PLoS ONE: En ti-MicroRNA Signatur identificeret fra en Genome Wide MicroRNA Expression Profilering i Human epithelial kræft i æggestokkene

Abstrakt

Epithelial ovariecancer (EOC) er den mest almindelige gynækologisk malignitet. At identificere mikro-ribonukleinsyrer (miRNA) udtryk profil i EOC væv, der kan tjene som en ny diagnostisk biomarkør for EOC detektion blev ekspressionen af ​​1722 miRNA fra 15 normale æggestokkene vævsprøver og 48 ovariecancer prøver profileret ved hjælp af en kvantitativ real -tids polymerasekædereaktion (QRT-PCR) assay. En ti-microRNA signatur (HSA-miR-1271-5p, HSA-miR-574-3p, HSA-miR-182-5p, HSA-miR-183-5p, HSA-miR-96-5p, HSA-miR- 15b-5p, HSA-mIR-182-3p, HSA-mIR-141-5p, HSA-mIR-130b-5p, og HSA-mIR-135b-3p) blev identificeret til at være i stand til at skelne humane ovariecancer væv fra normale væv med 97% sensitivitet og 92% specificitet. To miRNA klynger af miR183-96-183 (miR-96-5p, og miR-182, miR183) og miR200 (miR-141-5p, miR200a, b, c og miR429) er betydeligt opreguleret i æggestokkene kræft vævsprøver sammenlignet med dem for normale vævsprøver, hvilket tyder på disputatser miRNA kan være involveret i æggestokkene udvikling af kræft

Henvisning:. Wang L, Zhu MJ, Ren AM, Wu HF, Han WM, Tan RY, et al. (2014) En ti-MicroRNA Signatur identificeret fra en Genome Wide MicroRNA Expression Profilering i Human epithelial kræft i æggestokkene. PLoS ONE 9 (5): e96472. doi: 10,1371 /journal.pone.0096472

Redaktør: Liang-Hu Qu, Sun Yat-sen University, Kina

Modtaget: November 2, 2013; Accepteret: April 8, 2014; Udgivet: 9. maj 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Miao-Jun Zhu, Hong-Fei Wu, Wu-Mei Han, og RUO-Ying Tan er nuværende medarbejdere i Biovue. Ingen af ​​forfatterne har nogen økonomiske interesser. Alle data og materialer af denne undersøgelse er åbne for adgang. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Kræft i æggestokkene (OC), en af ​​de tre gynækologiske maligniteter, er den syvende mest almindelige kræft blandt kvinder verden over [1]. Nedarvning af høj penetrans kræft modtagelighed gener, såsom muterede BRCA1 eller BRCA2 og /eller Lynch syndrom-associerede mutationer udgøre en øget risiko for at udvikle OC [2]. Epiteliale kræft i æggestokkene (EOC) tegner sig for omkring 80-90% af p-piller [3]. EOC er den mest dødbringende gynækologiske malignitet i vestlige lande [4]. I De Forenede Stater (USA), EOC forårsagede næsten 15.500 dødsfald i 2012 [5]. Der er kun et par effektive biomarkører og terapier for EOC [6] – [8], og EOC tidlige påvisning stadig en udfordring for onkologer. Det 5-års overlevelse på mere end 70% af patienter med fremskreden fase EOC er kun 35% [5]. Ingen effektiv screening metode til at påvise tidlige fase OC med høj specificitet og følsomhed er i øjeblikket tilgængelig, og kræft antigen-125 sammen med transvaginal ultralydsscanning kan afsløre kun 30-45% af patienter med tidlig-stadie sygdom [9]. Omend deoxyribonukleinsyre (DNA) methylering biomarkører spiller en lovende rolle i forbindelse med afsløring EOC, er der stadig et stort behov for at identificere potentielle biomarkører med høj specificitet og følsomhed. De analytiske teknikker skal også være standardiseret for at forbedre afsløring, optimere behandlingen, og opnå ønskelige patientresultater [10].

