PLoS ONE: KRAS mutation en Predictor af Oxaliplatin Følsomhed i Colon Cancer Cells

Abstrakt

Molekylære biomarkører at bestemme effektiviteten af ​​målrettede behandlinger i kræftbehandlingen er blevet udbredt i kolorektal cancer (CRC), men dem at forudsige kemoterapi følsomhed forbliver dårligt defineret. Vi testede vores hypotese, at KRAS mutation kan være en forudsigelse af oxaliplatin følsomhed i CRC. KRAS var slået ned i KRAS-mutant CRC-celler (DLD-1

G13D og SW480

G12V) af små interfererende RNA (siRNA) og overudtrykt i KRAS-vildtype CRC celler (COLO320DM) af KRAS-mutant vektorer til generere parret CRC-celler. Disse parrede CRC-celler blev testet ved oxaliplatin, irinotecan og 5FU at bestemme ændringen i lægemiddelfølsomhed ved MTT-assay og flowcytometri. Årsager til sensitivitet ændring blev yderligere bestemt ved Western blot og real-time kvantitativ revers transkriptase polymerasekædereaktion (QRT -PCR). I KRAS-vildtype CRC celler (COLO320DM), KRAS overekspression af mutant vektorer forårsaget excision reparation cross-komplementering gruppe 1 (ERCC1) nedregulering i protein og mRNA-niveauer, og øget oxaliplatin følsomhed. I modsætning hertil KRAS-mutant CRC-celler (DLD-1

G13D og SW480

G12V), KRAS bankede ned af KRAS-siRNA førte til ERCC1 opregulering og øget oxaliplatin modstand. Følsomheden af ​​irinotecan og 5FU havde ikke ændret sig i de parrede CRC celler. For at validere ERCC1 som en indikator for følsomhed for oxaliplatin blev ERCC1 bankede ned af siRNA i KRAS-vildtype CRC celler, som restaurerede oxaliplatin følsomhed. I modsætning hertil blev ERCC1 overudtrykt ved ERCC1-udtrykkende vektorer i KRAS-mutant CRC-celler, og forårsagede oxaliplatin modstand. Samlet set vores resultater tyder på, at KRAS mutation er en indikator for oxaliplatin følsomhed i tyktarmskræft celler ved den mekanisme af ERCC1 nedregulering

Henvisning:. Lin YL, Liau JY, Yu SC, Ou DL, Lin LI, Tseng LH et al. (2012) KRAS mutation en Predictor af Oxaliplatin Følsomhed i Colon Cancer Cells. PLoS ONE 7 (11): e50701. doi: 10,1371 /journal.pone.0050701

Redaktør: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, USA

Modtaget: 8. maj 2012; Accepteret: 25 Oktober 2012; Udgivet: November 28, 2012 |

Copyright: © 2012 Lin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra Department of Health, Executive Yuan (DOH100-TD-C-111-001), Taipei, Taiwan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

biomarkører at bestemme behandling effekt er blevet undersøgt i den traditionelle kemoterapi æra, men er blevet fundet kun et begrænset antal af biomarkører hidtil. Eksempler er excision reparation cross-komplementering gruppe 1 (ERCC1) ekspression at forudsige modstanden af ​​oxaliplatin [1], og thymidylatsyntase (TS) ekspression til bestemmelse 5FU følsomhed [2]. Dette koncept har udviklet sig og er blevet mere relevant, mens behandling er avanceret til molekylær målrettet æra. De fleste molekylære målrettede midler har fastlagte mål, som letter forudsige effekten af ​​behandling eller prognosticering af sygdomme. Gode ​​eksempler er epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) mutation til forudsigelse af effektiviteten af ​​EGFR tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er) i lunge adenocarcinom [3], samt KRAS mutation til at forudsige non-responsivitet af EGFR monoklonalt antistof i kolorektal cancer (CRC) [ ,,,0],4]. Selv omfattende undersøgelser er blevet gennemført for at identificere nye prædiktorer fra kendte signalveje eller microarray-baserede undersøgelser [5], [6], biomarkører til at forudsige kemoterapi følsomhed forbliver dårligt defineret.

