PLoS ONE: kemoresistens i Prostata Cancer Cells reguleres af miRNA og Hedgehog Pathway

Abstrakt

Mange prostatakræft tilbagefald på grund af dannelsen af ​​kemoresistens rendering first-line behandling narkotika ligesom paclitaxel (PTX) ineffektiv. Nærværende undersøgelse har til formål at fastlægge den rolle, miRNA og Hedgehog (Hh) vej i kemoterapi prostatakræft og vurdere kombinationsbehandling ved anvendelse Hh inhibitor cyclopamin (CYA). Undersøgelser blev udført på PTX resistent DU145-TXR og PC3-TXR cellelinier og kliniske prostatavæv. Drug følsomhed og apoptose analyser viste signifikant forbedret cytotoksicitet med kombination af PTX og CYA. For at skelne tilstedeværelsen af ​​cancer stamceller gerne side populationer (SP), blev Hoechst 33342 flowcytometri anvendte metode. PTX resistent DU145 og PC3-celler, såvel som human prostatacancer væv besidder en særskilt SP fraktion. Næsten 75% af SP cellerne er i den G0 /G1-fasen i forhold til 62% for ikke-SP-celler og har højere ekspression af stamcellemarkører samt. SP cellefraktion blev øget følgende PTX monoterapi og behandling med CYA eller CYA plus PTX reduceres effektivt deres antal tyder effektiviteten af ​​kombinationsbehandlingen. SP fraktion celler fik lov til at differentiere eller analyseres igen af ​​Hoechst farvning og genekspression analyse. Sende differentiering, SP celler udgør 15,8% af de samlede levedygtige celler, som aftager til 0,6% ved behandling med CYA. Ekspressionsniveauerne af P-gp efflux protein, blev også signifikant reduceret ved behandling med PTX og CYA kombination. MicroRNA analyse af DU145-TXR og PC3-TXR celler og prostatakræft væv fra patienter viste nedsat ekspression af tumor suppressor miRNA som miR34a og miR200c. Behandling med PTX og CYA kombination restaureret udtryk for miR200c og ​​34a, der bekræfter deres rolle i modulerende kemoresistens. Vi har vist, at supplere mitotiske stabilisator stoffer som PTX med Hh-hæmmer CYA kan vende PTX kemoresistens og eliminere SP fraktion i androgen uafhængige, metastatisk prostatacancer cellelinjer

Henvisning:. Singh S, Chitkara D, Mehrazin R , Behrman SW, Wake RW, Mahato RI (2012) kemoresistens i Prostata Cancer Cells reguleres af miRNA og Hedgehog Pathway. PLoS ONE 7 (6): e40021. doi: 10,1371 /journal.pone.0040021

Redaktør: Wing-Kin Syn, Institut for Hepatology London, England

Modtaget: Januar 26, 2012; Accepteret: 30. maj 2012; Udgivet: 29 juni, 2012 |

Copyright: © 2012 Singh et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde understøttes af en Idea Award (W81XWH-10-1-0969) fra Institut for Defense Prostata Cancer Research Program. Finansiel støtte fra Kosten Foundation (www.kostenfoundation.com) er også taknemmeligt anerkendt. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den næststørste årsag til kræft dødsfald hos mænd i USA [1]. Mens anti-androgen terapi er i øjeblikket den første linje i behandling for patienter diagnosticeret med prostatakræft, vil de fleste patienter tiden udvikle androgen-uafhængige form for prostatacancer, som er meget metastatisk og har dårlig prognose [2]. Mikrotubulus stabilisatorer, såsom PTX er effektive til behandling af patienter diagnosticeret med androgen-uafhængig prostatacancer [3]. Mens kliniske forsøg har vist den indledende effekt af taxaner i stigende overlevelse hos patienter med prostatacancer [4], der i øjeblikket få effektive metoder til behandling af kemoterapi prostatakræft.

