylige undersøgelser fra vores laboratorium identificeret og karakteriseret en roman antiangiogenisk fragment af plasminogen kaldes p22 [. ,,,0],27]. Da p22 var en potent og specifik inhibitor af kapillære endotelceller, blev det forudset, at dette protein kunne anvendes til at målrette DT til nydannede vaskulatur. Vi udtrykte et fusionsprotein i

E. coli

hvori p22 blev erstattet af receptor-bindende domæne af DT (DT385-p22). Aktiviteten af ​​dette fusionsprotein blev sammenlignet med rekombinant DT385 og rekombinant p22. For at bestemme virkningen af ​​disse forbindelser på cellelevedygtighed blev MTS-analyser udført på kvæg pulmonale arterie endotelceller (BPAEC) efter en tre-dages behandling. Interessant observerede vi, at i modsætning til p22 fremstilles ved proteolytisk spaltning af humant plasminogen [27], den rekombinante p22 inhiberede ikke levedygtigheden af ​​BPAEC (figur 1A). Desværre har vi ikke været i stand til at producere aktiv rekombinant p22 i

E. coli

eller gær (data ikke vist). Af særlig interesse var vores observation, at både den rekombinante DT385-p22 konstruktion og rekombinant DT385 dramatisk faldt antallet af levedygtige BPAEC. Vi bestemt en IC

50 værdi på 0,21 uM og 0,14 uM for DT385-p22 og DT385 (Tabel 1).

Rekombinant p22, (udtrykt fra pET17b-P22), DT385 (udtrykt fra pET17b- DT385), DT385-P22 (udtrykt fra pLIC-DT385-p22), (se materialer og metoder) eller en tilsvarende volumen af ​​PBS (kontrol) blev inkuberet med (A) BPAEC, (B) Hela og HT1080-celler, og (C ) HUVEC og HDMEC celler i vækstmedier i tre dage. Efter tre dages inkubation blev antallet af levedygtige celler kvantificeret ved MTS-assayet. PBS vehikelkontrol blev betragtet som 100% levedygtige. Resultater er udtrykt i procent af PBS-behandlede celler. Resultaterne er middelværdien ± S.D. af 3 uafhængige forsøg udført i tre eksemplarer (n = 9).

Da det rekombinante p22 var inaktive mens DT385-p22 bibeholdt aktivitet, var det uklart, ud fra disse resultater, hvis p22 kunne have bevaret aktivitet udtrykt som fusionsproteinet, DT385-p22. I betragtning af specificiteten af ​​plasminogen-afledt p22 til endotelceller, forventede vi, at hvis p22 komponent af DT385-P22-fusionsproteinet, så DT385-p22 bør kun målrette endotelceller og ikke cancerceller, som er blevet påvist for plasminogen-afledt p22 [27]. Vi har derfor testet den cytotoksiske aktivitet af DT385-p22 og DT385 med kræft cellelinjer. Til disse eksperimenter vi oprindeligt testet to almindeligt anvendte humane cancercellelinier, den HT1080 fibrosarcoma celle og HeLa cervical carcinoma celle. Uventet fandt vi, at DT385 forårsagede en dramatisk nedgang i cellelevedygtighed af cancercellelinier på en dosis-afhængig måde (figur 1B). Ved den højeste testede dosis (2,4 uM), 10% af levedygtige Hela-celler forblev, mens omkring 50% af levedygtige HT1080 celler forblev. DT385-p22 nåede også forårsage et tab i cellelevedygtighed, men var mindre potent end DT385. For at afgøre om levedygtigheden af ​​humane endotelceller var påvirket af DT385-p22, vi inkuberes HUVEC og HDMEC med disse proteiner (figur 1C). Overraskende blev levedygtigheden af ​​begge cellelinier ikke påvirket af DT385, D385-p22 eller p22 ved koncentrationen op til 2,5 uM. Vi udvidede inkubationstiden til 7 dage med 2,4 uM af disse rekombinante proteiner, og intet tab af cellelevedygtighed blev observeret (fig S1, A). Men med meget høje koncentrationer af DT385, tab af levedygtighed HUVEC og HDMEC blev observeret (fig S1, B). Vi bestemt en IC

50 på omkring 5,77 og 7,54 uM DT385 for HUVEC og HDMEC hhv. Disse resultater tydede på, at den cytotoksiske aktivitet af DT385-p22 skyldtes aktiviteten af ​​DT385-domænet af fusionsproteinet og ikke den p22-domænet. Vi konkluderede også, at DT385 kan dræbe humane cancerceller i en koncentration der ikke påvirker primære endotel cellelinjer. Den iagttagelse, at DT385 havde cytotoksisk aktivitet var hidtil ukendt og uventet. Vi undersøgte derfor muligheden for, at DT385 kan dræbe andre kræftceller.