(A) KRAS-bankede-down DLD-1

G13D celler var mere resistente over for oxaliplatin, men har den samme følsomhed over for irinotecan, 5FU, og doxorubicin end parentale DLD-1

G13D celler, som påvist ved MTT-assayet. (B) Proteinet niveau ERCC1, men ikke de TOPO1 eller TS, blev opreguleret efter DLD-1

G13D celler blev slået ned af KRAS siRNA. (C) mRNA niveau af ERCC1, men ikke de TOPO1 eller TS, blev opreguleret efter DLD-1

G13D celler blev slået ned af KRAS siRNA. ***:

s

0,001

Flere post hoc analyser af de seneste randomiserede forsøg med CRC foreslog, at KRAS genmutation status kan forudsige effekten af ​​cytostatika, især. for oxaliplatin-baserede regimer. OPUS [7] og PRIME [8] undersøgelser, som begge blev designet til patienter til at modtage første linje oxaliplatin /5FU /leucovorin med /uden EGFR monoklonale antistoffer, er gode eksempler. Primært fokus på kemoterapi eneste gruppe i disse 2 undersøgelser viser, at første-line progressionsfri overlevelse (PFS) i KRAS mutant gruppe varet længere end i vildtype-gruppe, med 8,6 versus 7,2 måneder i OPUS undersøgelsen, og 8,8 versus 8,0 måneder i PRIME undersøgelse. Derimod i CRYSTAL undersøgelse [9], som er designet til patienter, der får første-line irinotecan /5FU /leucovorin med /uden EGFR monoklonalt antistof, blev et lignende fænomen ikke observeret. Den mediane første linje PFS i KRAS-mutant og vildtype patienter var 7,7 og 8,4 måneder.

Ifølge disse observationer, vi hypotese, at KRAS mutation kan være en indikator for oxaliplatin følsomhed i CRC. Først blev KRAS bankede-down i KRAS-mutant CRC-celler og overudtrykt i KRAS-vildtype CRC-celler. Disse parrede CRC-celler blev testet ved oxaliplatin, irinotecan og 5FU at vurdere ændringen i lægemiddelfølsomhed. Årsager til sensitivitet ændring blev yderligere bestemt ved Western blot og real-time kvantitativ revers transkriptase polymerasekædereaktion (QRT -PCR). Endelig blev målet ansvarlig for følsomhed ændring valideret ved at banke-ned og overudtrykker målet.

(A) KRAS-bankede-down SW480

G12V celler var mere resistente over for oxaliplatin, men har den samme følsomhed til irinotecan, 5FU og doxorubicin end forældrenes SW480

G12V celler, hvilket fremgår af MTT-analysen. (B) Proteinet niveau ERCC1, men ikke de TOPO1 eller TS, blev opreguleret efter SW480

G12V celler blev slået ned af KRAS siRNA. (C) mRNA niveau af ERCC1, men ikke de TOPO1 eller TS, blev opreguleret efter SW480

G12V celler blev slået ned af KRAS siRNA. ***:.

s

0,001

Materialer og metoder

Cell Culture og reagenser

Menneskelig CRC cellelinjer COLO320DM (KRAS -Wild-type), DLD-1

G13D (KRAS G13D mutation), og SW480

G12V (KRAS G12V mutation) blev alle opnået fra American Type Culture Collection. Celler blev alle holdt i RPMI-1640 indeholdende 10% føtalt bovint serum, 2 mmol /l L-glutamin (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), og PSA (10.000 enheder /ml penicillin, 10 mg /ml streptomycin og 25 pg /ml amphotericin B; Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel) og dyrket ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO2. Oxaliplatin (Eloxatin® injektion 5 mg /ml) blev opnået fra Sanofi-Aventis Co, Ltd (Taipei, Taiwan). Irinotecan, 5FU, og doxorubicin blev alle anskaffet fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kanin-antistoffer til western blot mod ERCC1 og KRAS blev indkøbt fra Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, USA). Muse-antistoffer mod TS, topoisomerase I (TOPO I), og β-actin blev opnået fra Millipore (Bedford, MA, USA), BD Biosciences (San Jose, CA, USA) og Cell Biolabs, Inc. (San Diego, CA, USA), hhv.