De fleste tumorer er heterogene og er sammensat af bulk og tumor initierende celler (tics) med sidstnævnte danner en distinkt subpopulation i mange cancertyper. Tics er ofte omtalt som kræft stamceller (CSCS) og er ansvarlige for tumor initiering, selvfornyelse, og kemoresistens [5], [6]. Mange prostatakræft tilbagefald på grund af tilstedeværelsen af ​​meget kemoresistent tumorfremkaldende /cancerstamceller [7], [8]. Kemoresistens til lægemidler mod cancer, herunder PTX, af disse celler kan bidrage med narkotikarelaterede effluxpumper der effektivt kan fjerne lipofile molekyler, herunder hydrofobe anticancer narkotika. Denne iboende egenskab ved kemoresistent celler anvendes til identifikation og isolering af en side befolkning (SP), som er en type af cancer stamceller. SP fraktionen, indledningsvis identificeret ved Goodell, er en lille subpopulation af celler med beriget stamcelleaktivitet og er kendt for at demonstrere markant lave niveauer af Hoechst 33342 farvestof farvning [9]. SP fraktion celler har vist sig at være ufølsomt over for forskellige kemoterapeutiske lægemidler [10] på grund af deres evne til effluxing kemoterapi narkotika (og lipofile farvestoffer, såsom Hoechst 33342) på grund af den høje ekspression af ATP-bindende kassette familien, såsom MDR1 (P glycoprotein) og ABCG2 [11]. Kemoterapi SP celler vil overleve og opretholde deres clonogenicity under indledende eksponering for cytostatiske lægemidler, hvorved sygdommen tilbagefald, når behandlingen seponeres. Disse delmængder af CSCS således betragtes som et muligt mål for forbedret terapeutisk intervention og forebyggelse kemoresistens og kræft tilbagefald.

Udviklingen af ​​kemoresistens gennem en stigning i antallet af kræft stamceller lignende celler, herunder SP fraktioner er blevet tilskrevet ændringer i niveauet af microRNA (miRNA) i forskellige cancertyper. Disse ikke-kodende RNA-molekyler kan fungere som onkogener samt tumorsuppressor [12], [13], [14]. Dysregulering af miRNA er blevet impliceret i tumorigenese og medikamentresistens samt. Nyligt arbejde af Cochrane et al. har identificeret miRNA involveret i modulering kemoresistens i flere kræftformer [15].

I vores foreliggende undersøgelse vi hypotese, at kemoresistens til PTX i metastatiske prostatacancerceller kunne skyldes den ændrede miRNA ekspression i disse celler, og at kombination af antimitotiske lægemiddel med et andet lille molekyle, som inhiberer CSCS er sandsynligvis vil være effektive i ikke bare reverterende kemoresistens ved at undertrykke CSCS men også målrette miRNA involveret i kemoresistens. , Mens svigt af traditionelle kemoterapi skyldes manglende ødelægge CSCS /SP fraktioner, et kombinatorisk tilgang er således forventes at give bedre resultater, da CSC-inhibitor vil dræbe pluripotente cancerceller og vil tillade den antimitotiske lægemiddel (i dette tilfælde PTX) at angribe bulk-tumorceller. Til dette formål har vi kombineret PTX med cyclopamin (CYA), en naturlig steroide alkaloid som hæmmer Hedgehog (Hh) pathway resulterer i nedsat proliferation og øget apoptose [16]. I de senere år har Hh signalvej været impliceret i udviklingen og spredningen af ​​prostatacancer [17], [18]. Beviser har også indikeret, at Hh signalering understøtter androgen signalering og androgen-uafhængig vækst i prostata kræftceller i en lav androgen miljø [19]. Inhibering af Hh-pathway resulterer i nedregulering af gener involveret i stamcelle selvfornyelse samt regression af prostata tumor uden tilbagefald [20]. Kombination af docetaxel med CYA og epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) inhibitor gefitinib induceret større antiproliferative og apoptotiske effekter på SP cellefraktioner isoleret fra metastatisk prostatacancer celler end de enkelte lægemidler [21]. Vi har for nylig vist, at tilsætning af EGFR-inhibitor lapatinib kan øge effektiviteten af ​​PTX til induktion af apoptose i en paclitaxel-resistente, androgen-uafhængig metastatiske prostatacancerceller line DU145-TXR, både

in vitro

samt i xenotransplantattumorer [22].

