PLoS ONE: Hypoxi Øger gefitinib-Resistant Lung Cancer Stamceller gennem Aktivering af insulin-lignende vækstfaktor 1 receptor

Abstrakte

Akkumulerende data viser, at en lille population af kræft stamceller (CSCS) er involveret i iboende modstand mod kræftbehandling. Den hypoxiske mikromiljø er en vigtig stamcelle niche, der fremmer den fortsatte CSCS i tumorer. Vores mål her var at belyse den rolle, hypoxi og CSCS i modstanden mod gefitinib i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) med aktiverende epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) mutation. NSCLC cellelinjer, PC9 og HCC827, som udtrykker de

EGFR

exon 19 deletionsmutationer, blev udsat for høj koncentration af gefitinib under normoxisk eller hypoxiske betingelser. Syv dage efter gefitinib eksponering blev detekteret en lille brøkdel af levedygtige celler, og disse blev benævnt “gefitinib-resistente persisters” (GRP). CD133, Oct4, Sox2, Nanog, CXCR4, og ALDH1A1-alle gener involveret i stemness-var stærkt udtrykt i GRP i PC9 og HCC827 celler, og PC9 GRP udstillet et stort potentiale for tumorgenicitet

in vivo

. Ekspressionen af ​​insulin-lignende vækstfaktor 1 (IGF1) blev også opreguleret og IGF1 receptor (IGF1R) blev aktiveret på GRP. Vigtigere, hypoksisk eksponering signifikant øget sfære dannelse, hvilket afspejler den selvfornyelse kapacitet, og befolkningen i CD133- og Oct4-positive GRP. Derudover hypoxi opreguleret IGF1 udtryk gennem hypoxi-inducerbare faktor 1α (HIF1α), og markant fremmet aktivering af IGF1R på GRP. Knockdown af IGF1-ekspression betydeligt reduceret phosphorylerede IGF1R-udtrykkende GRP under hypoxiske betingelser. Endelig hæmning af HIF1α eller IGF1R af specifikke inhibitorer faldt betydeligt befolkningen i CD133- og Oct4-positive GRP, som blev forøget med hypoxi i PC9 og HCC827 celler. Kollektivt, disse resultater tyder på, at hypoksi øget bestanden af ​​lunge CSCS resistente over for gefitinib i

EGFR

mutation-positive NSCLC ved at aktivere IGF1R. Målretning af IGF1R vej kan være en lovende strategi for at overvinde gefitinibs modstand i

EGFR

mutation-positive NSCLC fremkaldt af lunge CSCS og microenvironment faktorer såsom tumor hypoxi

Henvisning:. Murakami A, Takahashi F , Nurwidya F, Kobayashi I, Minakata K, Hashimoto M, et al. (2014) Hypoxi Øger Gefitinib-Resistant Lung Cancer Stamceller gennem Aktivering af insulin-lignende vækstfaktor 1 receptor. PLoS ONE 9 (1): e86459. doi: 10,1371 /journal.pone.0086459

Redaktør: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, USA

Modtaget: Juli 1, 2013; Accepteret: December 13, 2013; Udgivet: 28 Januar 2014

Copyright: © 2014 Murakami et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Grant-in-aids for Videnskabelig Forskning No. 23591906 (Fumiyuki Takahashi) fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

købet af resistens over for lægemidler mod cancer er fortsat en afgørende hindring for at forbedre prognosen for kræftpatienter. Lægemiddelresistens kan ske gennem en række mekanismer, herunder narkotika efflux fra kræftceller, augmented lægemiddelmetabolisme, sekundære mutationer i target stoffet, og engagement af alternative overlevelse veje [1]. Disse mekanismer erhvervet resistens er generelt forårsaget af genetiske ændringer i tumorceller, som fortsat under kræftbehandling. Imidlertid har nyere undersøgelser også afsløret ikke-mutationsmønstre mekanismer resistens, herunder eksistensen af ​​lille befolkning af cancer stamceller (CSCS) [2]. CSCS, som også er kendt som tumor-initierende celler og stamceller-lignende cancerceller, udtrykkelige stamcellemarkører herunder CD133, ABCG2, BMI-1, og Oct4, og kan danne flydende kugler i serum-frit medium, en ejendom i forbindelse med stilk celler [3] – [5]. Stigende evidens for, at små populationer af CSCS er selv mere resistente over for en række anticancerlægemidler og er ansvarlige for resistens mod kræftbehandling, som ofte ledsager tumor tilbagefald [6]. Således kan målretning CSCS forbedre behandlingsresultater og føre til udvikling af nye lægemidler til kræftpatienter.