rolle mikro-ribonukleinsyrer (miRNA) i OC har fået nylig opmærksomhed, da de tilbyder nye strategier for forebyggelse, tidlig påvisning, diagnosticering og behandling. De spiller en vigtig rolle i væsentlige processer såsom celledifferentiering, vækst og apoptose [11], [12]. Afvigende udtryk eller mutation af miRNA i kræft angivet deres potentiale til at fungere som en ny klasse af onkogener eller tumorsuppressorgener baseret på deres mål [13]. Da miRNA kunne isoleres og detekteres fra vævs- og blodprøver blev perifere blod-afledte miRNA anvendt som hidtil ukendte cirkulerende biomarkører for OC [14]. I de fleste publicerede undersøgelser blev miRNA ekspression profileret af miRNA microarray og bekræftet ved kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR).

Den foreliggende undersøgelse en genom-dækkende væv miRNA ekspression profilering ved kvantitativ realtids-PCR-reaktion. En profil af 10 væv miRNA blev fundet, der kan tjene som en biomarkør for EOC og bidrage til en bedre forståelse af mekanismen af ​​æggestokkene tumor tilblivelse og udvikling.

Materialer og metoder

Indsamling af OC vævsprøver

Normale epitelial æggestokkene vævsprøver (N prøver) (n = 15) og maligne epiteliale æggestokkene vævsprøver (C prøver) (n = 48) blev indsamlet på Zhongshan Hospital i Fudan University, Shanghai, Kina. De 48 maligne epiteliale æggestokkene vævsprøver (C prøver) omfattede 41 epiteliale ovariecarcinom prøver (CE prøver) og 7 epitelovariecancer grænsetilfælde vævsprøver (CB prøver). De 48 maligne epiteliale æggestokkene vævsprøver var af forskellige celletyper: 29 serøs, 6 blandet epitel, 6 endometrioide, 1 adenocarcinom (ikke andet er angivet), 4 klare celler og 2 mucinous karcinomer. Alle vævsprøver blev straks nedfrosset i flydende nitrogen efter at være blevet fjernet fra kroppen og opbevaret ved -80 ° C til langtidsopbevaring. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle fag, og forsøgsprotokollen blev godkendt af den etiske komité i Zhongshan Hospital. De demografi og kliniske træk ved patienter og normale kontroller er anført i tabel 1.

miRNA isolation

Total RNA blev isoleret fra 50 mg frosne væv med miRNeasy Mini Kit (

Qiagen, USA

) pr producentens anvisninger. Kvaliteten af ​​det isolerede RNA blev detekteret ved agarose-gelelektroforese, og mængden blev analyseret ved en ultraviolet spektrofotometrisk metode under anvendelse Biomate3 (

Thermo Scientific, USA

). De totale RNA’er med skarpe bånd af 18S rRNA og 28S rRNA betragtes som ikke-nedbrudt og anvendt til miRNA profilering.

Tilsætning af poly (A) haler og revers transkription

Det rensede totale RNA ( herunder små RNA) blev fortyndet til 125 ng /pl med 0,1x RNA opbevaringspuffer (Ambion, USA) indeholdende 0,1% Tween-20 (

Sigma

). miRNA blev sat en poly (A) hale og revers transskriberet til cDNA ved hjælp Sharpvue miRNA First Strand Kit (

Biovue, Shanghai, Kina

) pr instruktionerne i sættet. Koncentrationen af ​​total RNA i omsætningen af ​​tilsætning af poly (A) haler og revers transkription 50 ng /pl.