for at forstå fænomenet kemoresistens, i nærværende undersøgelse har vi brugt androgen uafhængige (AI) metastatisk prostatacancer cellelinjer DU145 og PC3 og deres PTX-resistente versioner, DU145-TXR og PC3-TXR hhv. Vi har vist, at kan moduleres PTX modstand prostatacancerceller på niveauet for miRNA. Vi demonstrerer endvidere, at kombinationsbehandling med CYA og PTX effektivt kan reducere cellernes levedygtighed, mindske SP-cellefraktion ved doser langt lavere end ved cya monoterapi og impact miRNA formodet involveret i modulerende kemoresistens. Vores data viser, at kombinationsbehandling involverer tilskud af PTX med HH-hæmmere kan målrette specifikke miRNA og kræft stamceller ligesom SP cellepopulationer ved doser, der er effektive i kombination, men ikke i monoterapi. Denne fremgangsmåde kan repræsentere en bedre tilgang til at forebygge metastaser og tilbagefald i prostatacancer, da det er mindre sandsynligt, at være giftige og vil præsentere med langt færre bivirkninger for patienten, sikre en bedre overholdelse og reducere chancerne for en gentagelse.

Materialer og metoder

Materialer

PTX og CYA blev købt fra LC Labs (Woburn, MA). SYBR Green real-time PCR Master Mix og revers transskription reagenser blev indkøbt fra Applied Biosystems (Foster City, CA). Gede-anti-kanin-P-gp-antistof og tilsvarende sekundære antistof blev købt hos Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Alle andre kemikalier blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) og anvendt som modtaget, medmindre andet er angivet.

Cellelinjer

menneskelige metastatisk prostatacancer cellelinjer DU145 og PC3 og deres PTX resistente udgaver DU145-TXR og PC3-TXR var en slags gave fra professor Evan T. Keller (University of Michigan). Alle cellelinier blev holdt i RPMI kulturmedie suppleret med 1% penicillin /streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco) i en befugtet inkubator indeholdende 5% CO

2 ved 37 ° C som beskrevet tidligere [22] .

Menneskelig prostata tissue

Menneskelig prostata væv (kræft og godartet) blev indhentet fra de Veterans Affairs (VA) Hospital, Memphis, TN efter etablerede protokoller og i overensstemmelse med informeret samtykke afkald forudsat af Institutional Review Board (IRB) ved UTHSC og på VA Hospital. Prostatavæv blev taget under anvendelse af en 18-gauge kerne nål biopsi pistol og en del af dette væv blev skyllet og enten lynfryses i flydende nitrogen og derefter opbevaret ved -80 ° C eller anbringes i kolde serumfrie RPMI-medium indeholdende antibiotika til fremstilling af enkelt cellesuspensioner. Væv blev klassificeret som ondartet eller godartet baseret på Diagnosen stilles ved en patolog.

Drug følsomhed og apoptose analyser i DU145-TXRCells

For at bestemme omfanget af cellulære apoptose efter medicinsk behandling, DU145- TXR celler blev udpladet i plader med 6 brønde (7,5 x 10

5 celler /brønd). Efter 24 timer blev mediet fjernet og frisk medium indeholdende forskellige koncentrationer af PTX, CYA eller deres kombinationer blev tilsat. Cellerne blev derefter farvet med Annexin-V og propidiumiodid (PI) ved hjælp af Vybrant Apoptose Assay Kit som pr producentens protokol (Molecular Probes). Kort fortalt blev cellerne trypsineret, vasket to gange med kold PBS og pelleteret ved centrifugering ved 800 rpm i 5 min. Pellets blev resuspenderet i 100 pi 1X Annexin bindingsbuffer og 5 pi fluoresceinisothiocyanat (FITC) -Annexin-V. Propidiumiodid (100 ug /ml) blev tilsat til hver 100 pi cellesuspension. De farvede celler blev straks analyseret ved flowcytometri.

DU145-TXR celler blev også anvendt til at bestemme cellevækstinhiberingen evne PTX og CYA. Celler (5 x 10

3 /brønd) blev podet i 96-brønds celledyrkningsplader og inkuberet i 24 timer for at tillade cellevedhæftning. Medium blev derefter erstattet med frisk medium indeholdende PTX (0,5 /1 uM) eller CYA (10/25 uM) eller kombination (PTX 0,5 uM og 10 uM CYA) og inkuberet yderligere i 48 timer ved 37 ° C /5% CO

