PLoS ONE: Adrenomedullin i kræft i æggestokkene:? Foe In Vitro og Friend In Vivo

Abstrakte

stromacellers elementer inden en tumor interagerer med kræftceller til at oprette en mikromiljø, der understøtter tumorvækst og overlevelse. Adrenomedullin (ADM) er en autokrin /parakrin faktor produceret af både stromale celler og kræftceller til at skabe et sådant mikromiljø. Under differentiering af makrofager, er ADM produceres som respons på proinflammatoriske stimuli og hypoxi. I dette studie undersøgte vi rollen som ADM som en vækstfaktor for ovariecancerceller og som en modulator af makrofager. Vi analyserede også ADM ekspressionsniveauerne i en retrospektiv klinisk undersøgelse med nanofluidic teknologi og vurdering af ADM på genniveau i 220 æggestokkene kræftpatienter. At undersøge virkningerne af ADM, ovarie- cancercellelinier A2780, OVCAR-3, og HEY og deres lægemiddelresistente modstykker blev anvendt til proliferationsassays, mens monocytter fra raske donorer blev differentieret in vitro. ADM var en svag vækstfaktor, som afsløret ved proliferationsassays og cellecyklus-analyse. Efter dyrkning cancerceller under understregede betingelser, såsom serum sult og /eller hypoxi, blev ADM fundet at være en overlevelsesfaktor i HEY men ikke i andre cellelinjer. I makrofager viste ADM aktivitet på proliferation /differentiering, primært i type 2 makrofager (M2). Uventet, den kliniske undersøgelse viste, at høj ekspression af ADM var knyttet til positivt resultat og kræft med lav CA125. Afslutningsvis skønt in vitro ADM var en potentiel faktor i biologiske aggressivitet, denne mulighed blev ikke bekræftet i patienter. Derfor brug af en ADM-antagonist ville være uhensigtsmæssigt i forvaltningen æggestokkene kræftpatienter

Henvisning:. Baranello C, Mariani M, Andreoli M, Fanelli M, Martinelli E, Ferrandina G, et al. (2012) Adrenomedullin i kræft i æggestokkene: Foe In Vitro og Friend In Vivo? PLoS ONE 7 (7): e40678. doi: 10,1371 /journal.pone.0040678

Redaktør: Konradin Metze, University of Campinas, Brasilien

Modtaget: Marts 19, 2012; Accepteret: 12 juni 2012; Udgivet: 30 Jul 2012

Copyright: © Baranello et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af en bevilling fra Associazione Oppo e le sue stanze ONLUS (www.oppostanze.it), af Ruth C. Donovan Cancer Research Program og af en generøs donation fra Mr. og Mrs. Ruggles. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft mikromiljø er et emne, der er for nylig begyndt at interessere efterforskere. I årevis forskning fokuseret på cancercellen selv, men en fast tumor indeholder også ikke-maligne stromale elementer, herunder makrofager, lymfocytter, mastceller, endotelceller, fibroblaster, myofibroblaster, pericytter, og mesenchymstamceller, som alle vekselvirker med cancerceller til skabe en mikromiljø, som understøtter tumorvækst og overlevelse [1], [2]. Forståelse den nøjagtige sammensætning af tumormikromiljøet kunne være nyttige for udviklingen af ​​rationelle terapeutiske fremgangsmåder.

epitelovariecancer udviser en kompleks cytokin-chemokin netværk [3]. Receptorer for kemokiner udtrykt i en række infiltrerende celler, herunder makrofager, der rekrutteres af kemokiner [4]. Denne interaktion er en 2-vejs proces: ovariecancerceller er også i stand til at modulere makrofag fænotype, idet cytokiner og celleoverfladereceptorer, der induceres i samdyrket makrofager in vitro også påvises i human ovariecancer [5]. ADM er i stand til at fremme angiogenese og melanom vækst [6] såvel via parakrine virkning, formidlet af endotel nitrogenoxidsyntase signalvejen, og ved den autokrine virkning, som stimulerer polariseringen af ​​makrofager mod en alternativt aktiveret fænotype (M2).

