PLoS ONE: Kvantificering af Normal Cell Fraktion og Copy Number Neutral LOH i kliniske Lung Cancer Prøver Brug SNP Array data

Abstrakt

Baggrund

Teknologier baseret på mikromatrice har potentialet til at give detaljerede oplysninger om genomiske afvigelser i tumorceller. I praksis en væsentlig hindring for kvantitativ påvisning af aberrationer er heterogenitet af kliniske tumorvæv. Da tumorvæv uvægerligt indeholder genetisk normale stromale celler, kan det føre til en manglende evne til at detektere afvigelser i tumorcellerne.

Principal Finde

Brug SNP-array data fra 44 ikke-småcellet lungekræft prøver har vi udviklet et bioinformatik algoritme, der præcist modeller de fraktioner af normale og tumorceller i kliniske tumorprøver. Andelen af ​​normale celler i kombination med SNP-array data kan anvendes til at påvise og kvantificere kopital neutralt tab af heterozygositet (CNNLOH) i tumorcellerne både i rå tumorvæv og i prøver beriget for tumorceller ved hjælp af laser capture mikrodissektion.

Konklusion

genom-bred kvantitativ analyse af CNNLOH bruge CNNLOH kvantor metode kan hjælpe med at identificere tilbagevendende afvigelser, der bidrager til tumor udvikling i kliniske tumorprøver. Derudover kan SNP-matrix analyse af CNNLOH blevet vigtig for detektering af afvigelser, som kan anvendes til diagnostiske og prognostiske formål

Henvisning:. Göransson H, Edlund K, Rydåker M, Rasmussen M, Winquist J, Ekman S, et al. (2009) Kvantificering af Normal Cell Fraktion og Copy Number Neutral LOH i kliniske Lung Cancer Prøver Brug SNP Array data. PLoS ONE 4 (6): e6057. doi: 10,1371 /journal.pone.0006057

Redaktør: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland

Modtaget: Februar 18, 2009; Accepteret: 5 jun 2009; Udgivet: 26 juni 2009

Copyright: © 2009 Göransson et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse var en del af en åben forskningssamarbejde støttet og delvist finansieret af AstraZeneca, Alderley Park, Storbritannien. Arbejdet blev også støttet af Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet og Farmaci (Uppsala Universitet), Uppsala Universitet Hopsital, Akademiska Laboratory, Beijer fundament, Wallenberg Consortium Nord og Swegene. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og analyse, og heller ikke i beslutningen om at offentliggøre manuskriptet. Andrew P. Thomas, der er seniorforsker på AstraZeneca deltog i revisionen af ​​den intellektuelle indhold

Konkurrerende interesser:. Det medforfatter Andrew P. Thomas er ansat af AstraZeneca. Anders Isaksson og Andrew P. Thomas holder lager i Astra Zeneca.

Introduktion

Bioinformatik algoritmer er blevet udviklet til at bruge SNP-array oplysninger til at identificere genomiske afvigelser såsom DNA kopital ændringer og tab af -heterozygosity (LOH), dvs. strækninger af DNA med udelukkende homozygote markører [1] – [8]. , En stor ulempe ved disse fremgangsmåder er imidlertid, at genetisk heterogenitet i tumorprøver, forårsaget af blandingen af ​​cancer og stromaceller, er ofte ikke taget i betragtning. Som en konsekvens aberrationer ofte ikke detekteret i prøver med en stor andel af genetisk normale celler. Dette kan til dels forklare, hvorfor, på trods af ophobning af store mængder genomiske data, den kliniske effekt af sådanne analyser til diagnostiske formål er stadig lille. Tumorvæv repræsenterer en blanding af tumor- og ikke-tumorceller, dvs. inflammatoriske celler, stromale fibroblaster og celler af blod- og lymfekar [9]. Fraktionen af ​​normale celler ofte overstiger den del af tumorceller i patientprøver lagret i biobanker (figur 1A). Denne prøve heterogenitet alvorligt påvirker kopiantals analyse. Så vidt vi ved er der ingen skøn om, hvordan følsomheden af ​​påvisning af genomiske afvigelser afhænger af andelen af ​​normale celler i kliniske tumorprøver. En årsag kan være vanskeligheden ved at estimere tumor vs. normal celle-forhold histologisk ved mikroskopi i heterogene tumorprøver med varierende andele af normale celler i forskellige dele af prøven. Desuden er der er en mangel på konsensus om, hvordan tumorceller indhold i en solid cancer bør vurderes og kommenteret. Således udførelsen af ​​de nuværende værktøjer til påvisning af genomiske afvigelser i kliniske tumorprøver er ofte usikker.