Real-time PCR

Det syntetiserede miRNA cDNA blev blandet med Sharpvue 2x Universal qPCR Master Mix (

Biovue, Shanghai, Kina

) og nuklease-frit vand. Den Sharpvue menneskelige miRNA Primer Array-A-E v1.0 384-godt (

Biovue, Shanghai, Kina

) blev anvendt, og real-time PCR blev udført pr instruktionerne i Sharpvue miRNA qPCR Kit. Hver prøve blev påvist ved 1757 miRNA primere herunder 35 kontroller i fem 384-brønds plader. Hver plade indeholder tre endogene kontrol (HSA-7SL-scRNA, HSA-RNU6B, og HSA-RNU48) i to eksemplarer og man ikke skabelon kontrol. miRNA udtryk niveauer blev kvantificeret ved hjælp af ABI 7900HT Hurtig Real-Time PCR System (

Applied Biosystems, USA

). Real-time PCR-reaktionen blev inkuberet ved 95 ° C i 2 minutter, efterfulgt af 3 cykler af 96 ° C i 5 sekunder og 60 ° C i 1 minut, 37 cykler af 96 ° C i 5 sekunder og 60 ° C i 30 sekunder, og kører smeltekurveanalyse i slutningen. EVA-grønt farvestof og Rox farvestof blev anvendt som reporter og reference hhv. Nærmere oplysninger om miRNA detektion er vist i figur S1 i filen S1.

Statistisk analyse

Data analyse blev udført ved hjælp af R og BioConductor pakker. Af de 1722 miRNA assays og 2 endogene kontrol assays (HSA-RNU6B og HSA-RNU48), 1696 miRNA havde Ct værdi under Ct = 32 (afsløring tærskel) blandt mindst 10% af de fundne 63 prøver. De resterende 28 assays blev fjernet fra yderligere analyse. For at fjerne forskelle i prøve RNA input blev Kvantil-Median metode anvendes til at behandle de rå Ct målinger [15]. Prøver, der viste signifikant forskel i profilerne (gennemsnitlig absolut forskel, BioConductor pakke “arrayQualityMetrics”) blev betragtet som outliers og blev fjernet fra downstream analyse. Denne procedure fjernede tre OC væv (to epitelcarcinom vævsprøver og en epitelial ovariecancer borderline vævsprøve) og en normal epitelial ovariecancer vævsprøve.

Differentiel ekspression analyse blev udført på de resterende 59 prøver ved anvendelse af t-test ( R-pakke “limma”). miRNA producerer falske opdagelse sats (FDR) -adjusted p-værdier under 0,1 og fold forandring over 2 blev kaldt differentielt udtrykte.

For at udvikle en forudsigelse algoritme til OC diagnose fra en population af prøver indeholdende 39 epitelial ovariecancer carcinoma væv sammen med 6 epitelial ovariecancer borderline væv og 14 normale epitel æggestokkene væv, tre klassifikationssystemer metoder blev testet: support vektormaskine (SVM, BioConductor pakke “E1071”), K-nærmeste naboer (BioConductor pakke “klasse”), og diagonal lineær diskriminant analyse (BioConductor pakke “sfsmisc”). Ydeevnen af ​​algoritmer blev indledningsvist evalueret under anvendelse leave-one-out krydsvalidering procedure for forskellige antal prædiktor markører. For hvert sæt af uddannelse prøver blev miRNA rangeret baseret på deres t-test p-værdi, der skabes ved sammenligning cancervæv mod normalt væv. Den øverste n miRNA (hvor n får lov til at ligge mellem 2 og 50) blev anvendt til at bygge en forudsigelsesmodel baseret på de oplysninger om uddannelse prøver og anvendes til den resterende testprøven. Forudsigelse klasse og sandsynlighed blev registreret for hver prøve og klassificering algoritme. Stabilitet af miRNA prædiktor lister bruges med uddannelse prøver blev evalueret af procent overlap af top n miRNA af disse lister. På grund af det begrænsede antal af prøver til rådighed for dette studie blev den fælles miRNA af disse lister valgt som den endelige liste over prædiktorer (udvalgte markører). Signifikante forskelle blev bestemt ved hjælp af t-test og anses for at være væsentlig, hvis P-værdi 0,05. I analysen er følsomhed defineres som den procentdel af kræft væv, som korrekt er identificeret som havende denne betingelse, mens specificitet er defineret som den procentdel af normale væv, som korrekt blev identificeret som normalt.