stamcelle “nicher” defineres som særlige steder eller mikromiljøer der opretholder egenskaber stamceller selv-fornyelse og multipotency [ ,,,0],7], [8]. Solide tumorer indeholder ofte regioner med utilstrækkelig ilttilførsel, en tilstand kendt som hypoxi, og flere nylige rapporter har antydet, at hypoxi fremmer vedvarende CSCS i tumorer [9]. Denne hypoksiske niche er ansvarlig for CSC vedligeholdelse og spiller en rolle i at fremme terapeutisk resistens [10]. Således kan målrette den hypoxiske mikromiljø være en anden lovende strategi for effektiv kontrol af CSCS [9].

Avanceret ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er den førende årsag til cancer-relaterede dødsfald på verdensplan [11]. Somatiske mutationer i den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) genet, såsom en i-ramme deletion mutation i exon 19, er forbundet med en gunstig reaktion på EGFR tyrosinkinaseinhibitorer (EGFR-TKI’er), gefitinib og erlotinib [12]. EGFR kinasedomæmemutationer forekomme på et væsentligt højere frekvens i tumorer fra østasiater patienter sammenlignet med ikke-asiater [13]. Men i de fleste rapporter, progressionsfri overlevelse af patienter ikke overstige 12 måneder, og de fleste patienter udviklede erhvervet resistens [14]. Desuden 25-30% af patienterne er uløseligt resistente over for EGFR-TKI’er som deres tumorer er diagnosticeret som huser aktiverende mutationer i

EGFR

[15], [16]. De vigtigste resistensmekanismer identificeret til dato omfatte sekundære mutationer og en “onkogen kinase switch.”

EGFR

T790M mutation udgør 50% af tilfældene, og

MET

forstærkning kan påvises i 20 % af patienter med

EGFR

-mutant TKI-resistente NSCLC [17]. Men de mekanismer, der er ansvarlige for intern resistens og andre erhvervet resistens til EGFR-TKI samt spørgsmålet om, hvorvidt CSCS og hypoxiske nicher bidrager til EGFR-TKI modstand, er ikke fuldt forstået.

IGF1R er en transmembrane receptortyrosinkinase ansvarlig for cellulær proliferation og overlevelse [18]. IGF1R udtrykkes i mange typer af cancerceller, herunder NSCLC [18], og øget aktivering af IGF1R er impliceret i resistens mod kemoterapi og målrettede behandlingsformer såsom EGFR-TKI’er [19], [20]. Adskillige nylige rapporter har antydet, at IGF1R spiller en kritisk rolle i overlevelsen af ​​nogle CSCS [21]. Kemoterapi kolorektal cancer celler blev beriget for CSCS og øget følsomhed over for IGF1R hæmning [21]. Ifølge Sharma et al., Lægemiddel-tolerante subpopulation efter letal lægemiddeleksponering syntes at have CSC fænotype og udtrykt phosphoryleret IGF1R i flere testede cellelinje modeller, herunder NSCLC cellelinien PC9. Samtidig behandling af PC9 celler med EGFR-TKI plus IGF1R inhibitor forhindret fremkomsten af ​​den lægemiddel-tolerante CSC fænotype [2]. Kollektive fund tyder på en potentiel rolle for IGF1R signalering i stoffet tolerance over CSCS til EGFR-TKI’er. Men sammenhængen mellem hypoxi, CSCS, og IGF1R signalering i EGFR-TKI modstand er ikke klarlagt.

I denne undersøgelse undersøgte vi rolle iltsvind i de vedvarende lunge CSCS i gefitinib modstand i NSCLC med aktivering

EGFR

mutationer. Den NSCLC cellelinjer PC9 og HCC827, bærer en aktiverende

EGFR

mutation, blev udsat for en høj koncentration af gefitinib under normoxisk eller hypoxiske betingelser. Vi fandt, at hypoksi øget gefitinib-resistent lunge CSCS i

EGFR

mutation-positive NSCLCs ved at aktivere IGF1R. Den biologiske betydning af hypoxi for vedvarende gefitinib-resistente CSCS og øget aktivering af IGF1R blev undersøgt.