ADM er en 52-amino-syre opløseligt peptid, der blev renset for første gang fra fæokromocytom [7], og menes at være primært produceres af binyremarven. Men i dag er det velkendt, at ADM er næsten allestedsnærværende, med udbredt væv, der er betegnende for sine mange biologiske aktiviteter [8]. ADM er produceret af både stromale (dvs., endotel- vaskulær glat muskulatur, myocardial og centralnervesystemet) og tumorceller som en autokrin /parakrin faktor. Det produceres også under differentiering af makrofager som respons på proinflammatoriske stimuli og hypoksi, og det har især anti-inflammatoriske virkninger, idet ADM inhiberer TNF-α-produktion ved aktiverede makrofager, reducerer vaskulær permeabilitet, og nedregulerer Th1-medieret autoimmun respons [ ,,,0],9].

A2780, TC1, TC3, blev OVCAR-3, og OVCAR-EPO10 celler behandlet med ADM 1, 10 og 100 nM i 72 timer og talt. Celletællinger er vist som absolutte antal celler. En beskeden virkning på cellevækst blev bemærket i nogle cellelinjer, såsom A2780 (A), TC1 (B), og OVCAR-3 (D) celler.

Strukturelt ADM er kendetegnet ved en typisk 6-amino-syre-ring, på grund af en disulfidbro mellem cysteiner 16 og 21, og det er amideret ved C-terminalen. Både disulfidbindingen og amidering er afgørende for dets aktivitet. ADM er homolog med calcitonin gen-relateret peptid (CGRP) og amylin, begge medlemmer af calcitonin /CGRP /amylin superfamilien [10]. Denne homologi tillader signifikant krydsreaktivitet med receptorerne på disse andre peptider, samt med sig selv calcitonin. To receptorer er blevet identificeret for ADM: ADM-R1 og ADM-R2, begge dannet af en fælles main underenhed og en accessorisk protein. Den vigtigste underenhed er calcitonin receptor-lignende receptor (CRLR); tilbehøret proteinet er receptoraktiviteten-modificerende protein 2 (RAMP2) i ADM-R1 og RAMP3 i ADM-R2 [11].

Da ovariecancer er en sygdom, der spreder sig i et miljø rigt på makrofager som menes at være den vigtigste kilde til ADM produktion, i denne undersøgelse undersøgte vi rollen som ADM som en vækstfaktor for cancerceller og som en modulerende faktor i makrofager. Selvom vi in ​​vitro bemærket dets delvise aktivitet som en faktor fremme væksten i kræftceller, i en retrospektiv klinisk studie observerede vi, at høje niveauer af ADM er forbundet til et positivt resultat, og til en cancer med lav CA125 udtryk.

celler blev sultet i 36 timer med eller uden tilsætning af ADM 100 nM, høstet efter 0 (T1), 4 (T2), 8 (T3), og 24 timer (T4), fikseret, farvet med propidiumiodid og erhvervet under anvendelse af en cytofluorimeter . Data blev analyseret som histogram plots. Ved at plotte celletal versus propidiumiodid (PI) fluorescens, blev procentdelen af ​​celler i hver fase evalueret. Data fra A2780 og OVCAR-3 celler alene er vist som en procentdel af den samlede G1 + S + G2 (A-B). Celledød blev også vurderet ved at analysere DNA-fragmentering indgår i sub-G

0/1 top (C-D). Effekten af ​​ADM på cellecyklus og celledød er ikke påvises. Dette eksperiment blev gentaget to gange med lignende resultater.