Resultater

kliniske og patologiske fund

de kliniske funktioner i de 45 patienter med OC og 14 normale kontroller, der anvendes i vores undersøgelse er sammenfattet i tabel 1. Ages af patienter med OC varierede fra 20 til 81 år (median, 57 år), mens normale kontroller varierede mellem 21 og 75 år (median, 56). Alle disse prøver blev diagnosticeret ved patologi og havde makroskopisk beskrivelse. Per 2012 Soft Tissue OC retningslinje af National Comprehensive Cancer Network, de forskellige tumor differentiering kvaliteter af patienterne i denne undersøgelse omfattede følgende: 8 tilfælde med grad I (16,7%), 11 sager med grad II (23%), 18 tilfælde med grad III (37,5%), og 11 tilfælde med ubestemt (23%); og tumor stadier var 14 tilfælde med stadium I (29,2%), 5 tilfælde med stadie II (10,4%), 27 sager med stadium III (56,3%), og 2 sager med stadie IV (4,2%) kræftformer.

miRNA udtryk sammenligning

for at fjerne forskelle i RNA-råmaterialer, der benyttes til at profilere de 63 æggestokkene vævsprøver i denne undersøgelse, blev Kvantil-Median metode [16] bruges til at behandle de rå Ct målinger. Samlet set blev data fra 59 æggestokkene vævsprøver analyseret for miRNA udtryk.

For at undersøge muligheden for at identificere en miRNA udtryk underskrift OC fra vævsprøver, miRNA udtryk profiler af 59 ovarievæv RNA-prøver indsamlet fra 39 prøver epitelcancer væv, 6 epitelovariecancer grænsetilfælde vævsprøver og 14 normale epitel- ovarievæv prøver blev analyseret under anvendelse af de 1696 miRNA assays påvist (Ct 32) i mindst 10% af prøverne i denne undersøgelse. De 45 oC væv blev sammenlignet med de 14 normale ovariale væv anvendelse af t-test. 305 miRNA viste sig at have FDR-justeret p-værdi under 0,1 og fold forandring over 2. Et resumé af disse resultater er vist i figur 1. differentielt udtrykte miRNA spændte over et stort udvalg af Ct-værdier og fold ændringer.

A) handlingen i miRNA analyser bruges til at profilere sammenlignet prøver: fold ændring (y-aksen) mod normaliseret Ct målinger. B) Volcano plot af de resulterende p-værdier af t-testen (y-akse) mellem grupperne C og N. 305 miRNA viser FDR-justerede p-værdier under 0,1 og fold forandring over 2 (vist med rødt). C) Hierarkisk klyngedannelse (R pakke pvclust) af de 45 kræft i æggestokkene væv og 14 ovarie normale væv baseret på top 50 mest variable miRNA analyser. For hver klynge i hierarkisk klyngedannelse, kaldet mængder

s

-værdier (ca. fordomsfri

s

-værdi (rød) og Bootstrap Sandsynlighed p-værdi (grøn)) opgøres via multi-skala bootstrap resampling.

P

-værdi af en klynge er en værdi mellem 0 og 1, som angiver, hvor stærk klyngen er understøttet af data. D) 17% af variansen observeret i Ct målinger af top 50 mest variable miRNA analyser på tværs af alle prøver kan forklares ved prøve patologi status (C eller N). De resterende kovariater betragtes her (kilde = hospital kilde, overlevelse, tumor histologi, FIGO stadie, tumor kvalitet, tilbagefald, og scene) forklare 24% af variansen.