Materialer og metoder

Cell Kultur og reagenser

NSCLC cellelinjer PC9 og HCC827, som udtrykker

EGFR

exon 19 deletionsmutationer (ΔE746-A750), blev anvendt i denne undersøgelse. PC9 celler blev etableret på Tokyo Medical University (Tokyo, Japan), som tidligere [22] beskrevet, og blev venligst stillet til rådighed af Dr. Kazuto Nishio (Institut for Genome Biology, School of Medicine, Kinki University, Osaka). HCC827 celler blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Cellelinjer blev verificeret at være mycoplasma-fri. Celler blev dyrket i RPMI-1640 medium (Wako, Osaka, Japan) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), penicillin og streptomycin (100 U /ml og 100 ug /mL), og blev dyrket i en befugtet 5% CO

2 atmosfære ved 37 ° C i en inkubator, hvor oxygenspænding blev holdt ved enten 21% (normoxi) eller 1% (hypoxia). Gefitinib blev købt fra JS Research Chemicals Trading (Wedel, Tyskland). YC-1 og AEW541 blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) og Selleck kemikalier (Houston, TX, USA), hhv.

Generation of Gefitinib-resistente Persisters (GRP)

i alt 2 × 10

5-celler blev udpladet i ti 10-cm plader og fik lov til at klæbe i 24 timer. Celler blev derefter behandlet med gefitinib ved en koncentration på 1 uM, hvilket er 30-50 gange det etablerede IC

50 værdier, og inkuberet under normoxi (21% O

2) eller hypoxi (1% O

2). Medium blev erstattet med frisk medium indeholdende gefitinib hver 3. dag. Levedygtige celler, der forblev knyttet på skålen på dag 7 under normoxisk eller hypoxiske betingelser blev anset for at være gefitinib-resistente persisters (GRP) eller hypoxisk gefitinib-resistente persisters (hypoxiske GRP), henholdsvis, og blev indsamlet til analyse. Den genetiske identitet GRP med de parentale celler blev bekræftet under anvendelse af GenomeLab Humant STR Primer sæt fra Beckman Coulter (Fullerton, CA, USA), ifølge producentens anvisninger.

kvantitativ real-time PCR

Totale RNA’er blev ekstraheret fra cellelinjer under anvendelse af Mirvana miRNA Isolation kit (Ambion, Austin, TX, USA). cDNA blev dannet fra 1 eller 2 ug RNA ved anvendelse af første streng cDNA-syntese kit (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) ifølge producentens protokol. Kvantitativ real-time PCR (qPCR) blev udført ved hjælp af Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) som tidligere beskrevet [22]. Følgende program blev kørt: fastholdelse ved 95 ° C i 20 sekunder, amplifikation via 40 cykler (denaturering 95 ° C i 3 sek, annealing og forlængelse ved 60 ° C i 30 sek), med samtidig smelte-kurve analyse. Vi evaluerede elleve husholdning gener (

ACTB, GAPDH, UBC, B2M, YWHAZ, SF3A1, 28S rRNA, EIF4A2, SDHA, TOP1

og

ATP5B

) i eksperimentelle prøver at identificere de mest stabilt udtrykt kontrol gener ved anvendelse geNorm software (https://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/). Actin beta (

ACTB

) og succinatdehydrogenase kompleks, underenhed A flavoprotein (

SDHA

) blev identificeret som de mest stabile housekeeping-gener i vores celle modeller af qPCR analyse; derfor,

ACTB

eller

SDHA

blev brugt som de interne kontroller

De primere, der var specifikke for generne var som følger:.