A) Hematoxylin-eosin farves frosne sektion af en repræsentativ NSCLC tilfælde analyseret i denne undersøgelse (original forstørrelse 40 ×) . Tumorprøven er sammensat af en blanding af tumorceller hvid pil, stroma med et blodkar sort pil, inflammatoriske celler, dvs. lymfocytter røde pil, og en tilbageværende lunge alveole fyldt med makrofager grøn pil. B) Sletning LOH. Normale celler er angivet med oval celleform. Den slettede region i tumorceller (rektangulære celle form) er angivet med hvide cirkler. Skematisk kromosompar med kun informative markører A for den sorte og B for den røde chromosme. Under hvert kromosom er indiceret genotypen i området af deletionen. Celler med forskellig kopi nummer genotyper er mærket N

normal, T

2 N, T

1N, og T

0N. N indikerer, at cellen er normalt og T, at det sis en tumorcelle. Indekserne for tumorcellerne indikerer DNA-indholdet i regionen med sletningen. Da disse er alle de celletyper i prøven proportionerne opsummere til én. C) Kopier neutral LOH. I dette tilfælde tumorcellerne har alle 2N DNA-indhold. Men nogle tumorceller er homozygote (i dette tilfælde BB) for regionen af ​​interesse (T

hom) og den anden type er heterozygot AB (T

het). Summen af ​​fraktioner af cellerne er lig én.

En nyligt udviklet værktøj tager prøve heterogenitet i betragtning til identifikation af kopi nummer stater [10]. Det er designet til undersøgelser med parrede prøver (tumor og normal). Men i praksis, parrede prøver ofte ikke tilgængelige for større kohorter patientgrupper.

I en anden undersøgelse Nancarrow et al visualisere det forventede mønster af allelfrekvenserne afhængigt varierende andele af normale celler i tumoren prøve under anvendelse simuleringer [11 ].

en anden lovende analytisk redskab, AsCNAR, er i stand til at identificere LOH selv når en af ​​to blandede cellelinjer kun er til stede i en andel på ca. 20% [12]. For nylig Assie et al beskrev en algoritme, der tager tumor heterogenitet i betragtning at identificere genomiske afvigelser i prøver med 40-75% af tumorceller [13].

Undersøgelser tyder på, at kopi nummer neutral LOH kan være en mekanisme til inaktivering af tumorsuppressorgener [14]. Flere undersøgelser og vores egne data antyder, at CNNLOH er mere udbredt end hidtil antaget [15], [16]. Tilsammen tyder det CNNLOH kan være vigtige ved bestemmelse visse cancerformer fænotyper. At analysere CNNLOH på en genom-plan i tumorcellerne i heterogene prøver vi fokuseret på 1) at udvikle en algoritme til at kvantificere andelen af ​​normale celler i prøven og 2) at kvantificere CNNLOH hele genomet i tumorcellerne. En sådan kvantitativ analyse har potentiale til at blive et vigtigt redskab for molekylær kræftdiagnostik.

Resultater

En strategi for kvantificering af CNNLOH i heterogene tumorprøver

For at kvantificere CNNLOH i heterogene tumorprøver den allelspecifikke signal bidrag fra forskellige typer af celler skal estimeres. Figur 1 illustrerer en typisk blanding af celler i frosne snit af en ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tumor prøven og giver en skematisk fremstilling af de forskellige typer af celler og genotyper, der kunne være til stede i tilfælde af en genomisk deletion eller CNNLOH. Andre genomiske afvigelser, herunder dem, der giver anledning til højere ploidi afvigelser, kan også forekomme på samme locus som sletning eller CNNLOH, yderligere komplicerer billedet. Dog kan det forventes, at sandsynligheden for sådanne hændelser til at være lav, og i denne undersøgelse de er blevet antages at være ubetydelig i forhold til virkningerne af sletninger og CNNLOH.