2. Cellelevedygtighed blev derefter vurderet ved MTT-assayet. Til dette blev mediet fjernet og cellerne blev vasket med PBS og 200 pi frisk medium indeholdende 3- (4,5-dimethyl-thiazol-2-yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium (MTT) (0,5 mg /ml ) blev tilsat efterfulgt af inkubation ved 37 ° C /5% CO

2 i 4 timer. Efter 4 timer blev mediet fjernet og dannede formazan krystaller blev opløst i 200 pi DMSO og absorbansen blev målt ved 560 nm. Cellernes levedygtighed blev beregnet ud fra følgende formel:

DMSO blev brugt til at opløse PTX og CYA og DMSO kontroller blev inkluderet i alle forsøg

Side Befolkning analyse og cellesortering ved FACS

Side population analyse i DU14-TXR og PC3-TXR cellelinjer blev udført under anvendelse af Hoechst 33342 flowcytometri metode. Kort fortalt blev adhærente celler trypsiniseret og vasket med phosphatpufret saltvand (PBS). Celler (1 x 10

6 celle /ml) blev derefter suspenderet i RPMI-medium suppleret med 2% FBS og 1 mM HEPES puffer med eller uden lægemiddelopløsninger (Verapamil, PTX eller PTX + CYA). Hoechst 33342 (5 pi; 1 mg /ml) farvestof blev derefter tilsat efterfulgt af inkubation i 90 minutter ved 37 ° C. Celler blev udvundet ved centrifugering og vasket adskillige gange med PBS for at fjerne ubundet farvestof og til slut suspenderet i iskold PBS indeholdende 2% FBS. SP fraktion i kliniske prøver blev analyseret som beskrevet ovenfor med yderligere trin. Kort beskrevet blev frisk reseceret prostatavæv skyllet, mekanisk hakket og fordøjet i 4 timer ved 37 ° C med 100 U /ml collagenase IV (Worthington Biologicals) i serumfrit RPMI. Vævet blev ofte pipetteret med en 5-ml serologisk pipette og ved afslutningen af ​​inkubationen fordøjelsen blev ledt gennem en 18.5- gauge nål, centrifugeret kort og supernatanten sigtet gennem en 100 um cellefilter til opnåelse enkelt cellesuspension. Fortyndede enkelt celle suspensioner blev derefter ført en gang gennem 40 um mesh filter, deres levedygtighed vurderes ved trypanblåt-farvning og holdt på is indtil analyse.

Celler dyrket i 6-brønds plader blev behandlet med A) 0,3% DMSO, B) 0,5 uM PTX C) 10 uM CYA, D) 25 uM CYA, E) 0,5 uM PTX 10 uM CYA for 48 timer og F) i DU145-TXR celler efter forskellige lægemiddelbehandlinger. Efterfølgende blev cellerne trypsiniseret, vasket med PBS og farvet med Annexin V-FITC og PI før apoptotisk analyse ved flowcytometri. A-E er repræsentative plots fra tre individuelle eksperimenter. Data i panel F er kvantificering af% celledød og repræsenterer middelværdi ± SD (n = 3). *

s

0,05 vs. kontrol. For MTT-assayet (fig. 1G) blev celler dyrket i 96-brønds plade blev behandlet med angivne koncentration af lægemidler i 48 timer. Efterfølgende blev MTT-reagens i PBS tilsat, og inkubation blev udført i yderligere 4 timer. Den resulterende formazan produkt blev solubiliseret i DMSO, og farveintensiteten blev bestemt ved anvendelse af en pladelæser. En statistisk signifikant forskel (*

s

værdi 0,05) blev observeret, når kombinationen af ​​0,5 uM PTX og 10 pM CYA blev brugt. Cell Levedygtighed = A

test /A

controlX100. Data er middelværdierne ± SD (n = 4). PTX, Paclitaxel; CYA, Cyclopamin.

Cell Cycle analyse

Flowcytometri blev brugt til at bestemme procentdelen af ​​celler i forskellige vækst cyklusser. Celler (5 x 10

5) opnået efter sortering blev vasket med PBS og fikseret med ethanol (70%) ved 4 ° C natten over efterfulgt af behandling med RNase (1 mg /ml) og farvet med PI (10 ug /ml ). Procentdelen af ​​celler i forskellige cellecyklusfaser blev derefter bestemt.