(A) KRAS

G13D-DDK-myc-COLO320DM celler var mere følsomme over for oxaliplatin, men har den samme følsomhed over for irinotecan, 5FU, og doxorubicin end forældrenes COLO320DM celler, som demonstreret ved MTT-assayet. (B) Proteinet niveau for ERCC1, men ikke dem af TOPO1 eller TS blev nedreguleret efter COLO320DM celler blev transficeret ved KRAS

G13D mutant vektor. (C) mRNA niveau af ERCC1, men ikke de TOPO1 eller TS, blev nedreguleret efter COLO320DM celler blev transficeret af KRAS

G13D mutant vektor. **:.

s

0,01

Knocking-down af KRAS og ERCC1

To typer både KRAS og ERCC1 små interfererende RNA (siRNA) og scrambled uspecifik (negativ kontrol) siRNA blev indkøbt fra Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA, USA). For KRAS-genet knockdown, DLD-1

G13D og SW480

G12V celler blev først transficeret med KRAS- eller krypteret siRNA’er i 1 dag ved anvendelse af lipofectamin 2000 transfektionsreagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i overensstemmelse med producentens instruktioner . De transficerede celler blev derefter behandlet med oxaliplatin, irinotecan, 5FU og doxorubicin med forskellige koncentrationer for de følgende 72 timer. Proteinet lysat og mRNA fra forældre- og KRAS knockdown DLD-1

G13D og SW480

G12V celler blev opsamlet i 24, 48, 72 og 96 timer efter transfektion for evaluering af KRAS knockdown størrelsesorden ved western blot. For ERCC1 gen knockdown, COLO320DM celler transficeret med to forskellige ERCC1- eller krypterede siRNA’er blev behandlet med oxaliplatin i 72 timer. Proteinet lysat og mRNA af parentale og ERCC-bankede-down COLO320DM celler blev opsamlet i 24, 48, 72 og 96 timer efter transfektion til evaluering af ERCC1 knockdown virkning ved western blot og QRT-PCR.

( A) KRAS

G12V-DDK-myc-COLO320DM celler var mere følsomme over for oxaliplatin, men har den samme følsomhed over for irinotecan, 5FU, og doxorubicin end parentale COLO320DM celler, som påvist ved MTT-assayet. (B) Proteinet niveau for ERCC1, men ikke dem af TOPO1 eller TS blev nedreguleret efter COLO320DM celler blev transficeret ved KRAS

G12V mutant vektor. (C) mRNA niveau af ERCC1, men ikke de TOPO1 eller TS, blev nedreguleret efter COLO320DM celler blev transficeret af KRAS

G12V mutant vektor. **:

s

0,01. (D) Øget procentdel af apoptose, fra 22,5% ± 0,2% til 39,1% ± 0,2% af apoptose (P 0,001), er blevet påvist, når KRAS

WT-DDK-myc-COLO320DM celler, blev sammenlignet med KRAS

G12V-DDK-myc-COLO320DM celler, i hvilke, begge blev behandlet ved samme koncentration af oxaliplatin i 5 uM. *:

s

0,001

Overekspression af KRAS og ERCC1

pCMV6-Myc-DDK-mærkede KRAS vektor blev købt fra OriGene Technologies (. Rockville, MD, USA). DNA-sekvensen kodende KRAS G12V og G13D-mutation blev genereret ved stedorienteret mutagenese og klonet ind i pCMV6-Myc-DDK-mærkede KRAS vektor. Sekvenserne af KRAS G12V og G13D-mutation var som følger: 5′-GTTGTGGTAGTTGGAGCTGTTGGCGTAGGCAAGAATGCC-3 ‘; omvendt: 5’-GGCACTCTTGCCTACGCCAACAGCTCCAACTACCACAAG-3 ‘og frem: 5′-GGTAGTTGGAGCTGGTGACGTAGGCAAGAGTGCC-3′; omvendt: 5’-GGCACTCTTGCCTACGTCACCAGCTCCAACTACC-3 ‘, henholdsvis. For KRAS overekspression blev COLO320DM celler kortvarigt transficeret med pCMV6-Myc-DDK-mærkede KRAS, -KRAS

G12V, og -KRAS

G13D vektorer. Efter 24 timers transfektion blev celler behandlet med oxaliplatin, irinotecan, 5FU, og doxorubicin med forskellige koncentrationer for de følgende 72 timer. Proteinet lysat og mRNA af COLO320DM celler transficeret ved pCMV6-Myc-DDK-mærkede KRAS, -KRAS

G12V, og -KRAS

G13D vektorer blev opsamlet ved 24, 48, 72 og 96 timer til evaluering KRAS overekspression størrelsesorden ved western blot. For ERCC1 overekspression blev SW480

G12V celler transficeret ved pCMV6-ERCC1-GFP-vektoren (OriGene Technologies, Rockville, MD, USA) i 24 timer, og behandles med oxaliplatin i 72 timer. Proteinet lysat af SW480

G12V celler transficeret ved ERCC1-GFP-vektoren blev opsamlet ved 24, 48, 72 og 96 timer for evaluering af ERCC1 overekspression størrelsesorden ved western blot.