Resultater

ADM er en svag vækstfaktor for kræft i æggestokkene cellelinier

For at vurdere virkningerne af ADM på væksten af ​​æggestokkene cancercellelinjer, OVCAR-3, OVCAR-EPO10 og A2780 og dens paclitaxel-resistente modstykker TC1 og TC3 celler blev behandlet med rekombinant humant ADM ved 1, 10 og 100 nM koncentration i 72 timer. Efter høstning blev cellerne talt. En beskeden virkning på cellevækst blev bemærket i nogle cellelinjer, såsom A2780, TC1, og OVCAR-3 celler (Fig. 1). Derefter blev virkningen på cellecyklussen analyseres ved supplering med exogen ADM og ledsagende serum sult. Celler blev podet i 24-brønds plader og serum sultet i 36 timer med eller uden tilsætning af ADM 100 nM. Efter 36 timer (T1), 5 × 10

5 celler fra hver betingelse blev høstet og blev udført DNA-analyse. For at måle inddrivelse af cellerne i de andre brønde medium blev erstattet med FBS-medium. Celler blev høstet efter 4 (T2), 8 (T3), og blev udført 24 timer (T4), og igen DNA-analyse. Procentdelen af ​​celler i hver fase blev evalueret og repræsentative data er vist for A2780 og OVCAR-3 celler (fig. 2A-B) og for deres resistente modstykker A2780CIS og OVCAR-EPO (fig. 3 A-B), som er resistent over for cisplatin og patupilone hhv. En beskeden stigning i S-fasen blev bemærket i prøverne behandlet med ADM. DNA-fragmentering, herunder i sub-G

0/1 højdepunkt, blev også evalueret som en indikator for celledød (fig. 2 C-D, 3C-D). Effekten af ​​ADM på celledød var ikke påvises. Tilsammen tyder disse resultater på, at ADM har en beskeden rolle som vækst og overlevelse faktor i æggestokkene kræft cellelinjer analyseres.

Cellerne blev behandlet som beskrevet i figur 2. Ingen relevante effekter blev bemærket i disse to celle linjer i form af modulation af cellecyklus og død som følge af ADM. Dette forsøg blev gentaget to gange med lignende resultater.

A2780 og OVCAR-3 celler blev dyrket under hypoxiske betingelser i 72 timer med og uden tilsætning af ADM 100 nM. RNA ekstraheret fra cellepellets blev analyseret ved qPCR. I A2780 celler, som er følsomme over for hypoxi, blev ADM og ADM receptorer nedreguleret i hypoxiske betingelser. I OVCAR-3 celler, som er mindre følsomme over for hypoksi, blev ADM og ADM receptorer opreguleres (A). A2780, TC1, TC3, OVCAR-3, og OVCAR EPO 10 celler blev dyrket som beskrevet ovenfor og talt. Behandling med ADM ikke modulere ovariecancer cellevækst i enten normale eller hypoxiske betingelser, med den undtagelse, at i OVCAR EPO 10 linje var der en 2,4 gange stigning vækst under hypoxiske betingelser. Forældrekontrol OVCAR-3 celler blev sensibiliseret til hypoxi ADM. I forhold til den normoxiske kontrol, hypoksi reducerede antallet af celler med omkring 50%. Bar og fejlsøjler refererer til at betyde og SD af 2 uafhængige eksperimenter udført i tre eksemplarer.

ADM er en Selektiv Survival Factor

Effekten af ​​hypoksi blev undersøgt i A2780 og OVCAR-3 celler (fig. 4A). I A2780 celler, som er følsomme over for hypoxi, blev ADM og ADM receptorer nedreguleret i hypoxiske betingelser. I OVCAR-3, som er mere modstandsdygtige over for hypoksi, blev ADM og ADM receptorer opreguleres. A2780, TC1, TC3, OVCAR-3, og OVCAR EPO 10 blev dyrket i hypoxiske betingelser uden tilskud af ADM 100 nM (fig. 4B). Blandt de analyserede cellelinier, bemærkede vi, at kun for OVCAR EPO 10 var der en 2,4 gange stigning i hypoxiske betingelser i nærvær af ADM, en forskellig adfærd fra den parentale cellelinje OVCAR-3, som ADM syntes at sensibilisere for hypoxi, da observeredes kun halvdelen af ​​antallet af celler i forhold til antallet i prøven udsat for hypoxi uden ADM. Ingen relevante ændringer var påviselige i de andre modeller.