A) DU145 celler, B) DU145-TXR celler, C) DU145-TXR celler behandlet med verapamil (10 uM, 90 min), D) DU145 -TXR celler behandlet med PTX (1 uM, 12 timer), E) DU145-TXR celler behandlet med CYA (20 uM, 12 timer), F) DU145-TXR celler behandlet med CYA og PTX (20 uM og 0,5 uM, henholdsvis , 12 h). Verapamil blev anvendt til gate SP fraktionen i alle paneler og vist som procentdelen af ​​hele levedygtige cellepopulation. Numeriske værdier, der er angivet, er middelværdien ± SD af tre individuelle eksperimenter. *

s

0,05 vs kontrol DU145 celler i (A). PTX, Paclitaxel; CYA, Cyclopamin.

A) PC3-TXR celler, B) Celler blev behandlet med verapamil (10 uM, 90 min), C) PC3-TXR celler behandlet med CYA (20 uM, 12 timer) eller, D) CYA og PTX (20 uM og 0,5 uM henholdsvis 12 timer). SP fraktionen, som blev elimineret ved behandling med verapamil blev gated (P8) i alle paneler og vist som procentdelen af ​​hele levedygtige cellepopulation. Numeriske værdier, der er angivet, er middelværdien ± SD af tre individuelle eksperimenter. *

s

0,05 vs kontrol DU 145 celler (A). PTX, Paclitaxel; CYA, Cyclopamin.

Efter flow sortering blev rene SP celler belagt og lov til at differentiere i 2 uger. Repræsentative mikrofotografier af SP (A) og NSP-celler (B) er vist med flere SP-celler besidder en fibroblastisk, langstrakt fænotype sammenlignet med NSP. Real time RT-PCR blev anvendt til at bekræfte højere ekspression af stamcellemarkører OLT 4 og NANOG og kræft stamcellemarkører CD133 og ALDH1 (C). Lignende metode blev brugt til at vise højere udtryk for pluripotens og efflux markør ABCG2 og lavere udtryk for MCM7 udskrifter i indledende SP-celler (SP), sammenlignet med blandede populationer post-differentiering (DIFF), hvor nedsat ABCG2 og øget MCM7 niveauer blev observeret (D) . Et sæt af celler blev også behandlet med 25 pM CYA i 48 timer. Efterfølgende blev cellerne trypsiniseret og re-farvet med Hoechst farvestof og analyseret ved flowcytometri. Post-differentiering, celler afledt af flow sorteret SP-celler havde en højere procentdel af SP cellefraktioner end tidligere opnået fra ikke-sorteret DU145-TXR celler. CYA behandling signifikant reduceret (

s Restaurant 0,001 over for kontrol) procentdelen af ​​SP fraktion celler fra 15,8 (± 2,1)% (Felt E) til 0,6 ± (0,09)% (Panel F). Repræsentative dot plots fra tre individuelle eksperimenter leveres. Data repræsenterer middel ± SD (n = 3).

In vitro differentiering undersøgelse

Evne af SP-celler til at differentiere blev bestemt ved dyrkning af rene cellefraktioner i en 6 plade brønd i 14 dage efter sortering. SP-fraktion celler fra DU145-TXR og PC-TXR (1 × 10

5 /brønd) blev podet i 6 brønds plade og får lov at vokse i RPMI kulturmedier tilsat 10% FBS. Efter 14 dage blev Hoechst-farvning og SP-analyse udført på behandlede eller ubehandlede cellepopulationer som beskrevet ovenfor. Genekspression analyse blev også udført på SP og ikke-SP celler både før og efter-differentiering.

Efter behandling, med forskellige lægemidler som beskrevet, blev samlet protein udvundet og adskilt af SDS-PAGE før sondering med P -gp antistof. Actin blev anvendt som en loading kontrol. En kombination af 0,5 uM PTX og 10 pM CYA var mere effektivt i nedregulering P-gp udtryk i lægemiddelresistente prostatacancerceller end monoterapi med enten CYA eller PTX på 10 og 0,5 uM koncentration. P-gp nedregulering med 25 pM CYA var næsten svarer til den opnået ved kombinationsbehandling. (B) Ekspression af Hh-vejen og stamcelle markørgener i DU145-TXR celler. Totalt RNA blev ekstraheret fra celler og revers transkriberet til cDNA. Real time RT-PCR blev udført ved anvendelse SYBR Green kemi og således opnåede Ct-værdier blev anvendt til at beregne den fold-change. Lægemiddelresistente DU145-TXR celler har højere ekspression af alle tre testede gener. PTX sensitive DU145 celler blev anvendt som kontrol og genekspression værdier for DU145-TXR celler blev normaliseret i forhold til kontrolværdierne. *