(A) ERCC1- bankede-down COLO320DM celler var mere følsomme over for oxaliplatin end parentale COLO320DM celler, som påvist ved MTT-assayet. (B) Protein og mRNA niveauer af ERCC1 blev nedreguleret når COLO320DM celler blev slået ned af ERCC1 siRNA. *:

s

0,05 (C) ERCC1-GFP-SW480

G12V celler var mere resistente over for oxaliplatin end forældrenes SW480

G12V celler. (D) Ektopisk ERCC1 blev opreguleret efter SW480

G12V celler blev transficeret ved ERCC1-GFP ekspressionsvektor.

Cell Levedygtighed og Apoptotiske Analyser

Cell levedygtighed blev vurderet ved hjælp af 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT; Tokyo Chemical Industry Inc., Tokyo, Japan) assay i 6 replikater. Indledningsvis blev COLO320DM, SW480

G12V, og DLD-1

G13D celler podet ved 3500, 4500, og 3000 celler per brønd i 96-brønds fladbundede plader hhv. Efter 24 timers inkubation blev SW480

G12V og DLD-1

G13D celler transficeret ved KRAS- og krypterede siRNA’er, og COLO320DM celler blev transficeret ved pCMV6-Myc-DDK-mærkede KRAS, -KRAS

G12V, og -KRAS

G13D vektorer, som beskrevet. Efter KRAS-siRNA’er blev transficeret til DLD-1

G13D /SW480

G12V celler og KRAS-mutant vektorer til COLO320DM celler i 24 timer, blev cellerne behandlet med oxaliplatin, irinotecan, 5FU, og doxorubicin i forskellige koncentrationer i 10 % FBS-suppleret RPMI-1640 i 72 timer. Kontrolcellerne blev blandet med DMSO ved en koncentration lig med den i lægemiddelbehandlede celler. Cellelevedygtighed af disse behandlede celler blev målt ved tilsætning af 200 pi 0,5 mg /ml MTT solubiliseres i DMSO til hver brønd, og cellerne blev inkuberet i CO

2 inkubator ved 37 ° C i 2 timer efter fjernelse af mediet. Absorbans blev bestemt ved 570 nm. Koncentrationer af forbindelser, som inhiberede levedygtighed med 50% (IC

50) blev bestemt ved anvendelse midterplan virkning metoden ved anvendelse CalcuSyn software (Biosoft, Ferguson, MO, USA).

(A) Protein ekspression af ERCC1 i DLD-1 (KRAS

G13D mutation) celler er opreguleret efter 5′-azacitidin (de-methyleringsmiddel) behandling i 96 timer, hvilket indebar, at nedregulering af ERCC1 i KRAS-mutant CRC celler kan være dels gennem ERCC1 hypermethylering. (B) nedregulering af ERCC1 i COLO320DM (KRAS wild-type) celler transficeret af KRAS

G13D-mutant-vektor i 24 og 96 timer kan ikke kun genoprettes ved 5′-azacitidin i 10 pM, men også forårsaget up- regulering af DNMT3B.

Den fraktion af apoptotiske celler, efter at KRAS overudtrykt i COLO320DM celler, og behandles af oxaliplatin, blev vurderet ved flowcytometri med Annexin V-FITC. COLO320DM celler blev podet ved 2,5 x 10

5 celler /brønd for krypterede og KRAS

G12V-mutant-vektor transfektion i 6-brønds plader. Efter 6 timers transfektion blev transfektion medium erstattet med den regelmæssige medium. Oxaliplatin med koncentrationen af ​​5 uM blev givet til transficerede COLO320DM celler i den næste dag. Transficerede COLO320DM celler blev derefter trypsiniseret og opsamlet til analyse efter 48 timers behandling med oxaliplatin. Celler blev centrifugeret ved 300 g i 5 minutter ved stuetemperatur, og cellesuspensionen blev farvet med Annexin V-FITC (Annexin V assay kit, BD Biosciences Pharmingen) og propidiumiodid ved stuetemperatur i mindst 15 minutter i mørke. Cellerne blev derefter analyseret ved FACScan flowcytometer og Cell Quest-programmet. Andelen af ​​apoptotiske celler var andelen af ​​celler farvet med Annexin V-FITC.