Den fraktion af normale celler kan for nogle typer af tumorer måles på en ligefrem måde. I hæmatologiske tumorer den del af normale celler kan måles ved anvendelse af flowcytometri, der anvender informative overflademarkører. Imidlertid enkeltcellesuspensioner til flowcytometri er vanskelige at få fra faste tumorer. Alternativt kan automatiserede eller manuelle måde at identificere normale celler ved at tælle dem

in situ

baseret på molekylære markører eller morfologi anvendes. Disse metoder kræver avanceret billedbehandling teknikker eller tidskrævende arbejde for en uddannet histopatolog. I dette papir bruger vi signalintensiteter fra de to SNP alleler at estimere den del af normale celler og bruge disse oplysninger til at vurdere andelen af ​​tumorceller med CNNLOH.

Kvantificering af andelen af ​​normale celler fra SNP genotypning array-data

i prøver, hvor det er vanskeligt at opnå på anden andelen af ​​normale celler, vi satte os for at estimere den del af normale celler fra SNP data kun. Som vist i fig. 1B fraktionen af ​​celler med 2N DNA (C

2 N) i områder med deletioner er summen af ​​de normale celler (N

normal) og tumorcellerne med 2N DNA (T

2 N). Grundlaget for CNNLOH kvantifikator metode er at bruge den allelspecifikke signaler A og B for hvert locus at opnå den eksperimentelle Allel B frekvens (ABF), som et normaliseret forhold mellem B /(A + B) Se metoderne. En afledning og en grafisk illustration er tilgængelige andre steder [17]. De ABfs af heterozygote informative markører i komplekse tumorprøver afhænger af antal kopier og cellulære sammensætning af prøven. I et første skridt, vi satte os for at identificere den andel af C

2N celler ved at sammenligne de eksperimentelle ABfs i et vindue på hinanden følgende SNPs i regioner med mono-allele sletninger med simulerede data. Simuleringerne tager faktorer i betragtning såsom gennemsnitlig heterozygositet, tumorcelle kopiantal, eksperimentel variation og sammensætningen af ​​diploide celler og tumorceller. Figur 2 illustrerer, hvordan histogrammer af observerede ABfs sammenlignes med simulerede histogrammer med varierende fraktioner af C

2N hjælp af euklidiske afstand. Histogrammet med den mindste afstand til den observerede histogram identificerer tilsvarende C

2N (se fig. 2 og fremgangsmåder).

To eksempler på observerede ABF-værdier langs kromosomer. Vinduer med mindst 140 consequtive SNP markører anvendes til at indsamle allel-specifik information langs kromosomet. ABF-værdier i hvert vindue er illustreret som en observeret histogram. I det næste trin den observerede histogram sammenlignes med hundredevis af simulerede histogrammer, hvor den del af heterozygote celler er blevet varieret. Den simulerede histogram med den korteste euklidiske afstand til den observerede histogram identificerer den mest sandsynlige andel af heterozygote celler i prøven (X%). Sammenligningen af ​​histogrammer anvendes både til estimering af andelen af ​​diploide celler (C

2 N) i områder, hvor tumorceller har sletninger og andelen af ​​heterozygote celler (C

het) i genomiske regioner med 2N tumorceller. C

2 N og C

het efterfølgende bruge til estimering af den del af normale celler og kvantificering af CNNLOH.