Sammenligning af miRNA udtryk mellem forskellige typer af EOC vævsprøver

miRNA udtryk for de 59 vævsprøver, der blev sammenlignet omfattede 45 prøver, der omfatter C-gruppen [herunder 39 epitelial ovariecancer vævsprøver (CE gruppe) og 6 epitel ovariecancer borderline vævsprøver (CB gruppe)] og 14 normale epitel æggestokkene vævsprøver (N gruppe).

Den hierarkiske clustering af miRNA blev vist ved FDR-justerede p-værdier under 0,1 og fold-change over 2 (rød punkt). Sammenligningerne for 335 differentielt udtrykte miRNA i CE og N grupper er vist i figuren S2 i filen S1. I modsætning hertil sås ingen kandidat miRNA når CB gruppe blev sammenlignet med N-gruppen (fig S3 i filen S1), og når CE gruppe blev sammenlignet med CB-gruppen (fig S4 i filen S1). Det reducerede antal cancer grænsetilfælde væv til rådighed for denne undersøgelse kunne begrænse magten i detektere væsentlige ændringer, og forklare den manglende ændringer observeret i disse sammenligninger.

Biomarker valg

Nøjagtighed af de tre testede metoder for forskelligt antal prædiktor markører på mellem 2 og 50 er vist i figur 2. Forudsigelse nøjagtighed var forholdsvis ens mellem de anvendte metoder, og en bedre ydelse for modeller klassificering var baseret på reduceret antal miRNA-markører (figur 2A). Stabilitet (y-akse) målt som procent overlapning mellem listerne over miRNA markører anvendt til klassificering (59 i denne analyse, en for hver prøve anvendes til testning) er præsenteret i figur 2B som funktion af antal markører anvendes (x-akse ). Som forventet, overlappet mellem de valgte lister over miRNA prædiktorer steget til ca. 90%, når forudsigelse var baseret på 11 eller flere markører, hvilket tyder på en reduceret effekt i markør valg skridt fra individuelle prøver.

A) Fejl sats produceret af forskellige algoritmer klassificering som funktion af antallet af forudsigelse markører anvendt. Leave-one-out krydsvalidering fremgangsmåde blev anvendt til at estimere resulterende fejlrater. B) Procent overlapning af prædiktor miRNA udvalgt fra de forskellige uddannelser sæt prøver, der anvendes. C) Leave-one-out cross valideringsresultater: hver prøve klasse sandsynlighed (y-aksen) er estimeret baseret på SVM model lært fra alle andre prøver. Væv (cancer sort, normal rød) er repræsenteret ved klassificering sandsynlighed for at være kræft. D) ROC-kurve baseret på orlov-én-out cross valideringsresultater hjælp SVM metode.

miRNA screening og test mellem kræft i æggestokkene og normale grupper

De 10 fælles miRNA tværs af lister over brugte markører for forudsigelser baseret på 11 miRNA blev udvalgt som endelige liste over biomarkører for OC diagnose. Nogle karakteristika for disse miRNA, herunder gange ændring mellem kræft og normale væv sammen med t-test p-værdier og FDR-justerede p-værdier, er vist i tabel 2. De 10 miRNA inkluderet miR-1271-5p og miR-574 -3p, der havde betydeligt lavere ekspression (P-værdier er vist i tabel 2) niveauer i ovariecancer (C-gruppe) end i den normale gruppe. I modsætning hertil andre miRNA såsom miR-182-5p, miR-183-5p, miR-96-5p, miR-15b-5p, miR-182-3p, miR-141-5p, miR-130 B-5 p, og miR-135b-3p havde en signifikant højere udtryk niveau i æggestokkræft vævsprøve (C-gruppe) end i den normale gruppe (p-værdier er vist i tabel 2).