s

. 0,05 vs. kontrol

Western blot-analyse

Efter behandling blev DU145 TXR cellerne lyseret ved hjælp RIPA buffer og totalt protein blev bestemt anvendelse af Bio-Rad RC DC protein assay kit (Hercules, CA). SDS-PAGE blev derefter udført for at løse de proteiner, som derefter blev overført til Immobilon polyvinylidenfluorid (PVDF) membran under anvendelse iBlot tør blotting-systemet (Invitrogen, Carlsbad, CA). Blokering blev udført under anvendelse af 5% fedtfri tørmælk i 1X PBST (PBS indeholdende 0,05% Tween-20) i 1 time ved stuetemperatur. Membraner blev derefter inkuberet med primært antistof i 16 timer ved 4 ° C. Actin blev anvendt som lastning kontrol og målproteinet blev detekteret ved forøget kemiluminescens (ECL) detektion kit (GE Healthcare Life Sciences, PA).

Total RNA herunder miRNA blev isoleret fra DU145-TXR og DU145 celler (A ) eller PC3 og PC3-TXR celler (B) ved hjælp miRNEasy RNA isolation kit. SYBR Green baserede forløb-fokuserede miScript miRNA PCR Array (Qiagen, MD) blev anvendt til miRNA profilering undersøgelser. Pladerne blev kørt på en Roche Light Cycler 480® instrument og ekspressionen af ​​individuelle miRNA blev analyseret under anvendelse af de opnåede C

s værdier og ΔΔCt metoden. Tabel i indsatsen (C) bekræfter validering af miRNA profilering data miScript primer assay. Validering af miRNA profilering af data blev udført af en SYBR Green baseret real time RT-PCR-analyse af udvalgte miRNA. Som en normalizer, blev SNORD6 brugt som en husholdning miRNA. (D) Effekt af kombinationsbehandling om genoprettelse af miR 200 c og 34a blev bestemt ved at behandle DU145-TXR celler med PTX (0,5 uM) og CYA (10 uM) kombination for 48 timer, hvorefter totalt RNA blev ekstraheret, omdannet til cDNA og anvendt som template for miScript primer assay til bestemmelse ekspression af miRNA 200c og ​​34a. Ubehandlede DU145-TXR celler blev anvendt som kontrol for beregning fold ændring efter en SYBR Green real time RT-PCR assay. Data repræsenterer gennemsnit ± SD (n = 3). *

s

. 0,05 vs. ubehandlet kontrol

Real time RT-PCR

Total RNA blev ekstraheret fra sorterede og usorterede prostatacancerceller hjælp RNeasy RNA isolation kit (Qiagen, MD), efterfulgt af bestemmelse af kvaliteten af ​​denne ved NanoDrop 2000-instrumentet. Den blev derefter revers transkriberet til cDNA-skabelon som tidligere beskrevet [23]. cDNA (100 ng) blev derefter amplificeret ved real-time PCR under anvendelse SYBR Green farvestof universel mastermix på en lys Cycler 480 instrument (Roche, Indianapolis, IN) under anvendelse af primere for gener af interesse i fyrre cyklusser relative mængde af mRNA i forhold til S19 (housekeeping-gen) blev beregnet ved hjælp Crossing punkt (CP) værdier og skaleres i forhold til kontrol prøver fastsat til en værdi på 1. Resultater for genekspression i eksperimentelle prøver blev afbildet i forhold til kontrolgruppen. Salg

Adskillige gener involveret i kræftrelaterede biologiske processer og kendte mål for differentielt udtrykte miRNA i vores undersøgelse er ændret i PTX resistente DU145 TXR celler. Efter RNA-ekstraktion og SYBR Green baseret real time RT-PCR under anvendelse af specifikke gen primere, blev Cp-værdier beregnes og resistente DU145 celler blev anvendt til at normalisere ekspressionen af ​​enkelte gener. Dataene repræsenterer middelværdien ± SD (n = 3).