cytotoksiske virkninger af DT385 på cancer cellelinjer

Vi har udvidet cytotoksicitetsassayet til 18 menneskelige kræftceller (tabel 1). Femten cancercellelinier var påvirket af DT385 og effekten af ​​DT385 varierede blandt kræftcellerne. Kræft cellelinjer med højeste følsomhed til DT385 (IC

50 mindre end 0,5 uM DT385), inkluderet U-87 MG, U251, 293T, HEK293, Hela og Calu-3 celler. Gruppen med mellemliggende følsomhed til DT385 (IC

50 mellem 0,5-1,5 uM) inkluderet Colo201, Colo205, LNCaP, PC-3, HT1080, og MDA-MB-231-celler. Svagt følsomme cancer cellelinjer med IC

50 større end 1,5 uM inkluderet MCF7, HCT116, BT-20, NB4, HL-60, og HEp3 celler. I modsætning hertil rekombinant p22 havde ingen virkning på cellelevedygtighed ved koncentrationer så høje som 2,4 uM (data ikke vist). De tre menneskelige kræftceller ikke er berørt af DT385 på højeste testede (2,4 uM) dosis var de promyelocytleukæmi cellelinier (HL-60 og NB4) og epidemoid carcinom cellelinje (HEp3).

DT385 medieret tab i cellelevedygtighed blev også bekræftet under anvendelse af krystalviolet-farvning (figur 2). For eksempel mindre end 10% af gliom U-87 MG-celler tilbage efter DT385 behandling. For at bekræfte tværs af arterne følsomhed til DT385, testede vi musehud melanom (B16-F10), Lewis lungecarcinom (LLC) og muse embryonale fibroblast (MEF) celler. Mens B16-F10 og MEF var meget følsomme over for DT385, LLC var kun svagt sensitiv (tabel 1). Sammen data fra MTS assays og Crystal Violet farvning indikerer, at de “receptorless” DT, DT385, kan faktisk være cytotoksisk for mange tumorcellelinier. Den molekylære mekanisme, der tegner sig for den brede vifte i følsomhed til DT385 er i øjeblikket under efterforskning.

Forskellige cancer cellelinjer blev dyrket med 2 uM DT385 eller rekombinant P22 (RP22) i 3 dage. Cellerne blev derefter farvet med krystalviolet som beskrevet i Materialer og metoder og billeder blev opnået ved 25 × forstørrelse med en Zeiss Axiover 200 inverteret mikroskop (Carl Zeiss, Tyskland).

cytotoksiske virkninger af DT385 på anden primære cellelinjer

for at vurdere cytotoksicitet DT385 på andre primære cellelinjer, primære kulturer af tre humane fibroblast cellelinier (CCD-1064Sk, BJ, og IMR-90) og en monocyt (SC) cellelinje var inkuberet med stigende koncentrationer af DT385 og cellelevedygtigheden blev bestemt ved MTS-assayet. CCD-1064Sk og BJ fibroblaster havde en IC

50 af 2,22 uM og 2,37 uM DT385 hhv. De lungefibroblaster (IMR-90) havde en IC

50 af 1,44 uM og levedygtighed monocytter (SC) var upåvirket af DT385 i koncentrationer op til 2,4 uM (tabel 1). Igen, rekombinant P22 havde ingen virkning på cellelevedygtighed ved koncentrationer op til 2,4 uM (data ikke vist). I modsætning hertil, når sammenflydende CCD-1064Sk, BJ og IMR-90 fibroblaster blev behandlet i 3 dage med 2 pM DT385, observerede vi ingen signifikant tab af cellelevedygtighed (figur S2). Disse data indikerer, at selv når DT385 er effektive til at reducere levedygtigheden af ​​prolifererende primære celler, mislykkes at dræbe disse celler, når de er i hvile /sammenflydende. Tilsammen understøtter disse data vores tidligere konklusion, at DT385 alene har potentialet til at dræbe kræftceller med minimale virkninger på primære celler.