N

normal ikke opnås direkte fra skøn over C

2 N. Men da der kan forventes de normale celler til at have to af hver autosom forventes, deres bidrag til ABF at være lige stor for alle autosomer, mens den supplerende bidrag på T

2N celler kan variere med tumoren heterogenitet for hvert kromosom . Således i prøver, hvori der påvises kopi nummer tab på flere kromosomer den laveste estimat af C

2 N for et kromosom har den mindste bidrag fra 2N tumorceller. I mange tilfælde, hvor sletningen har forårsaget en spredning fordel bidraget til den mindste C

2 N fra 2N tumorceller vil med tiden være tæt på nul. Derfor vil der i de tilfælde, hvor oplysninger fra flere kromosomer er tilgængelig, kan det være berettiget at estimere N

normale som den mindste C

2 N.

Validering af SNP-array baserede skøn sammenlignet med manuel optælling af normale celler

Vi anvendte metoden til 60 ikke-småcellet lungekræft prøver (se metode). Fyrre-fire ud af tres prøver (73%) mødte de vilkårlige kriterier, at mindst to regioner på to forskellige kromosomer varierede ikke mere end 5% i deres C

2N skøn, og der kunne bruges til at give et skøn over N

normal (se metoder). Kriterierne er blevet indstillet til at tage hensyn til den mulige virkning af konstitutive allele mønstre ligner CNNLOH. De fleste af de 16 tilfælde, hvor kunne opnås nogen skøn ikke havde to sletninger.

For at validere skøn over den normale cellefraktion baseret på SNP data, en tilfældig delmængde af de 60 NSCLC prøverne var udvalgt til omhyggelig og omfattende mikroskopisk tælling af normale og tumorceller i frosne snit (se metoder). Syv ud af disse tilfælde overlappede med de 44 sager, hvor N

normal kunne estimeres, Tabel 1 viser skøn over den del af normale celler opnået ved hjælp af SNP-array data og manuel optælling baseret på morfologi for disse prøver. Der er god overensstemmelse mellem resultaterne opnået ved de to metoder, hvilket indikerer, at SNP baserede metode giver præcise oplysninger om den del af normale celler i tumor prøver.

Kvantificering af kopi nummer neutral LOH i lunge cancer prøver

det er nødvendigt at kvantificere den del af normale celler til stede i en tumor prøve før information fra SNP array analyse kan anvendes til at estimere den del af tumorceller med 2N DNA, som har LOH, dvs. CNNLOH. CNNLOH = T

hom /(T

hom + T

het). (Se fig. 1B). I dette tilfælde er det den heterozygote tumorceller T

het, der sammen med de normale celler vil ændre Allel B hyppigheden af ​​de homozygote tumorceller med LOH. For CNNLOH allel B hyppigheden af ​​de informative markører afhænger af de heterozygote celler C

het. Simulerede histogrammer under varierende fraktioner af heterozygote celler i betragtning blev sammenlignet med histogrammer baseret på ABF-værdier fra en kørende vindue med et fast antal markører (se fig. 2 og fremgangsmåder). Den simulerede histogram mest ligner den observerede histogram, identificerede den tilsvarende del af heterozygote celler, C

het. Hvis den del af normale celler N

normal er kendt, kan CNNLOH beregnes, da 1 = N

normal + T

hom + T

het. For at demonstrere værdien af ​​CNNLOH kvantor metode vi anvendte det til et sæt af NSCLC prøver (se metoder). Genom-dækkende kvantitative målinger af CNNLOH er vist i fig. 3. Det skal bemærkes, at der er tilbagevendende regioner med en høj grad af kopital neutral LOH. Et eksempel på kromosom 11 er vist i fig. 3. Det fremtidige arbejde vil være fokuseret på at belyse betydningen af ​​kopi nummer neutral LOH i sådanne områder for tumor udvikling. Til sammenligning CNNLOH blev også analyseret i 60 normale referenceprøver (se fig. S1).

A) Kvantitative oplysninger om tumor LOH spænder fra sort 0% til rød 100% for de 22 autosomer sig for 43 ikke-småcellet lung cancer prøver hver repræsenterer én række. Udeladelser markeres med grønt og opformeringer i blåt. Regioner, hvor mere end 10% af prøverne i en normal henvisning sæt havde CNNLOH højere end 0,5 blev fjernet fra grunden (se metoder). Sort pil viser et eksempel på et område på kromosom 11 med en højere frekvens af kopi nummer neutral LOH (52%) end den maksimale frekvens på 10% i den normale henvisning sæt