CD133

Videresend, 5′-GGCCCAGTACAACACTACCAA-3 ‘

Reverse, 5′-CGCCTCCTAGCACTGAATTGATA-3′

Oct4

Fremad, 5′-GAGTGAGAGGCAACCTGGAG-3 ‘

Reverse, 5′-GCCGGTTACAGAACCACACT-3′

Sox2

Fremad, 5′-TACAGCATGTCCTACTCGCAG-3 ‘

Reverse, 5′-GAGGAAGAGGTAACCACAGGG -3 ‘

Nanog

Fremad, 5′-TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT-3′

Reverse, 5′-AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG-3 ‘

CXCR4

Videresend, 5′-ACGCCACCAACAGTCAGAG-3 ‘

Reverse, 5′-AGTCGGGAATAGTCAGCAGGA-3′

ALDH1A1

Fremad, 5′-GCACGCCAGACTTACCTGTC-3 ‘

Reverse, 5′-CCTCCTCAGTTGCAGGATTAAAG-3 ‘

IGF1

Fremad, 5′-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGGA-3′

Reverse, 5′-CGACTGCTGGAGCCATACC-3 ‘

Immunofluorescens

PC9 eller HCC827 celler blev dyrket på Lab-Tek kammer II slides (Nunc, Rochester, NY, USA) med eller uden en uM eller 2 uM gefitinib og under normoxisk eller hypoxiske betingelser i 72 timer, fikseret med 8% paraformaldehyd i 20 minutter, og permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 i 3 minutter. Efter blokering med 10% gedeserum i phosphatbufret saltvand (PBS) i 30 minutter ved stuetemperatur blev cellerne inkuberet ved 4 ° C natten over med følgende primære antistoffer: CD133 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland), Oct4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californien, USA), IGF1 (Abcam, Cambridge, UK), og pIGF1R (Sigma-Aldrich). Proteiner blev visualiseret ved inkubation med sekundært antistof mærket med Alexa Fluor 488 gede-anti-kanin-IgG eller Alexa Fluor 594 ged anti-mus IgG (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Slides blev monteret ved hjælp Vectashield Mounting Medium med DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Billeder blev opnået på en Axioplan 2 imaging (ZEISS, Oberkochen, Tyskland) med AxioVision software (ZEISS). Billeder bruges til sammenligninger af forskellige celler og /eller behandlinger blev erhvervet med samme instrumentets indstillinger og eksponeringstider og blev behandlet på samme måde. Antallet af CD133-, Oct4-, og phosphorylerede IGF1R-positive celler blev talt; forholdet mellem positive celler blev beregnet i fem felter for hvert forsøg.

Sphere Forming Assay

Single-cellesuspensionskulturer blev fremstillet ved densiteter på 2,5 x 10

3 celler per brønd i serumfrit medium DMEM /F12 (Gibco, Grand Island, NY, USA) suppleret med kommerciel hormon mix B27 (Gibco), EGF (20 ng /mL; Gibco), FGF (20 ng /ml; Invitrogen) og heparin ( 2 ug /ml) og udsået i 6-brønds ultralav fastgørelsesplader (Corning, Corning, NY, USA). PC9 forældrenes celler og GRP blev inkuberet under normoxiske betingelser, mens PC9 hypoxiske GRP blev inkuberet under hypoxiske betingelser. Dyrkningsmediet blev udskiftet hver 3. dag; antallet og størrelsen af ​​kuglerne blev registreret og immunofluorescens blev udført 7 dage efter starten af ​​dyrkningsperioden [23]. Salg

RNA Interference Salg

Små interfererende RNA’er (siRNA’er) målretning IGF1 ( stealth Vælg RNAi siRNA) blev syntetiseret ved Invitrogen. En negativ kontrol blev også indkøbt fra Invitrogen. PC9 eller HCC827 celler blev transficeret med 2 forskellige specifikke siRNAs og 1 ikke-specifik kontrol under anvendelse af lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Cellerne blev løsnet og fortyndet i komplet vækstmedium uden antibiotika og derefter udpladet i hver af brøndene. RNAi duplex og Lipofectamin RNAiMAX blev blandet i Opti-MEM®I (Gibco) reducerede serum medium og inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur. RNAi duplex-Lipofectamin ™ RNAiMAX komplekser blev tilsat til brøndene indeholdende cellerne. Cellerne blev derefter inkuberet i 48 timer ved 37 ° C

Sekvenserne af siRNA mod IGF1 var som følger:.

IGF1 # 1:5′-ACACCAUGUCCUCCUCGCAUCUCUU-3 ‘

IGF1 # 2:5′-UGCUGCUUCCGGAGCUGUGAUCUAA-3 ‘

Colony inhiberingsassay

PC9 celler (2 × 10

5) eller HCC827 celler (4 × 10

5) blev udpladet i 10-cm plader og fik lov til at klæbe i 24 timer. Celler blev derefter inkuberet med 1 uM eller 2 uM gefitinib, og med eller uden 0,01 pM, 0,1 pM, eller 1 uM AEW541 under hypoxiske betingelser i 18 dage for PC9 celler eller 11 dage for HCC827 celler. Efter inkubation blev antallet af kolonier tælles.