For at bestemme om modstanden mod DT385 kunne overvindes ved kontinuerlig inkubation celler med svag eller ingen påviselig følsomhed modtog en anden dosis, 48 ​​timer efter den første behandling og cellelevedygtighed blev målt 2 dage senere. Den humane epidermoide carcinom cellelinie HEp3 og brystkræft cellelinien MDA-MB-231 udviste begge forøget følsomhed med kontinuerlig inkubation med DT385. I forhold til en enkelt anvendelse af DT385, som ikke påvirker HEp3 celler markant, to anvendelser af DT385 faldt cellens levedygtighed (IC

50 af 2,07 uM (Figur S3). Tilsvarende IC

50 for brystkræft cellelinje, MDA-MB-231 faldt fra 1,02 pM til 0,66 pM ved en anden inkubation med DT385 (tabel 1). I modsætning hertil en anden inkubation med DT385 var uden virkning for de primære endotelceller, HUVEC eller HDMEC (fig S3) . tilsammen viser resultaterne, at receptorless DT i form af DT385 er cytotoksisk over for en lang række tumorceller. Mens følsomhed for DT385 varierer kontinuert eksponering mindsker levedygtigheden af ​​selv de mest resistente cancercellelinjer.

virkningsmekanisme af DT385

DT dræber celler ved en mekanisme, der involverer cellulær apoptose. Vi observerede også øget apoptose i DT385 behandlede celler (figur 3). Den inkubation af dyrkede U-87 med DT385 resulterede i en dramatisk stigning i cellulær apoptose som målt ved en stigning i annexin V-farvning (85%) og optagelsen af ​​ethidiumhomodimer (87%).

(A), U-87 MG-celler vokser i en 8- brønd kammer objektglas blev behandlet med 1,2 pM DT385, eller kontrol (PBS) henholdsvis i 3 dage. Efter behandlinger blev celler farvet for apoptose med FITC-mærket annexin V. cellemembranintegritet blev evalueret med ethidium homodimer III (ETD-III). Repræsentative billeder (100 × forstørrelser) er vist.

pil

indikerer celler, der var mærket med begge fluorescerende farvestoffer. (B), Grafisk fremstilling af (A). Celleantallet pr høj effekt felt (HPF, × 400) var gennemsnittet af celleantallet opnået fra 5 tilfældige HPF. Løsnede celler, som blev farvet med både annexin V og ETD-III positive, blev også medtaget i celletallet bestemmelse. Resultaterne er middelværdien ± S.D. af 3 eksperimenter.

DT er blevet vist at indtaste toksin-sensitive pattedyrceller ved receptormedieret endocytose, som involverer interaktionen af ​​receptor-bindende domæne af proteinet med dets ekstracellulære receptor. Da DT385 ikke har et receptorbindende domæne, bør det være i stand til at binde til celler og blive internaliseret. At undersøge om DT385 blev internaliseret, der spores vi fluorescensmærket DT385 med konfokal mikroskopi. Tumorceller følsomme over for DT385 blev inkuberet med FITC-DT385 og filmede med konfokal mikroskopi. Som vist i figur 4A, inkubering af celler med DT385 resulterede i internaliseringen af ​​toksinet, som var påviselig i perinukleære vesikler. I modsætning hertil inkubering af celler med lignende koncentrationer af FITC-okseserumalbumin ikke resultere i internalisering af proteinet (fig S4). Dette forsøg antydede, at optagelsen af ​​DT385 af celler ikke skyldtes ikke-specifik cellulær optagelse af proteinet.

(A), Cancer celler blev dyrket i en 8-brønds kammer slide. FITC-mærket DT385 (1 uM) blev tilsat til kulturen. Cellerne blev observeret og fotograferet under et Zeiss LSM 510 fluorescens konfokalt mikroskop (Carl Zeiss, Tyskland) efter 36 timer. Top og højre side af billeder viser den ortogonale visning af det konfokale datasæt vist i x- og y-aksen af ​​billeder. Forstørrelser er angivet nedenfor billeder. (B), blev U87-celler inkuberet med 2 pM DT385 alene eller i kombination med 10 mM NH

4CL i de angivne tidsrum. Medierne blev derefter udskiftet, og cellerne blev dyrket i en tid på 36 timer, hvorefter cellelevedygtigheden blev adgang til med MTS-assayet. PBS vehikelkontrol blev betragtet som 100% levedygtige. Resultater er udtrykt i procent af PBS-behandlede celler. De viste resultater er repræsentative for 2 uafhængige eksperimenter udført i triplikat.

Ammoniumchlorid er en svag base, der diffunderer ind i endosomet og fungerer som en proton reservoir, hvilket forhindrer forsuring af endosomet. Vi udnyttede ammoniumchlorid behandling af celler for at undersøge, om DT385 indtastet i cellen ved endocytose. Vi observerede, inkubation af U87-celler med DT385 for så lidt som 2 time resulterede i signifikant celledød (figur 4B). Men samtidig tilsætning af ammoniumchlorid og DT385 ophævet den cytotoksiske aktivitet af DT385. Den observation, at ammoniumchlorid blokeres den cytotoksiske aktivitet af DT385 antyder, at DT-385 trænger ind i celler via en sur endocytiske proces.