Kvantificering af CNNLOH. – sammenligning mellem FISH og SNP data

for at studere nøjagtigheden af ​​kvantificeringen af ​​CNNLOH vi ønskede at sammenligne resultaterne til dem, der opnås med en uafhængig metode. Gunnarsson et al har målt tilstedeværelsen af ​​små deletioner på 13q14 i tumorcellepræparater fra patienter med kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) ved anvendelse af fluorescens in situ hybridisering (FISH) [18]. I to tilfælde havde tumorceller erhvervet to kopier af kromosom 13 med en intern 13q14 sletning. Således i disse tilfælde er andelen af ​​CLL celler med nul og én FISH signal repræsentere homozygote og heterozygote tumorceller hhv. Et skøn over CNNLOH på kromosom 13 uden for det slettede region på 13q14 kan fås som andelen af ​​celler med nul signal på 13q14 divideret med summen af ​​proportioner med nul og ét signal. På grund af for få regioner med deletioner kunne ikke opnås andelen af ​​normale celler fra SNP data. I stedet flowcytometri data fra Gunnarsson et al 2008 forudsat disse oplysninger. Således blev andelen af ​​normale celler fra flowcytometri og SNP array-data for de to prøver anvendes til at kvantificere CNNLOH. Tabel 2 viser skøn over CNNLOH opnået ved de to metoder. Det kan bemærkes, at estimaterne kun afviger med 4 og 6% i de to prøver, hvilket indikerer, at målingen af ​​CNNLOH er korrekte.

Kvantificering af CNNLOH er robust over for variationer i prøve renhed

Et vigtigt krav til kvantificering af CNNLOH er, at metoden bør være robust og ikke påvirket af den del af normale celler i prøven. For at teste effektiviteten af ​​algoritmen varierede vi den del af normale celler i en tumor prøve ved at berige for tumorceller. I fem tilfælde var 6 000-10 000 tumorceller valgt ved hjælp af laser mikrodissektion (se metoder). Standard Affymetrix SNP-array analyse blev udført på DNA fra disse tumor-berigede præparater. Fraktionen af ​​normale celler og tumorceller LOH for kopiantal neutrale regioner blev kvantificeret, og resultaterne blev sammenlignet med resultaterne fra rå tumorprøver (fig. 4). Målingerne af CNNLOH i de rå prøver synes at være meget i overensstemmelse med dem i Mikrodissekterede prøver. For at kvantificere udførelsen af ​​CNNLOH detektion valgte vi at tælle antallet af kromosomale segmenter i fig. 4, der havde tumor LOH højere end et vilkårligt sat tærskel, i dette tilfælde 0,5 i begge prøver. Denne procedure giver et groft skøn over evnen til at påvise CNNLOH. Tabel 3 viser forholdet mellem antallet af segmenter, der blev detekteret i mikrodissekeret prøve i forhold til hele prøven. Forholdet er tæt på en for alle prøver viste, at ca. samme antal segmenter detekteres uanset brøkdel af normale celler, der varierede mellem 1% og 26%. Det kan hævdes, at den del af normale celler er så lav, at det er vanskeligt at observere nogen forskel mellem de par af prøverne. Men studerer robustheden af ​​kopi nummer afsløring kan det bemærkes, at der i tre par prøver (13A, 296A og 319A) var der en dramatisk reduktion (op til 122 gange) i antallet af segmenter detekteret som bærende kopi nummer afvigelser i hele prøven (se tabel 3.). Sammenfattende analyse af CNNLOH synes at være robust, mens kopital detektering kan være meget stærkt påvirket selv af en del af normale celler i området fra 1-26%, hvilket er beskedne for mange typer kliniske tumorprøver.

Fem tumorprøver 13A, 234A, 296A, 319A og 367A blev analyseret for tumor LOH hjælp både DNA fra friske frosne snit af hele tumor og fra laser mikrodissekeres dele af tumor sektioner med beriget tumor indhold. Graden af ​​tumor LOH er indiceret til 200 kb chromosmal segmenter i farve spænder fra sort (0%) til mørkerød (100%) langs de 22 autosomer. Segmenter med kopital aberrationer er angivet med deletioner (grøn) og amplificeringer (blå). Bemærk i en udvidet del af kromosom 7, at CNNLOH målingerne approxiamately lige i par hele og mikrodissekeret tumorprøver.