In vivo

Tumorigenicitet Study

NOD /Shi-SCID /IL-2Rcnull (NOG) mus (7-uge- gammel, hun) blev købt fra den centrale institut for forsøgsdyr (Kanagawa, Japan). Alle mus blev sendt til Juntendo University og blev holdt under patogenfrie betingelser. Musene blev huset i et rum under kontrolleret temperatur (25 ° C), fugtighed og belysning (12 timers lys /mørke cyklus).

Ad libitum

adgang til mad og vand fra hanen var tilladt i hele forsøgsperioden. At evaluere

in vivo

tumorigene potentiale, 1 × 10 celler eller 1 x 10

2 celler af PC9 parentale celler og normoxiske og hypoxiske PC9 GRP blev blandet med Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) og injiceres i begge flanker af nog mus. Tumor dannelse blev evalueret 22-50 dage efter injektion.

Etik

Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med de grundlæggende retningslinjer for korrekt afvikling af dyreforsøg og relaterede aktiviteter i akademiske forskningsinstitutioner under kompetence Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi (meddelelse nr 71, 2006) og blev godkendt af Udvalget for dyreforsøg af Juntendo University med Godkendelse nr 240182.

Statistisk analyse

Værdier blev sammenlignet ved hjælp af en to-tailed Students

t

-test. At sammenligne flere grupper blev en envejs variansanalyse (ANOVA) -testen anvendes. Statistisk analyse af kugle størrelse blev udført under anvendelse af Kruskal-Wallis test. Forskelle mellem de midler blev betragtet som statistisk signifikant, når p. 0,05

Resultater

Isolering og Gene Expression Analyse af Gefitinib-resistente Persisters (GRP) afledt af NSCLC cellelinier huser en Aktivering

EGFR

mutation

NSCLC cellelinje PC9, bærer en aktiverende

EGFR

mutation, blev behandlet med en uM gefitinib. Som beskrevet i en tidligere rapport [2], kan en lille fraktion af levedygtige celler overleve og forblive 7 dage senere, hvorimod de fleste celler var døde i løbet af få dage (figur 1B). Vi henviste til disse celler som gefitinib-resistente persisters (GRP). Selvom GRP var yderst hvilende, GRP genoptaget prolifererende under den høje koncentration af gefitinib (figur 1C) og til sidst viste normale proliferation (figur 1D). En analog population af GRP blev påvist i de øvrige testede NSCLC cellelinie, HCC827 huser et følsomt

EGFR

mutation, ved behandling med 1 uM gefitinib (data ikke vist).

Først 2 × 10

5 PC9 celler blev udpladet i 10-cm plader og fik lov til at klæbe i 24 timer (A). Celler blev derefter behandlet med 1 uM gefitinib. Frisk medier indeholdende gefitinib blev erstattet hver 3. dag. Syv dage efter gefitinib eksponering, en lille brøkdel af levedygtige celler forblev (B), genoptog prolifererende 18 dage senere (C), og fortsatte med at proliferere selv 30 dage senere (D). A. repræsentant mikroskopisk billede af forældrenes PC9 celler. B, C, D. Repræsentative billeder af PC9 GRP udsat for en uM gefitinib for 7, 18, og 30 dage blev fotograferet henholdsvis.

Den genetiske identitet GRP med stamcellerne blev bekræftet ved hjælp af en PCR-baseret analyse (GenomeLab Menneskelig STR Primer sæt fra Beckman Coulter), der afhører et sæt af 12 korte tandemgentagelser. Analyse af genomiske DNA’er fra parentale celler og GRP af PC9 og HCC827 celler er vist i fig S1 i Information S1. STR profiler af forældrenes celler og GRP har samme. Desuden GRP af PC9 og HCC827 celler beholdt

EGFR

exon 19 deletionsmutation (ΔE746-A750), som vurderet ved direkte sekventering (data ikke vist). Tilsammen disse resultater bekræfter, at GRP ikke skyldes kontaminerende celler. Hverken

EGFR

T790M mutation eller

MET

genamplifikation blev observeret i GRP i både PC9 og HCC827 celler (data ikke vist). Den tyrosinkinase Src blev ikke aktiveret i GRP både PC9 og HCC827 celler sammenlignet med ubehandlede parentale celler (figur S2 i Information S1). EGFR og HER3 blev aktiveret på forældrenes PC9 og HCC827 celler, men udtryk blev undertrykt markant på GRP begge cellelinier (figur S2 i Information S1).