klassificeringen ydeevne udvalgt 10 miRNA til SVM algoritme efter brug af leave-one-out cross-validering procedure er præsenteret i figur 3. Da listen over udvalgte miRNA brugte alle prøver, kan ydeevnen præsenteres her være en overvurdering af den sande. Dette blev afspejlet i den forbedrede nøjagtighed forudsigelse ydeevne, når markør valg skridt var uafhængig af test sæt prøver (figur 3). Den observerede nøjagtighed var 86%, mens den observerede nøjagtighed for udvalgte markører var 96%. Følsomheden ved påvisning OC baseret på udvalgte markører var 97%, mens specificiteten var 92% med et areal under kurven (AUC) af den resulterende receiver operating characteristic (ROC) kurve på 0,978. Der blev ikke observeret nogen signifikante forskelle på tværs af de store kliniske faktorer indsamlet til prøver testet i denne undersøgelse (figur 3D)

A) Prediction sandsynligheder (kræft i æggestokkene) for hver prøve anvendt i denne undersøgelse (C = Cancer,. N = Normal). B) ROC-kurve. C) Forudsigelse fejl på tværs af forskellige væv grupper: normale væv (N), epiteliale carcinomer væv (CE) og borderline væv (CB). D) Forudsigelse fejl inden tumor lønklasse grupper [Øget fejl i lavere lønklasse prøver (men ikke signifikant)].

Diskussion

For at finde specifikke profiler af væv-afledte miRNA af EOC, en sammenlignende undersøgelse blev udført under anvendelse af en QRT-PCR-array platform mellem 45 epitelceller vævsprøver fra patienter med EOC og 14 epitelceller normale vævsprøver fra raske kontroller. Undersøgelsen viste, at 10 fejlreguleret miRNA signatur blandt hvilke HSA-miR-1271-5p og HSA-miR-574-3p var nedreguleret; og HSA-MIR-182-5p, HSA-MIR-183-5p, HSA-MIR-96-5p, HSA-MIR-182-3p, HSA-MIR-141-5p, HSA-MIR-15b-5p, HSA -miR-130b-5 p, og HSA-miR-135b-3p blev overudtrykt i kræft i æggestokkene væv. Disse resultater kunne effektivt skelne OC væv fra æggestokkene normale væv, hvilket indebærer tilstedeværelsen af ​​specifikke miRNAer i EOC. Den 10-miRNA signatur identificeret i undersøgelsen kan bidrage til en bedre forståelse af mekanismen for EOC tumorigenese og udvikling og også hjælpe i diagnosticering af EOC

miRNA udtryk, der anvendes i undersøgelsen besad følgende væsentlige fordele.: (1) den største samling af validerede assays (1722 menneskelige miRNA i miRBase v 20,0), (2) en af ​​de største afsløring rækkevidde (op til 6 størrelsesordener), (3) den mest følsomme detektion (ned til en enkelt kopi nummer), (4) den højeste specificitet ( 3% krydsreaktivitet blandt 8 medlemmer af lad-7 familie). Tre forskellige klassifikationssystemer metoder blev anvendt med et kryds valideringsprocedure leave-one-out for at minimere fejl. Så vidt vi ved, er dette den største omfang miRNA (1722) udtryk profilering undersøgelse ved hjælp QRT-PCR hidtil.

Vi havde analyseret variansen nedbrydning af kræft og normal vævsprøver og viste resultatet i figur 1D. Vi erkendte, at der ikke er nogen sammenhæng med hospitalet kilde, overlevelse, tumor histologi sygdommen fase tumorklassificering og endda tilbagefald, undtagen prøverne (prøver normalt væv vs. maligne vævsprøver). Endnu vigtigere er, de 10 miRNA diskrimineret EOC gruppe fra normal gruppe med høj følsomhed og specificitet, hvilket tyder på deres potentielle værdi for tidlig påvisning af OC. De anførte, at der kunne forventes klassificeringen af ​​C-gruppen fra N gruppe til at have 97% sensitivitet og 92% specificitet.