Ydelse af CNNLOH detektion på simulerede data for blandinger af normal og tumor celler

CNNLOH kvantor metode præsenteres her kan identificere CNNLOH og kvantificere den del af tumorceller, der har CNNLOH. Fremgangsmåden synes at være robust over for variationer i indhold tumorcellen i kliniske prøver. Det ville imidlertid også være interessant at sammenligne ydeevnen til andre metoder. Med henblik herpå SNP Array data blev opsamlet fra tumorceller i en mikrodissekeret lungekræft prøve og fra lungekræft væv uden af ​​tumoren fra den samme patient. Baseret på disse oplysninger simulerede vi data fra blandinger af normale og tumorceller. For at måle resultater med hensyn til sensitivitet og specificitet vi brugte LOH opdaget af parret analyse af tumor prøven og dens normale styring med dChip i kopi nummer 2-regioner som den gyldne standard, der definerede CNNLOH. Vi ønskede at sammenligne CNNLOH kvantor metoden til andre metoder også bruger allel-specifikke oplysninger. Disse metoder har vist sig at overgå genotype-baserede metoder [13]. AsCNAR er en sådan metode, men den for tiden tilgængelige gennemførelse er ikke fleksibel nok til at bruge på denne type simulerede data. På den anden side den SOMATICS metode er designet til data fra Illumina SNP platformen, men kunne være indrettet til at analysere simulerede data baseret på data fra Affymetrix platform. Derfor valgte vi at sammenligne ydeevne CNNLOH kvantor metoden med SOMATICS (se metoder for detaljer). Følsomhed og specificitet af metoderne til at variere blandinger af normale og tumorceller er vist i figur 5AB. Det kan bemærkes, at CNNLOH kvantor har en kraftig stigning i sensitivitet, over 40% tumorceller, der skyldes tærsklen til CNNLOH kald, der svarer til en brøkdel af 35% tumorceller. CNNLOH kvantifikator har en højere følsomhed på ca. 90% i forhold til 60% for SOMATICS for fraktioner af tumor større end ca. 50% (se fig. 5A). Specificitet er generelt højere for CNNLOH kvantifikator sammenlignet med SOMATICS (se fig. 5B). Følsomheden af ​​SOMATICS var lavere end hvad der tidligere er rapporteret for data baseret på SNP-array data fra Illumina-platformen [13]. Vi antager, at det SOMATICS algoritmen udfører forskelligt på data fra de to platforme. I Gunnarsson m.fl. samme DNA præparater fra CLL tumorer blev analyseret på både 250K arrays fra Affymetrix og 317K arrays fra Illumina [18]. Vi analyserede begge datasæt fra 9 CLL tumorer med SOMATICS og fandt, at den algoritme identificeret mere CNNLOH hjælp Affymetrix data. Forholdene mellem længden af ​​de detekterede CNNLOH regioner med Affymetrix data sammenlignet med Illumina data området fra 1.9 til 36 (se tabel S1). Disse yderligere regioner CNNLOH identificeret ved anvendelse Affymetrix dataene kan i vid udstrækning være falske positiver grundet det større eksperimentel støj. Et så stort antal falske positiver ville være i overensstemmelse med den lave følsomhed SOMATICS i detektion af CNNLOH i de simulerede data baseret på Affymetrix data (se fig. 5A).

data svarende til varierende fraktioner af normale og tumor celler blev simuleret ved hjælp af data fra normale celler og Mikrodissekterede tumorceller fra den samme lungekræft tumor. Udførelsen af ​​de to algoritmer blev evalueret som følsomhed (A) og specificitet (B) sammenlignet med CNNLOH opdaget af dChip i et parret analyse af SNP array-data for de normale og tumorceller.