MicroRNA (miRNA) profilering og datavalidering

Total RNA, der omfatter små ikke-kodende miRNA blev isoleret fra ubehandlet og narkotika -behandlet DU145-TXR og DU145 celler eller PC3 og PC3-TXR celler under anvendelse miRNEasy RNA-isolering (Qiagen MD) efter producentens anvisninger. De samme reagenser blev anvendt til at isolere total RNA fra human prostata væv. Kort fortalt blev lynfrosset væv suspenderes i ekstraktionsbuffer og underkastet omhyggelig disintegration ved anvendelse af en håndholdt elektrisk homogenisator i 30’erne ved en indstilling lav-til-middel hastighed. Homogenatet blev centrifugeret i 3 minutter ved 4 ° C og supernatanten blev anvendt til at ekstrahere total RNA. Post-isolation blev RNA kvalitet bestemmes ved hjælp af en NanoDrop 2000 instrument.

(A) human prostatacancer væv blev omdannet til enkelt-suspensioner, som beskrevet i “Methods”. Celler blev farvet med Hoechst-farvestof og analyseret som beskrevet tidligere. Næsten 1% af den samlede levedygtige cellepopulation var gated som SP-fraktionen. (B) Totalt RNA blev isoleret fra et andet sæt af humane prostatavæv (cancer og godartede) under anvendelse miRNEasy RNA-isolering kit. SYBR Green baserede forløb-fokuserede miScript miRNA PCR Array (Qiagen, MD) blev anvendt til miRNA profilering undersøgelser. Pladerne blev kørt på en Roche Light Cycler 480® instrument og ekspressionen af ​​individuelle miRNA blev analyseret under anvendelse af de opnåede c

t-værdier og ΔΔCt metoden. Folden ændringer i tumorvæv blev normaliseret i forhold til benign prostata væv. (C) Tabel i indsatsen bekræfter validering af miRNA profilering data miScript primer assay. Validering af miRNA profilering data blev udført ved RT-PCR estimering af udvalgte miRNAs200c, 34a og 29b. SNORD6 blev brugt som en husholdning miRNA for data normalisering.

For miRNA profilering undersøgelser, SYBR grøn baseret sti-fokuserede miScript miRNA PCR Array (Qiagen, MD) blev anvendt. Kræft pathway array (katalognummer 102ZF) muliggør samtidig påvisning af 84miRNAs tidligere identificeret i humane cancere, såvel som passende husholdning assays og kontroller RNA kvalitet. Assayet blev udført ifølge producentens protokol. Tre hundrede nanogram (ng) af total RNA blev konverteret til cDNA under anvendelse miScript II RT Kit. Fortyndet cDNA blev blandet med universel primer og SYBR Green farvestof og tilsat til brøndene i 96-brønds plader indeholdende lyofiliseret primer. Pladerne blev kørt på en Roche Light Cycler 480®instrument og ekspressionen af ​​individuelle miRNA blev analyseret under anvendelse af de opnåede c

t-værdier. Den fold ændring for hver miRNA blev beregnet ved at tilslutte de C

p-værdier i producentens web-baseret software. DU145 celler eller PC3 celler, såvel som godartede prostata prøver blev betragtet som “kontrol” med henblik på at beregne den fold ændring i DU145-TXR og PC3-TXR celler og kræft prostata væv, hhv. eksisterer Endogene kontroller, RT negative og positive kontroller, og genomisk DNA forurening kontroller blev også testet for hvert array.

Betydelig indbyrdes forhold mellem kemoresistens, epitelial til mesenkymale overgang og metastase, der negativt påvirkninger behandlingsresultater. Kemoresistens, et centralt element i CSCS og celler undergår EMT, er reguleret af dysregulering af miRNA. Vores foreslåede kombinationsbehandling med PTX og CYA samtidig henvender CSCS og bulk kræftceller, vender EMT og genskaber udtryk for miRNA ændret under generering af kemoresistens og er en levedygtig strategi til behandling af resistente prostatakræft.