For at identificere den mekanisme underliggende gefitinibs modstand i vores celle model, vi først analyseret genekspression i forældrenes celler og GRP anvender qPCR. Det formodede lunge CSC markør CD133 var højt udtrykt i GRP i PC9 og HCC827 celler (figur 2A), hvilket tyder på en stemness fænotype. For yderligere at fastslå, om GRP kan afsløre karakteristika CSCS i vores celle modeller, afprøvede vi ekspressionen af ​​gener, der regulerer og vedligeholdelse af stamcelle-fænotype. Interessant, gen udtryk for Oct4, Sox2, og Nanog, som også er kendt for at være involveret i omprogrammering mus eller humane somatiske celler til udifferentierede, pluripotente stamceller, blev signifikant forøget i GRP i PC9 celler, viser stigninger på 3,4 gange, 5,4 fold, og 6,9-fold, henholdsvis over parentale PC9 celler (figur 2A). Endvidere ekspression af CXCR4 og ALDH1A1, også vist sig at være forbundet med CSC fænotype, blev opreguleret (Figur 2A). Lignende resultater blev opnået for HCC827 GRP (figur 2A). Andre kendte stamcelle gener, såsom ABCG2, BMI-1, og CD117 (c-Kit), blev ikke opreguleret i GRP (data ikke vist).

A. Kvantitativ RT-PCR blev udført med primere specifikke for CD133, Oct4, Sox2, Nanog, CXCR4, og ALDH1A1, som er stemness gener i PC9 eller HCC827 parentale celler og GRP. B. Kvantitativ RT-PCR blev udført med primere specifikke for IGF1 og IGF1R i PC9 eller HCC827 parentale celler og GRP. Data blev normaliseret til actin ekspression. * P 0,01, ** p 0,001, *** p. 0,0001

En tidligere rapport viste også, at IGF1R var phosphoryleret og aktiveret i EGFR-TKI-tolerante celler i PC9 celler, og at en IGF1R inhibitor, AEW541, kunne forhindre fremkomsten af ​​disse tolerante celler [2]. Vi undersøgte IGF1 og IGF1R ekspression under anvendelse qPCR i vores celle model. IGF1-ekspression blev dramatisk opreguleret i PC9 GRP sammenlignet med PC9 parentale celler, der viser stigning på 49,8 gange (figur 2B). IGF1R ekspression blev let øget i GRP (figur 2B). Lignende resultater blev opnået for GRP i HCC827 celler (Figur 2B).

Tilsammen tyder disse resultater på, at den lille population af NSCLC celler, der var stærkt beriget for genekspression af stemness og IGF1 overlevede og kunne genoptage prolifererende under behandling en høj koncentration af gefitinib.

Sphere-dannende evne og tumorfremkaldende i GRP blev opreguleret og Sphere Stiftelse ved GRP Øget efter udsættelse for hypoxiske betingelser

for yderligere at evaluere stemness af GRP, sphere- danner analyser, der afspejler selvfornyelse aktivitet og

in vivo

tumorigenisitetsforsøg blev udført. Evnen til at danne sfærer var signifikant højere i PC9 GRP end i parentale celler (figur 3A). Vigtigere, hypoxi markant øget antallet af kugler af PC9 GRP (figur 3A). Sfære størrelse PC9 GRP under hypoxiske betingelser var signifikant større end parentale celler (figur 3B). Immunofluorescens Resultaterne viste, at kugler af GRP var positive for CD133, Oct4, og phosphoryleret IGF1R (figur 3C). Desuden har vi injiceres 1 x 10 celler eller 1 × 10

2 celler af forældrenes PC9 celler og normoxisk og hypoxiske GRP i begge flanker af nog mus og sammenlignede tumorigent potentiale

in vivo

. Tumor forekomster af normoxisk og hypoxiske GRP i mus var højere end i forældrenes celler (tabel 1). Især normoksiske og hypoxiske GRP dannet tumorer i to og fem ud af 16 Nog mus ved 1 × 10 celler /injektion, henholdsvis, selvom de parentale celler ikke danne tumorer (tabel 1). Forskellen i tumordannelse mellem forældrenes celle gruppen og hypoxiske GRP gruppe med injektion af 1 x 10 celler var statistisk signifikant (* p = 0,040). Tilsammen tyder disse resultater på, at GRP beriget for stemness markører har karakteristiske træk fra stamceller fænotype, og at den hypoxiske mikromiljø opreguleret og vedligeholdt stamceller egenskaber GRP, såsom kugle-dannende evne og tumorgenicitet.