Metoder

Etik erklæring

Denne undersøgelse blev foretaget i overensstemmelse med principperne i Helsinki-deklarationen og blev godkendt af den regionale etisk vurdering bord i Uppsala (referencenummer 2006/325). Behovet for at opnå individuel samtykke fra hver patient blev frafaldet af den etiske gennemgang bord, da de fleste af patienterne i undersøgelsen befolkning ( 90%) var afdøde ved starten af ​​projektet, har forskningsresultaterne ikke ensbetydende nogen medicinske risici , og resultaterne kunne ikke ændre oplysningerne til patienterne, deres familier eller forandringsledelse. Proceduren er i fuld overensstemmelse med den svenske Etiske Anmeldelse Act.

Tumor prøver, histologisk vurdering af tumor celle indhold og DNA forberedelse

Friske frosne menneskelige NSCLCs blev opnået fra Uppsala Frisk Tissue Biobank og anvendes i overensstemmelse med den svenske biobank lovgivning. De tumor prøver aura fra patienter fra en kohorte defineret ved, at de blev registreret i Uppsala /Örebro lungekræft registreringsdatabasen som havende NSCLC, havde en frossen vævsprøve i vævet bank og blev diagnosticeret, mens live. Case status blev bekræftet ved histopatologisk gennemgang og undersøgelse af medicinske journaler. Hematoxylin-eosin farvede kryosektioner (4 um) blev fremstillet ud fra de frosne OLT indlejrede tumor- vævsblokke og revideret mikroskopisk ved en kirurgisk patolog. Tres tilfælde med en anslået tumor celleindhold over 50% blev inkluderet i undersøgelsen. For en delmængde af disse prøver (tabel 1) udførte vi en omhyggelig manuel optælling af tumor og normale celler ved lysmikroskopi under anvendelse af gitre i stor forstørring felter (HPF). Mindst 2000 celler blev talt i 5-10 forskellige områder af den frosne sektion, afhængigt af størrelsen og heterogenitet tumorprøve. For hver prøve genomisk DNA blev ekstraheret fra 5-10 frosne vævssnit (10 uM) under anvendelse af QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) ifølge producentens protokol.

Laser Capture Microdissecion af prøver lungekræft

mikrodissektions blev udført som tidligere beskrevet med mindre modifikation [19]. Fra 5 lungekræft prøver, 12 um tykke kryosnit blev udarbejdet, overført til PALM membran-belagt objektglas, og opbevares ved -80 ° C. Umiddelbart før mikrodissektion blev snit optøet og farvet med hæmatoxylin i 2 minutter efterfulgt af fiksering i en zink fiksativ i 1 minut og dehydrering i 1 minut i 70% og 95% ethanol henholdsvis. Udnytte den PALM Laser-MicroBeam System, blev udvalgte tumor områder med 6000-10000 celler mikrodissekeres og overføres ved hjælp af en laser puls til 15 pi DNA-ekstraktion buffer ATL (Qiagen) i hatten på et mikrofugerør. DNA-ekstraktion blev derefter udført under anvendelse af QIAamp DNA Micro Kit ifølge producentens protokol (Qiagen).

Analyse på Affymetrix 250K SNP arrays

Array eksperimenter blev udført i henhold til standard protokoller for Affymetrix GeneChip ® Kortlægning 250K arrays (Gene Chip Mapping 500K Assay Manual (P /N 701.930 Rev2.), Affymetrix Inc., Santa Clara, CA). Kort beskrevet blev totalt genomisk DNA fordøjet med et restriktionsenzym (

Nsp1

), ligeret til en passende adapter til enzymet, og underkastet PCR-amplifikation under anvendelse af en enkelt primer. Efter fordøjelse med DNase I, blev PCR-produkterne mærkes med et biotinyleret nukleotid analog anvendelse af terminal deoxynukleotidyltransferase og hybridiseret til mikroarrayet. Hybridiserede prober blev fanget af streptavidin-phycoerythrin-konjugater og endelig arrays blev scannet. Kvalitetskontrol QC, genotype kald og kopiere nummer analyser blev foretaget i GeneChip® Genotypning Analysis Software Affymetrix (GTYPE) 4.1. Den dynamiske model (DM) algoritme blev anvendt til at udføre enkelt prøve QC. Den QC specifikation for 250K er en Call Rate 93% ved hjælp af algoritmen standardindstillinger. Efterfølgende kopi nummer analyse blev udført ved hjælp af en Skjult Markov Model rådighed i Copy Number Analysis Tool (CNAT) 4.0.1 med følgende parameterindstillinger: Transition forfald 5 Mb, Median normalisering og 0,3 Mb udjævning faktor. Henvisningen sæt anvendte bestod af 96 CEU prøver fra HapMap projektet (www.hapmap.org/downloads/raw_data/affy500k/).