Validering af miRNA profilering af data blev gjort ved real-time PCR-estimering af udvalgte miRNA. For hver af de valgte miRNA, blev en miScript PCR-primer købt hos Qiagen. Denne assay mål kun modne miRNA, ikke deres forstadier. Som en normalizer, blev SNORD6 brugt som en husholdning miRNA. Kort fortalt blev fortyndet cDNA anvendt til miRNA anvendt som en skabelon i nærvær af SYBR Green farvestof, universal primer og miScript primer. Pladen blev kørt som beskrevet ovenfor og fold ændringer i miRNA-ekspression blev beregnet ved anvendelse C

t værdi normalizer kontrol. En lignende fremgangsmåde blev anvendt til måling ekspression af miR200c og ​​miR 34a i DU 145-TXR celler behandlet med 0,5 uM PTX + 10 uM CYA. Efter behandling, total RNA blev isoleret, omvendt transskriberet til cDNA og anvendes til at måle miRNA udtryk som beskrevet ovenfor.

Statistisk analyse

Alle værdier i de tal og tekst blev udtrykt som middelværdi ± SD . Resultaterne blev analyseret og enkelte tilknyttede midler blev sammenlignet med Students uparrede

t

-test. En

s

værdi på mindst 0,05 blev betragtet som signifikant og er angivet med en stjerne (*).

Resultater

Kombination af CYA og PTX reducerer cellernes levedygtighed og forbedrer apoptose i lægemiddelresistente prostatacancerceller

evne kombinationskemoterapi at hæmme væksten af ​​PTX resistent prostatacancer-cellelinie blev bedømt ved cellelevedygtighed og apoptose-assay. Det blev observeret, kombination af PTX og CYA signifikant (

s Drømmeholdet værdi 0,05) fald cellelevedygtighed til 40% i forhold til enten PTX eller CYA alene (figur 1, panel A-F.). Lignende resultater blev opnået i Annexin V celledød assay, hvor kombinationsterapi resulterer i en signifikant højere celledød sammenlignet med enkelt middel kemoterapi (fig. 1, G). Mens en kombination af PTX og CYA resulterede i næsten 70% af cellerne dør, den procentvise celledød observeret med PTX eller CYA monoterapi var 15% og 25%. Men behandling med 25 pM CYA var signifikant mere effektiv end kontrol og resulterede i næsten 40% celledød.

eksisterer Side Befolkning fraktioner i PTX resistent prostatacancerceller og har unikke genekspression

Figur 2 og 3 viser SP analyse af prostata cancer cellelinjer DU145-TXR og PC3-TXR hhv samt effekten af ​​behandling med PTX og CYA. Kontrol DU145 celler har små mængder af SP (0,2%, fig. 2A), medens PTX resistente cellelinie DU145-TXR har ~3.2% af SP-celler (fig. 2B) som angivet ved Hoechst-farvning (

s Restaurant 0,05 i alle prøver). I PC3-TXR celler blev SP fraktionen markant reduceret efter behandling med CYA (fig. 3C) eller CYA og PTX kombination (fig. 3D). Real time RT-PCR analyse viser højere udtryk for pluripotens markører OCT4 og NANOG, og kræft stamceller markører CD133 og ALDH1 i SP fraktioner i forhold til ikke-SP (NSP) fraktioner i både DU145-TXR og PC3-TXR celler. Post-differentiering skæbne SP celler blev undersøgt ved real time RT-PCR og Hoechst farvning efter deres isolation og re-dyrkning. Disse celler differentieret til en blanding population omfattende SP og NSP fraktioner, som afveg i deres fænotype (Fig. 4, panel A og B, henholdsvis). Expression analyse af post-differentiering blandet-populationer indikerer reducerede udskrifter af ABC-transportør og kræft stemness markør ABCG2 og højere udtryk for celledeling markør minikromosom vedligeholdelse 7 (MCM7) i forhold til udifferentierede SP-fraktioner (Fig. 4D). Yderligere behandling af post-differentiering SP populationer med 25 pM CYA i 48 h resulterede i SP fraktionen markant faldende fra 15,8% (panel E) til 0,6% (panel F,

s

0,05). Tabel 1 viser cellecyklus analysere strømmen sorteret SP og NSP-celler. Det blev observeret, at 62% NSP-celler var i G0-G1 og 30% i S-fase i modsætning til 71,5% og 21% for SP-celler, henholdsvis (

s Restaurant 0,05).

Gene og proteinekspression i DU 145-TXR Celler

Ekspression af P-glycoprotein (P-gp) blev bedømt ved Western blotting.