Difteritoxin dræber celler ved at katalysere ADP-ribosylering af EF-2, hvilket fører til hæmning af protein syntese [5], [28]. For at undersøge, om DT385 faldt cellelevedygtigheden ved at hæmme proteinsyntesen blev gliom U-87 MG-celler behandlet med 1 pM DT385 i 36 timer efterfulgt af mærkning med [

35S-] methionin i 15 minutter. Som vist i figur 5A, SDS-PAGE-analyse af cellelysatet viste, at proteinsyntese stærkt reduceret i DT385 behandlede celler. Denne inhibering forekom inden for 24 timer efter behandling og fortsatte i løbet af assayet (48 timer) (figur 5B). Den 36-h behandling gav det største fald i protein mærkning. Disse data tyder på, at mekanistisk, DT385 nedsætter cellernes levedygtighed ved at blokere proteinsyntesen. Lignende resultater blev opnået for Hela-celler (data ikke vist).

(A), blev U-87 MG-celler behandlet med 1 uM DT385 eller kontrol (enten RP22, SUMO eller PBS) i 24, 36 timer og 48 timer henholdsvis og derefter mærket med [

35S-] methionin i 15 minutter. Cellelysater (10 ug) blev separeret ved SDS-PAGE (12% gel) og geler blev farvet med Coomassie blue (venstre), tørret på Whatman papir og visualiseret ved radiografi under anvendelse af en phosphorimager (højre). Repræsentative billeder for 36 h behandling er vist. (B) Kvantificering af (A). Radioaktivitet af cellelysater blev bestemt ved væskescintillationstælling. Data er udtrykt som procent af kontrol. Gennemsnittet af CPM fra irrelevant protein, RP22 eller rekombinant SUMO eller PBS-behandling blev anset som kontrol CPM-værdi. Resultaterne er middelværdien ± S.D. (N = 6, 2 uafhængige eksperimenter). Cellernes levedygtighed blev også målt som beskrevet i teksten til figur 1. Resultaterne er den gennemsnitlige ± standardafvigelse af tre uafhængige forsøg udført tredobbelt.

Chick chorioallantois membranassay

progression og metastase af neoplastisk sygdom kræver omfattende vaskularisering af tumoren til at opretholde de ernæringsmæssige og ilt krav til prolifererende cancerceller. Dette opnås generelt gennem en proces kaldet angiogenese [29]. Kyllingechorioallantoinmembranen assay (CAM) er et nyttigt

in vivo

modelsystem til at undersøge virkningerne af toksiner på angiogenese. Som vist i figur 6A, DT385 ved en koncentration på 40 nM (1,2 pmol i 30 pi) forårsagede fuldstændig inhibering af HEp3-induceret (angiogen) vaskulær spiring. Denne koncentration er langt under IC

50 af tumorcellerne og derfor er usandsynligt en direkte effekt af DT385 på HEp3 levedygtighed.

(A), blev HEp3 celler anvendes til at stimulere angiogenese på CAM’en. PBS-kontrol uden HEp3 celler indikerede baseline niveau af angiogenese. Angiogenese, i nærvær af HEp3 celler og i fravær eller nærvær af rekombinant DT385 eller rekombinant kontrolprotein (SUMO) blev analyseret. Resultaterne er middelværdien ± S.E. 80 datapunkter fra to replikat analyser * p 0,05 (Student t test). (B), DT385 signifikant nedsat tumorvækst. Hep3 tumorvækst i CAM-systemet blev vurderet som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultaterne er middelværdien ± S.E. Middelværdierne for tumorer til DT385 eller kontrol behandlinger var 13,88 ± 1,56 mg (middelværdi ± S.E. .; n = 23) og 23.33 ± 4,3 mg, (middelværdi ± S.E. .; n = 12), p = 0,012. (C), DT385 signifikant nedsat tumorvolumen. Hep3 tumorvolumen i CAM-systemet blev vurderet som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultaterne er middelværdien ± S.E. Middelværdierne for tumorstørrelse for DT385 eller kontrol behandlinger var 8,86 × 10

9 ± 2,42 um

3 (gennemsnit ± SE n = 18) og 2,97 × 10

9 ± 0,49 um

3 (gennemsnit ± SE n = 8). henholdsvis p = 0,02

for at undersøge om DT385 kan reducere tumorvækst, HEp3 tumorer blev dyrket på CAM og 6 dage gamle tumorer blev derefter behandlet med 2 ug DT385 injiceret intravenøst ​​dagligt i tre dage.