Kvantificering af den del af normale celler

Som et første smarte genomiske regioner udledes at indeholde mono-allele deletioner blev identificeret ved hjælp af Affymetrix Software CNA 4.0.1 som beskrevet ovenfor. For at vurdere den del af celler med 2N genomisk indhold, C

2 N, blev anvendt allel-specifik information. Affymetrix SNP rådata blev normaliseret i softwaren dChipSNP hjælp af modelbaserede ekspression fremgangsmåde og en baggrund subtraktion metode, der bruger mismatch prober (PM /MM forskel) [6]. De normaliserede signaler blev derefter anvendt til at beregne allelisk forhold intensitet R

i for hver SNP (R

i = B /(A + B)). For at tage hensyn til, at det samme antal A- og B-alleler kan frembringe forskellige signaler i assayet de alleliske forhold blev normaliseret til allel B frekvenser (ABF) for en bestemt SNP-locus i en given prøve ved en lineær interpolation af de kendte allelfrekvenserne for de tre genotyper (0, 0,5 og 1,0), som er afledt og grafisk illustreret i Peiffer

et al

2006 [17]. Kort sagt ABF for en given SNP

jeg

blev beregnet som følger: hvor R

i er allel intensitet ratio og m

AA, AB, BB er den gennemsnitlige allele intensitet nøgletal for en reference befolkning for særlig SNP. Henvisningen sæt var den samme som beskrevet for kopiantal analyse ovenfor. Kun SNPs hvor en AB opkald var til stede i referencepopulationen blev brugt. For SNPs, hvor der ikke homozygote opkald forelå, blev den gennemsnitlige AA eller BB signal til alle SNPs i prøverne i referencepopulationen anvendes i stedet.

Et histogram af allel-specifik Allel B information frekvens for markørerne på hver autosom med kopi nummer tab blev beregnet. Den observerede histogram blev sammenlignet med simulerede histogrammer for varierende fraktioner af C

2N. C

2N af de mest lignende histogram er den ene mest sandsynligt har givet anledning til de observerede data (se fig. 2). Simuleringerne beskriver variationen i ABF grundet variation i signalerne fra A- og B-alleler ved at trække A- og B-signaler fra normalfordelinger anslået fra regioner med kopi nummer 2. middelværdi og varians for fordelingerne var (0, 0,015) for allelen A og (0,995, 0,015) for allelen B. Den gennemsnitlige grad af heterozygositet blev estimeret ud fra kopi nummer 2-regioner til 36,7%. Simulerede ABF-værdier blev beregnet som summen af ​​simulerede Allel B signaler divideret med summen af ​​allel A og B-signaler fra celler, der udgør den virtuelle prøve. For eksempel når der simulerer prøver med højere fraktioner af 2N celler, er andelen af ​​simulerede celler med både A- og B-signaler også steget. For at opretholde den gennemsnitlige grad af heterozygositet og at opnå stabile histogrammer de var baseret på ABF værdier fra ulige antal 14 848 simuleret SNP loci (se mere detaljeret beskrivelse af valg af indstillinger i Text S1). At vælge en anden tilstrækkeligt stort antal simulerede loci ville producere meget lignende histogrammer. Histogrammerne blev normaliseret til arealenhed at repræsentere det forventede mønster for hver af de 200 trin, der varierede den del af C

2N celler mellem 0 og 67%. Den mindste euklidiske afstand mellem den observerede histogram og histogrammerne med varierende C

2N identificeret fraktionen mest sandsynligt har givet anledning til den observerede Allel B frekvens mønster.