OVCAR-3 (A), OVCAR EPO10 (B), HEY (C), og HEY-EPO8 (D) celler blev dyrket i serumudsultning betingelser (uden FBS) i et passende interval (tillader kun ca. 50% af cellerne til at proliferere), med eller uden tilsætning af ADM 50 nM, 100 nM og 500 nM. Celletællinger er vist som det samlede antal celler. Bemærkelsesværdigt havde tilstedeværelsen af ​​ADM ikke mærkbart påvirker cellevækst. Hver datapunkt og fejl bar refererer til at betyde og SD af 2 uafhængige eksperimenter udført i tre eksemplarer.

OVCAR-3 (A), OVCAR EPO10 (B), HEY (C), og HEY-EPO8 ( D) cellesuspensioner fra serumudsultning eksperiment blev fortyndet og udpladet på petriskåle ved 3 forskellige celle seedings per skål. Virkningen af ​​ADM på klonogene kapacitet efter 14 dage er vist som antallet af kolonier. Kun HEY-celler viste nogen konsistent effekt af beskyttelse mod serumudsultning efter ADM behandling i dette assay, mens deres epothilon-resistente modstykker udviste den modsatte virkning. Bar og fejlsøjler refererer til middelværdi og SD af 2 uafhængige eksperimenter udført i triplikat.

For at undersøge virkningen af ​​ADM behandlinger i en anden stress model blev celler podet i 6-brønds plader og serumudsultet. En inkubationsperiode blev etableret efter indledende analyser (36 timer for HEY og OVCAR EPO10, 48 timer for HEY EPO8 og 60 timer for OVCAR-3). Serumudsultning betingelser alene, uden ADM, induceret mindst 50% af vækstinhibering. ADM blev tilsat ved 3 forskellige koncentrationer (50 nM, 100 nM og 500 nM). Data fra proliferationsassays i serumudsultning betingelser er vist i figur 5A-D. Celler fra hvert assay blev derefter udpladet i petriskåle på 3 forskellige celle seeding tætheder pr skål (90, 180, og 360 celler blev podet i hver skål for HEY EPO 8, OVCAR-3, og OVCAR EPO10, 150, 300, og 600 celler /skål for HEY) og kolonier blev talt efter 14 dage. Som med hypoxi og serumudsultning var effektiv til reduktion af antallet af celler i kortfristede 3-dages vækstassays. En beskeden, ikke statistisk signifikant stigning blev bemærket, da ADM blev tilføjet ved den laveste koncentration. For at vurdere tilstedeværelsen af ​​en beskyttende virkning af ADM i klonogene rum, efter udsættelse for serumudsultning blev celler udpladet ved begrænsende fortyndinger og kolonierne talt efter 10-14 dage (fig. 6A-D). I dette assay kun i HEY-celler en konsekvent beskyttende virkning af serum sult blev bemærket med ADM behandling, mens der i de andre celletyper blev registreret nogen ændringer. Samlet set viser disse resultater viste, at kun i nogle cellelinjer var ADM stand til at mediere vækst- eller overlevelsesfaktorer.

Type 1 (A) og type 2 (B) makrofager blev behandlet med ADM 1 nM, 10 nM, og 100 nM i 72 timer og talt. Celletællinger er vist som det absolutte antal celler. Type 2 celler dyrket i nærvær af ADM nåede et tal op til 3,8 gange højere end antallet for ubehandlede celler, mens der kan konstateres en mindre stigning i type 1 makrofager (1,3 gange højere med ADM 10 nM). Ekspression af endogen ADM, IL1β, IL6, IL8, IL12, TNFa, IFNγR, CCL22, TGFp, IL10, og IL13Rα blev evalueret ved qPCR (C) efter behandling af type 1 og type 2 makrofager med rhADM 100 nM i 24 timer. I begge typer af celler, der endogent ADM, IL-12, og TNF-α opreguleres. IL1β og IL8 blev nedreguleret mens CCL22 er opreguleret i type 2 makrofager versus type 1. Ingen andre relevante forskelle i ekspression af de andre cytokiner, kemokiner, og receptorer blev bemærket. Bar og fejlsøjler refererer til at betyde og SD af 2 uafhængige eksperimenter udført i tre eksemplarer.