Den 10-miRNA signatur identificeret i undersøgelsen viste fremtrædende differentiering mellem EOC fra normale kontroller. Blandt disse miRNA, mir-96, MIR-182 og MIR-183 er grupperet ved den ene locus i kromosomet 7 [17] og MIR-141-5p tilhører MIR-200-familien, som er grupperet på kromosomerne 12. Ikke blot mIR-141 har vi yderligere fundet, at andre medlemmer (200a /b /c), miR200 familien også overudtrykkes i EOC sammenligning med den normale (tabel 3). Begge to miRNA klynger er velkendte onkogene miRNA klynger, der er blevet grundigt rapporteret at inddrage i tumor tilblivelse i mange typer af tumorer [18] – [20]. Familiemedlemmerne miR-200 blev rapporteret til at målrette ZEB1 og ZEB2, ZEB transkriptionsfaktorer er afgørende repressorer af BMP-signalering, og Peart et al rapporterede, at BMP signalering styrer maligne potentiale af ascites-afledte humane epitelial ovariecancer sfæroider via AKT kinase aktivering [ ,,,0],21]. Medlemmerne (miR200b og miR429) af miR200 familie blev rapporteret at være signifikant associeret med kræft i æggestokkene tilbagefald og samlet overlevelse [18]. For miR183-96-182 klynge, Xu rapporterede, at overudtrykt MIR-182 og MIR-96 målretning gaffel hoved boks O3 spiller en væsentlig rolle i pro-spredning effekt af leptin på ovariecancerceller [22]. miR-182 blev rapporteret til direkte og negativt regulerer en vigtig tumor suppressor, programmeret celledød 4 (PDCD4) i OC [23]. miR-183 er bekræftet til at have negative regulatoriske virkninger på Tiam1 udtryk, der bidrager til den invasive, vandrende, og levedygtighed egenskaber af OC celler [24]. En nylig undersøgelse ved sekventering små RNA fra isogene p21 + /+ og p21 – /- celler viste, at de forskellige miRNA klynger, miR-200b-200a-429, miR-200C-141 og miR-183-96-182 blev nedreguleret i p21-mangelfulde celler, hvis tilføje modvirkning miR-200 og miR-183-96-182 klynge miRNA i p21 + /+ celler, steg invasion og forhøjede niveauer af

VIM

,

ZEB1

og

SLUG

mRNA, der er fælles mål for miR-183 og miR-96. Undersøgelsen fandt endvidere, at p21 danner et kompleks med ZEB1 på miR-183-96-182 klynge promotor til at hæmme transkriptionel undertrykkelse af denne klynge ved ZEB1 tyder en gensidig feedback-sløjfe [25]. Nogle undersøgelser har fundet, at MIR-200 familiemedlemmer blev opreguleret i serøs epitelial ovariecancer cellelinie samt i serum fra patienter med serøs epitelial ovariecancer [26], [27].

Disse resultater tyder på, at klynger af den miR-183-96-182 og miR200 spiller en meget vigtig rolle i EOC og kan anvendes som potentielle diagnostiske biomarkører for EOC detektion samt have terapeutisk potentiale til bekæmpelse af kræft i æggestokkene spredning og invasion .

SVM-modellen blev yderligere anvendt med profilering data genereret fra epitelial celleprøver som træningsdata at teste epitelovariecancer grænsetilfælde vævsprøver. Seks ud af de 7 OC prøver blev forudsagt som OC, som viste, at den identificerede signatur også kan være nyttige til at detektere OC fra grænsetilfælde vævsprøver (data ikke vist). Dette kan dog brug for en større stikprøve for bekræftelse. Imidlertid kunne ingen signifikante miRNA adskille CB fra N-gruppe, eller CB fra CE gruppe. Dette kunne tilskrives den reducerede effekt i at afsløre forskelle mellem 39 af epitelial kræft i æggestokkene prøver (CE) og 6 epitelial ovariecancer grænsetilfælde vævsprøver (CB). er behov for yderligere undersøgelser med større stikprøve for at bekræfte denne forklaring.