Western blot-analyse

KRAS-overudtrykt COLO320DM og KRAS-bankede-down SW480

G12V og DLD- 1

G13D celler behandlet med forskellige koncentrationer af oxaliplatin, irinotecan, og 5FU i 72 timer i 6 cm skåle (1 × 10

5 celler pr skål) blev opsamlet og lyseret med en RIPA-lysepuffer [50 mmol /L Tris-HCI (pH 8,0), 150 mmol /l NaCl, 1% NP40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS] (Sigma katalog nr. R0278). Proteinkoncentrationer af lysatet blev bestemt ved anvendelse af et Pierce BCA protein assay kit (Thermal Scientific, Odessa, Texas, USA). Ækvivalente mængder af protein fra hvert lysat blev udsat for SDS-PAGE og derefter overført til nitrocellulosemembraner til immunblotting. De transblottet membraner blev vasket to gange med Tris-bufret saltvand (TBS) indeholdende 0,1% Tween 20 (TBST). Efter blokering med TBST indeholdende 5% fedtfri mælk i 40 minutter, blev membranerne inkuberet med det passende primære antistof i TBST indeholdende 1% fedtfri mælk ved 4 ° C natten over. Alle de primære antistoffer blev fortyndet i en passende koncentration af 1% fedtfri mælk-indeholdende TBST. Efter behandling med det primære antistof blev membranerne vasket to gange med TBST i 20 minutter, efterfulgt af gede anti-kanin eller anti-mus IgG-peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (fortyndet 1:3000) i 1 time ved stuetemperatur og vasket 3 gange med TBST i 1 time. Membranerne blev udviklet under anvendelse af et forøget kemiluminescens peberrodsperoxidase substrat (Millipore, Bedford, MA, USA) ifølge producentens anvisninger.

Real-time kvantitativ revers transkriptase polymerasekædereaktion (QRT-PCR)

KRAS-overudtrykt COLO320DM, KRAS-bankede-down SW480

G12V og DLD-1

G13D celler behandlet med forskellige koncentrationer af oxaliplatin, irinotecan, og 5FU i 24, 48 og 72 timer, henholdsvis blev opsamlet og lyseret i en Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og opbevaret ved -20 ° C. RNA fra disse celler blev ekstraheret i overensstemmelse med producentens anvisninger. cDNA’er blev syntetiseret fra totalt RNA (1 ug) ved anvendelse af Applied Biosystems High-Capacity cDNA Archive Kit ifølge producentens instruktioner. CDNA’erne fra 50-ng total RNA blev kvantificeret under anvendelse af Taqman Universal eller SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) på en ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (Perkin-Elmer /Applied Biosystems). Primersekvenserne af ERCC1 (ABI Taqman assay ID: Hs01012158_ml), TOPO I (ABI Taqman assay ID: Hs00243257_ml), TS (ABI Taqman assay ID: Hs00426586_ml), og β-actin-genet (ABI Taqman assay ID: Hs99999903_ml) som et endogen kontrol blev alle købt fra Applied Biosystems (Foster City, CA, USA). Betingelser for PCR var 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 10 minutter, og 40 cykler ved 95 ° C i 15 sekunder (denaturering) og 60 ° C i 1 minut (annealing /extension). Den relative mRNA mængde af målgenet /endogene kontrol genet (β-actin) blev beregnet under anvendelse af ACt (tærskelcyklus) metode, som følger: relative ekspression = 2-ACt, hvor ACt = Ct (målgenet) – Ct (β actin).

Statistisk analyse

for cellelinje undersøgelser blev alle data, gentages i mindst 3 uafhængige forsøg. Kvantitative data er repræsenteret som middelværdi ± SD. Sammenligninger mellem data i de samme eksperimenter blev analyseret ved hjælp af Students

t

test. En

s

-værdi af. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Knocking-down KRAS i KRAS-mutant CRC Cells Øger Oxaliplatin Resistance og deres årsag ERCC1 Overekspression

Knocking-down KRAS i DLD-1

G13D celler resulterede i celler mere resistente over for oxaliplatin, men ikke at irinotecan, og 5FU, kemoterapeutiske standardmidler for CRC, og ikke for doxorubicin, bredspektret kemoterapeutisk middel for række større cancerformer. To forskellige KRAS-siRNAs blev transficeret til DLD-1

G13D celler. IC

50 af de første-parret forældrenes DLD-1

G13D /KRAS-siRNA (1) -DLD-1

G13D celler behandlet med oxaliplatin i 72 timer var 3,97 /33,07 uM. Den anden-parret forældrenes DLD-1