PC9 parentale celler, GRP, og hypoksiske GRP blev fremstillet ved densiteter på 2,5 x 10

3 celler pr 2 ml per brønd i serumfrit medium suppleret med vækstfaktorer og podet i 6-brønds ultralave montagepladerne. PC9 forældrenes celler og GRP blev inkuberet under normoxiske betingelser, mens PC9 hypoxiske GRP blev dyrket under hypoxiske betingelser. Dyrkningsmedium blev tilført hver 3. dag. Antallet og størrelsen af ​​sfærer blev registreret og immunfluorescens blev udført 7 dage efter starten af ​​dyrkningsperioden. Sfærer blev fikseret og inkuberet med primære antistoffer mod CD133, Oct4 eller phosphoryleret IGF1R (pIGF1R), og derefter med sekundært antistof mærket med Alexa Fluor 594 ged anti-mus IgG (rød) eller Alexa Fluor 488 ged anti-kanin IgG (grøn) . Cellekerner blev farvet med DAPI (blå). Billeder blev opnået på en Axioplan 2 imaging system med AxioVision software. A. Antallet af kugler blev øget betydeligt i PC9 GRP forhold til i forældrenes celler, og blev yderligere forøget i PC9 hypoxiske GRP. * P 0,01, # p 0,05. B. Sphere størrelse PC9 hypoxiske GRP var signifikant større end den af ​​parentale celler. # P 0,05. C. Immunofluorescerende billeder af kontrol celler PC9 (til venstre) og kugler af GRP (til højre) for CD133, Oct4, og pIGF1R.

Befolkning af CD133- og Oct4-positive GRP blev Øget under hypoxiske betingelser

for at undersøge betydningen af ​​hypoxi på generering og vedvarende gefitinib-resistente stamceller befolkning, vi evaluerede CD133- og Oct4-positive GRP under normoxiske og hypoxiske betingelser ved hjælp immunofluorescens. Som vist i figur 4A og 4B, hypoksi forøgede signifikant population af CD133- og Oct4-positive GRP i PC9 og HCC827 celler.

A, B. PC9 eller HCC827 celler, der vokser på Lab-Tek chamber slides med eller uden 1 eller 2 uM gefitinib og under normoxiske eller hypoxiske betingelser i 72 timer, fikseret og inkuberet med de primære antistoffer mod CD133 (A) og Oct4 (B), og derefter med sekundært antistof mærket med Alexa Fluor 594 ged anti-mus IgG (rød). Cellekerner blev farvet med DAPI (blå). Billeder blev opnået på en Axioplan 2 imaging system med AxioVision software. Billeder, der bruges til at sammenligne forældrenes celler, GRP og hypoxiske GRP blev erhvervet ved hjælp af de samme instrumentets indstillinger og eksponeringstider og blev behandlet på samme måde. Antallet af CD133 og Oct4-positive celler blev talt, og forholdet mellem disse celler blev beregnet i fem felter i hvert eksperiment. ** P 0,001, * p 0,01, # p. 0,05

IGF1R blev aktiveret på GRP under hypoxiske betingelser, og Knockdown af IGF1 Nedsat Befolkningens af CD133- og Oct4-positive Hypoxiske GRP

for at undersøge effekten af ​​hypoxi på aktiveringen af ​​IGF1R, undersøgte vi genekspressionen af ​​IGF1 i GRP ved qPCR samt fosforylering af IGF1R på GRP bruger immunfluorescens under normoxiske og hypoxiske betingelser. Som vist i figur 5A, IGF1 mRNA-ekspression var meget højere i PC9 GRP end i parentale PC9 celler og blev opreguleret ved udsættelse for hypoxiske betingelser. Vigtigere, blev phosphoryleret IGF1R udtrykt på PC9 GRP, og eksponering for hypoxi markant opreguleret populationen af ​​phosphorylerede IGF1R-udtrykkende PC9 GRP (figur 5B).