Nogle vigtige forskelle i miRNA blev også observeret for en adskillelse af epitelial kræft i æggestokkene prøver (uden epitelial ovariecancer grænsetilfælde vævsprøver) fra normale prøver. De syv dysregulerede miRNA herunder HSA-miR-182-5p, HSA-miR-183-5p, HSA-miR-96-5p, HSA-miR-1271-5p, HSA-miR-182-3p, HSA-miR-1468 -5p, og HSA-miR-135b-3p (tabel S1 i filen S1) blev bekræftet af AUC for ROC kurven (AUC = 0,965) med 97% sensitivitet og 85% specificitet (figur S5 i filen S1). 6 ud af disse 7 miRNA (HSA-miR-182-5p, HSA-miR-183-5p, HSA-miR-96-5p, HSA-miR-1271-5p, HSA-miR-182-3p, og hsa- mIR-135b-3p) er i det 10-miRNA signatur. De 10 unikke miRNA profiler skelnes epitelial ovariecancer tumor vævsprøver, herunder epitel ovariecancer vævsprøver og epitelial ovariecancer bundet line vævsprøver fra normale epitel æggestokkene vævsprøver med 97% sensitivitet og 92% specificitet. Udtrykket profil 7 miRNA signatur var også i stand til at klassificere epitel kræft i æggestokkene vævsprøver og normale epitel æggestokkene væv. Disse resultater kan danne grundlag for fremtidige undersøgelser af kliniske værdi af tumor miRNA forudsige terapeutisk effektivitet, vedligeholdelse overvågning, og prognoser prognose og hjælpe bedre forståelse af mekanismen for epitelial ovariecancer tumor tilblivelse og udvikling.

Støtte Information

File S1.

Støtte figurer oplysninger. Figur S1, Oversigt over det eksperimentelle design. Figur S2, Sammenligning mellem æggestokkene epitel karcinomer væv (CE-gruppen) og normalt væv (N-gruppe). A) MA plot af assays bruges til at profilere sammenlignede prøver. B) Volcano plot af de resulterende p-værdier af t-test mellem CE og de N grupper. 335 miRNA viser justerede p-værdier (FDR) under 0,1 og fold-ændringer over 2 (vist i rødt). C) Hierarkisk klyngedannelse af CE og N-grupper baseret på top 50 mest variable miRNA analyser. Figur S3, Sammenligning mellem æggestokkene borderline væv (CB gruppe) og normalt væv (N-gruppe). A) MA plot af assays bruges til at profilere sammenlignede prøver. B) Volcano plot af de resulterende p-værdier af t-test mellem CB og de N grupper. Ingen miRNA viser korrigerede p-værdier (FDR) under 0,1 og fold-ændringer over 2 (vist med rødt). C) Hierarkisk klyngedannelse af CB og N-gruppe baseret på top 50 mest variable miRNA analyser. Figur S4, Sammenligning mellem æggestokkene epitel karcinomer væv (CE-gruppen) og æggestokkene borderline væv (CB gruppe). A) MA plot af assays bruges til at profilere sammenlignede prøver. B) Volcano plot af de resulterende p-værdier af t-test mellem CE og CB grupper. Ingen miRNA viser justerede p-værdier (FDR) under 0,1 og fold-ændringer over 2 (vist med rødt). C) Hierarkisk klyngedannelse af CE og CB grupper baseret på top 50 mest variable miRNA analyser. Figur S5, Syv udvalgte miRNA sammenligner CE gruppe med normal gruppe. A) Forudsigelse sandsynlighed for SVM, 53 prøver med en fejl = 3 (0,06 & 0,05). B) Areal under kurven (AUC = 0,965) estimering for microRNA panel i CE-gruppen fra den normale gruppe

doi:. 10,1371 /journal.pone.0096472.s001

(DOC)