G13D /KRAS-siRNA (2) -DLD-1

G13D celler var 3,97 /13,49 uM. IC

50 af parrede parentale DLD-1

G13D /KRAS-siRNA-DLD-1

G13D celler behandlet med irinotecan, 5FU og doxorubicin forblev uændret (figur 1A). ERCC1, TOPO I og TS, som blev anset for at være biomarkører til forudsigelse af følsomheden af ​​oxaliplatin [1], irinotecan [10] og 5FU [2] henholdsvis blev yderligere kontrolleret ved Western blot og QRT-PCR (figur 1B, and1C ) til at undersøge mekanismerne bag vores resultater. Kun ERCC1 ekspression blev opreguleret efter KRAS knockdown; i modsætning hertil TOPO I og TS forblev konstant både i protein og mRNA-niveauer. KRAS knockdown effektivitet blev evalueret ved Western blot, som viste formindsket af KRAS-ekspression efter 72-time banke ned KRAS-genet (figur 1B).

For yderligere at styrke vores observation, brugte vi en anden CRC celle, SW480 , som nærede en anden KRAS mutant subtype, G12V, at gentage de samme eksperimentelle procedurer. Sammenfattende var parentale SW480

G12V celler, som forventet, mere følsom over for oxaliplatin end KRAS bankede-down SW480

G12V celler. IC

50 af forældrenes SW480

G12V /KRAS-siRNA-SW480

G12V celler behandlet med oxaliplatin i 72 timer var 2,08 /13,53 uM, men forældrenes SW480

G12V /KRAS-siRNA- SW480

G12V celler behandlet med irinotecan, 5FU og doxorubicin forblev uændret (figur 2A). ERCC1, TOPO I og TS blev samtidigt kontrolleres ved Western blot og QRT-PCR (figur 2B og 2C), og igen kun ERCC1 blev opreguleret efter KRAS knockdown, med TOPO I- og TS-niveauer forbliver uændret i protein og mRNA-niveauer. Tilsvarende blev KRAS knockdown effektivitet målt ved Western blot, som viste et fald i KRAS-ekspression efter 72-time banke ned KRAS-genet (figur 2B).

overekspression KRAS i KRAS Wild-typen CRC Cells Leads til oxaliplatin Følsomhed og ERCC1 Nedregulering

Overekspression af KRAS i COLO320DM celler ved KRAS-mutant vektorer resulterede i celler mere følsomme over for oxaliplatin. IC

50 af forældrenes COLO320DM /KRAS

G13D-DDK-myc-COLO320DM celler behandlet med oxaliplatin i 72 timer var 2,86 /0,26 uM, men forældrenes COLO320DM /KRAS

G13D-DDK-myc- COLO320DM celler behandlet med irinotecan, 5FU, og doxorubicin forblev uændret (figur 3A). ERCC1, TOPO I og TS blev kontrolleret ved Western blot og QRT-PCR (figur 3B og 3C), som viste, at kun ERCC1 blev nedreguleret uden ændringer i protein og mRNA-niveauer i TOPO I og TS efter KRAS overekspression. Ekspressionen af ​​ektopiske KRAS og endogene KRAS blev målt ved Western blot, som viste en robust ekspression af ektopisk KRAS, med en konstant ekspressionen af ​​endogene KRAS efter 24 timers overekspression af KRAS-genet (figur 3B).

de samme resultater blev også fundet i COLO320DM celler transficeret med KRAS

G12V-mutant vektor. IC

50 af forældrenes COLO320DM /KRAS

G12V-DDK-myc-COLO320DM celler behandlet med oxaliplatin i 72 timer var 2,55 /0,25 uM, men forældrenes COLO320DM /KRAS

G12V-DDK-myc- COLO320DM celler behandlet med irinotecan, 5FU, og doxorubicin forblev uændret (figur 4A). Igen blev der kun ERCC1 nedreguleret uden ændring af TOPO I og TS i protein (figur 4B) og mRNA-niveauer (figur 4C) efter KRAS overekspression. Ekspressionen af ​​ektopiske KRAS og endogene KRAS Efter 24 timers overekspression af KRAS-genet er vist i figur 4B. For yderligere at styrke den konstatering, at KRAS

G12V-DDK-myc-COLO320DM celler var mere følsomme over for oxaliplatin end forældrenes COLO320DM celler, flowcytometri med annexin V-FITC blev udført. Følgelig forøgede procentdel af apoptose, fra 22,5% ± 0,2% til 39,1% ± 0,2% af apoptose (P 0,001), er blevet fundet, når parentale COLO320DM celler, transficeret med KRAS

wt-DDK-myc-vektor, var sammenlignet med COLO320DM celler, transficeret af KRAS

G12V-DDK-myc-vektor, hvor begge blev behandlet af den samme koncentration af oxaliplatin i 5 pM (figur 4D).