A. Kvantitativ RT-PCR blev udført med primere specifikke for IGF1 i PC9 eller HCC827 parentale celler, GRP og hypoksiske GRP. Data blev normaliseret til actin ekspression. ** P 0,001. B. PC9 celler, dyrket på Lab-Tek chamber slides med eller uden 1 pM gefitinib og under normoxiske eller hypoxiske betingelser i 72 timer, fikseret og inkuberet med de primære antistoffer mod phosphoryleret IGF1R (pIGF1R) og derefter med sekundære antistoffer mærket med Alexa Fluor 488 ged anti-kanin IgG (grøn). Cellekerner blev farvet med DAPI (blå). Billeder blev opnået ved hjælp af et Axioplan 2-system billeddannelse med AxioVision software. Billeder bruges til at sammenligne PC9 forældrenes celler, GRP, og hypoxiske GRP blev erhvervet med samme instrumentets indstillinger og eksponeringstider, og blev behandlet på samme måde. Antallet af pIGF1R-positive celler blev talt, og forholdet mellem disse celler blev beregnet i fem felter i hvert eksperiment. ** P 0,001. C. IGF1 udtryk blev slået ned i PC9 eller HCC827 hypoxiske GRP ved hjælp små interfererende RNA (siRNA) i Lab-Tek kammer dias. Immunofluorescens-farvning for pIGF1R, CD133, eller Oct4 blev derefter udført. To specifikke siRNAs og en ikke-specifik kontrol blev anvendt. Antallet af pIGF1R-, CD133- og Oct4-positive celler blev talt, og forholdet mellem disse celler blev beregnet i fem felter for hvert eksperiment. ** P 0,001, * p. 0,01

For at tydeliggøre den biologiske betydning af IGF1 i gefitinibs modstand i vores hypoksisk celle model, vi bankede ned IGF1 udtryk i hypoxiske GRP af PC9 og HCC827 celler ved hjælp to forskellige specifikke siRNA’er (# 1 og # 2, Figur S3 i Information S1). Som vist i figur 5C, knockdown af IGF1 væsentligt reduceret phosphorylerede IGF1R-udtrykkende GRP, og faldt CD133- og Oct4-positive GRP under hypoxiske betingelser. Disse resultater tyder på, at IGF1 spiller en rolle i aktiveringen af ​​IGF1R og vedligeholdelse af gefitinib-resistente CSCS.

Hypoxi Regulerer IGF1 Expression gennem HIF1α, og hæmning af HIF1α eller IGF1R Nedsat CD133- og Oct4-positive GRP Under hypoxi

for yderligere at undersøge virkningerne af hypoxi på opregulering af IGF1 og aktivering af IGF1R, nedreguleret vi hypoxi-inducerbare faktor 1α (HIF1α) udtryk i hypoxiske GRP ved hjælp af specifikke HIF1α inhibitor YC-1. Behandling med YC-1 inhiberede HIF1α ekspression betydeligt i både PC9 og HCC827 celler under hypoxi på en dosis-afhængig måde (Figur S4 i Information S1). Som vist i figur 6A, inhiberingen af ​​HIF1α af YC-1 behandling undertrykkes også IGF1-ekspression i hypoxiske GRP, og signifikant reduceret IGF1R phosphorylering på GRP under hypoxi. Desuden YC-1 behandling faldt betydeligt befolkningen i CD133- og Oct4- positive hypoxiske GRP. Endelig behandling med IGF1R inhibitoren AEW541 faldt betydeligt befolkningen i CD133- og Oct4-positive GRP på en dosis-afhængig måde efter gefitinib eksponering under hypoxiske betingelser (figur 6B). Desuden blev antallet af kolonier, der består af GRP undertrykt signifikant med AEW541 under hypoxiske betingelser (figur 6C). Tilsammen disse resultater tyder på, at hypoxi regulerer IGF1 udtryk gennem HIF1α, og at opreguleret IGF1 inducerer aktivering af IGF1R og øger gefitinib-resistente CSCS i

EGFR

mutation-positive NSCLC celler under hypoxi.

A. HIF1α udtryk blev undertrykt i PC9 eller HCC827 hypoxiske GRP ved behandling med 50 pM, 100 pM og 200 uM YC-1 i Lab-Tek kammer dias. Immunofluorescens-farvning for IGF1, phosphoryleret IGF1R (pIGF1R), CD133, og Oct4 blev derefter udført.