Validering ERCC1 Expression som Predictor af oxaliplatin følsomhed

Knocking-down ERCC1 i KRAS-vildtypen CRC celler genopretter oxaliplatin følsomhed.

for yderligere at bekræfte forholdet mellem ERCC1 udtryk og oxaliplatin følsomhed, vi bankede-ned ERCC1 genet anvendelse af 2 forskellige ERCC1-siRNA’er i KRAS-vildtypeceller (COLO320DM). Vi fandt, at IC

50 i den første parrede parental COLO320DM /ERCC1-siRNA (1) -COLO320DM celler behandlet med oxaliplatin i 72 timer var 2,75 /0,91 pM (figur 5A). Den anden-parret forældrenes COLO320DM /ERCC1-siRNA (2) -COLO320DM celler var 2,75 /0,83 pM (figur 5A). Protein- og mRNA ekspressionsniveauer af ERCC1 blev nedreguleret efter ERCC1 blev slået ned ved ERCC1-siRNA i COLO320DM celler (figur 5B).

overudtrykker ERCC1 i KRAS-mutant CRC-celler forårsager oxaliplatin modstand.

Overekspression af ERCC1 i SW480

G12V celler ved ERCC1 overudtrykker vektor forårsaget SW480

G12V celler til at blive mere resistente over for oxaliplatin. IC

50 af forældrenes SW480

G12V /ERCC1-GFP-SW480

G12V celler behandlet med oxaliplatin i 72 timer var 1,87 /11.03 pM (figur 5C). Western blot blev anvendt til at bestemme ERCC1-GFP overekspression niveau efter transfektion (fig 5D).

Discussion

Vores undersøgelse viser, at KRAS mutation er en prædiktor for oxaliplatin følsomhed i colon cancerceller efter ERCC1 nedregulering. Det kan give et vigtigt skridt til personlig kemoterapi i tyktarmskræft.

I den præ-målrettede terapi æra, Tournigand et al [11] offentliggjort den centrale artikel, der angiver, at første linje kemoterapi med enten irinotecan /5FU /lecovorin (FOLFIRI) eller oxaliplatin /5FU /leucovorin (FOLFOX6) i “ikke-valgt” metastatisk CRC patienter, sekventielt efterfulgt af den anden efter progression, havde ikke indflydelse samlet overlevelse (OS). Deres artikel anførte også, at begge regimer kan anbefales som en første-line behandling for avanceret CRC. I den moderne æra af målrettet terapi, er nuværende behandling været fremført til personlig behandling efter vildtype-KRAS-genet blev identificeret som en prædiktor for EGFR monoklonalt antistof. KRAS-status er blevet anbefalet at rutinemæssigt kontrolleres daglig onkologisk praksis. At identificere bedre prædiktorer i aktuelle kemoterapi eller nyere behandlingsmål for KRAS-mutant CRC patienter er berettiget. Vores undersøgelse blev indledt for at finde bedre prædiktorer i nuværende kemoterapi, for hvilke hypotesen blev genereret fra undergruppe analyser af randomiserede prospektive kliniske undersøgelser, PRIME [8] og OPUS [7], versus CRYSTAL [9]. Ifølge vores resultater, kan KRAS-mutant CRC patienter har større fordel af at modtage first-line oxaliplatin-baserede regimer end patienter KRAS-vildtype. Dette fænomen berettiger yderligere bekræftelse af store prospektive kliniske forsøg.

Vores data viste, at KRAS mutation i CRC celler forårsaget ERCC1 nedregulering. Denne betydelige fund kan betyde, at nogle andre ukendte druggable mål stadig kan være ansvarlige for KRAS-mutant CRC behandling ud over den traditionelle RAS /RAF /MEK /ERK-vejen. At udforske disse ukendte mål, kan undersøgelser designet fra epigenetisk og /eller genetisk synspunkter være nyttig. Fra epigenetisk synspunkt hypermethylering forårsager gendæmpning er velkendt [12], [13]. I vores undersøgelse har vi fundet, at proteinet ekspression af ERCC1 i DLD-1 (KRAS

G13D mutation) celler opreguleres efter 5′-azacitidin (de-methyleringsmiddel) behandling i 96 timer (figur 6A), hvilket indikerede, at nedregulering af ERCC1 i KRAS-mutant CRC celler kan være dels gennem ERCC1 hypermethylering. Vi fandt også, at nedregulering af proteinekspression af ERCC1 i COLO320DM (KRAS vildtype) celler transficeret med KRAS-mutant-vektor til 24 og 96 timer kan genoprettes ved 5′-azacitidin (figur 6B). Denne yderligere indebar, at nedregulering af ERCC1 udtryk i CRC celler er ikke kun til dels gennem hypermethylering, men også bestemt af ændringerne i KRAS-ekspression i CRC celler. Fordi nedregulering af ERCC1 i COLO320DM celler, transficeret af KRAS

G13D-mutant-vektor, kan være forårsaget af hypermethylering af ERCC1, vi yderligere kontrolleres DNMT3B (DNA methyltransferase 3B), og hvis væsentligste rolle er at fortsætte processen med methylering. Vi fandt, at DNMT3B blev opreguleret da ERCC1 blev dowenregulated i COLO320DM celler, transficeret med KRAS

G13D-mutanten-vektoren (figur 6B). DNMT3B kan igen undertrykke ved 5′-azacitidin, der er afbildet, at DNMT3B er sandsynligvis ansvarlig for methylering processen. Derfor viste vores data, at ERCC1 nedregulering i KRAS-mutant CRC-celler kan være gennem ERCC1 hypermethylering. Vi foreslog, at KRAS-mutant CRC celler kan have højere methylering sats på CpG øer af ERCC1 promotor-regionen end KRAS-mutant celler transficeret af KRAS-siRNA. Denne hypotese kan valideres ved at sammenligne de mulige forskelle i hypermethylering på ERCC1 promoter regionen mellem KRAS-mutant celler og KRAS-mutant celler transficeret af KRAS-siRNA ved methylering specifik PCR og /eller natriumbisulfit sekventering analyse [14]. Hele konceptet ville være, at KRAS aktiverende mutation kan forårsage DNMT3B opregulering. Efterfølgende DNMT3B kan binde til promotorregionen af ​​ERCC1 at resultere i hypermethylering af ERCC1 genet. Endelig hypermethylering af ERCC1 gen resulterer i nedregulering af ERCC1 ekspression. Alternativt fra genetisk synspunkt som KRAS mutation er en aktiverende mutation, som er blevet bredt accepteret [15], [16] foreslog vi at der kunne være en eksisterede ukendt faktor, som kan inhiberes ved aktivering af KRAS-genet eller dens downstream signaler. Denne faktor skal også være en aktiverende faktor til at aktivere ERCC1 gen. Så, når KRAS-genet er muteret (aktiveret), denne faktor kan være hæmmet, og mængden af ​​denne faktor kan blive afvist. Efterfølgende kan ekspressionen af ​​ERCC1 undertrykkes på grund af manglen på denne faktor. At gennemføre denne form for undersøgelser, reporter genkonstruktioner hjælp ERCC1 promotor, kan luciferaseaktivitet assay og kromatin immunofældning være således nødvendigt [17].

Selvom de detaljerede mekanismer bag disse resultater forbliver undvigende, crosstalks mellem det muterede KRAS-genet og DNA-reparation maskiner veje, som også kan være ansvarlig for effekten af ​​oxaliplatin-baserede behandling, er blevet undersøgt [18], [19]. Derudover kan forskellige nye generationer af microarray-baserede teknologier, der sammenligner samme givne celler med /uden KRAS mutation ved at banke ned og overekspression KRAS-genet i overensstemmelse hermed, være en anden nyttig måde at definere nye mål for KRAS-mutant CRC behandling [5], [6].

Overekspression af ERCC1 er forbundet til modstanden mod platinbaseret kemoterapi [1], [20], [21], [22], [23], [24], som har været påvist i forskellige former for kræft, herunder esophageal kræft [25], ikke-småcellet lungekræft [26], og blære kræftformer [27]. Disse resultater er også kompatible med den aktuelle undersøgelse. I vores undersøgelse demonstrerede vi, at KRAS vildtype (COLO320DM) CRC-celler var mere resistente over for oxaliplatin end de samme givne celler (COLO320DM) transficeret med KRAS-mutant-vektorer.