Kaplan-Meier analyse af 220 patienter kræft i æggestokkene (A) viste, at høje ekspressionsniveauer af ADM var relateret til en positiv resultat i form af OS, selv om forskellen ikke nåede statistisk signifikans (

s

= 0,07). Den samme analyse, med en endelig endepunkt PFS, afslørede den samme tendens (B), dvs. patienter med lavere udtryk for ADM tilbagefald tidligere end dem med højere niveauer (

s

= 0,01). Multivariat analyse viste, at alder, klinisk fase, histotype, og sortering blev ikke signifikant relateret til ADM udtryk, mens der var en stærk signifikant omvendt sammenhæng (

s

0,001) mellem niveauerne af CA125 og ADM udtryk (C ). Også niveauer af PLK1 genet, som er relateret til antallet af celler i M-fasen, blev væsentligt reduceret i gruppen med lav ADM udtryk (D).

ADM Påvirker Monocyt /makrofag spredning og Differentiering

Fordi makrofager er centrale for produktionen af ​​ADM i stroma, type 1 (M1) og type 2 (M2) makrofager blev behandlet med 3 forskellige koncentrationer af ADM (1 nm, 10 nm, og 100 nm ) i 72 timer. Cellerne blev høstet ved trypsinisering og talt. M2 dyrket i nærvær af ADM nået en tælling på op til 3,8 gange højere end antallet for ubehandlede celler, mens en mindre stigning blev observeret i M1 (1,3 med ADM 10 nM), hvilket indikerer, at en eller anden måde ADM var i stand til at modulere makrofagdifferentiering og proliferation (fig. 7A). Som bekræftelse af kapaciteten af ​​ADM til at modulere makrofagdifferentiering, blev M1 og M2 behandlet med ADM 100 nM i 24 timer. Genekspression af ADM, IL1β, IL6, IL8, IL12, TNF, IFNR, CCL22, TGFp, IL10, og IL13R blev vurderet gennem qPCR. Opregulering af endogent ADM blev observeret i M1 og M2, samt opregulering af IL-12 og TNF-α (fig. 7B), hvilket viser, at ADM var i stand til at regulere dens ekspression i makrofager på en autokrin måde. De eneste forskelle bemærket i cytokin /chemokinekspression som reaktion på ADM var nedregulering af IL1β og IL8 og opregulering af CCL22 i M2 vs. M1.

Høj Expression Niveauer af ADM var en positiv Prognostisk faktor i æggestokkene kræftpatienter

for at få indsigt i den rolle, ADM i kræft i æggestokkene, blev en klinisk kohorte af 220 patienter med ovariecancer analyseret retrospektivt ved hjælp af en nanofluidic genetisk analysator og en 48,48 chip. CA125 analyse og patientprøver blev indsamlet ved første operation, før nogen behandling. GAPDH tjente som husholdning gen og resultaterne var normaliseret for ekspressionsniveauerne detekteret i OVCAR-3 celler. Beskrivelsen af ​​patienterne i denne undersøgelse er opsummeret i tabel 1. En indledende resultat analyse blev udført under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden. Høje ekspressionsniveauer af ADM synes at være knyttet til en bedre overlevelse, selv om forskellen ikke nåede statistisk signifikans (

s

= 0,07) (fig. 8A). Den samme analyse, med sin endelige endpoint progressionsfri overlevelse (PFS), afslørede den samme tendens (Fig. 8B), med patienter, der har lavere udtryk for ADM recidiverende tidligere end dem med højere niveauer (

s

= 0,01 ). For at få indblik i disse resultater, vi ansat multivariat analyse til at vurdere de kliniske parametre, der blev relateret til ADM udtryk. Spearmans korrelation blev anvendt til at vurdere forholdet mellem ADM, CA125, og alder taget som kontinuerlige variabler. Ingen signifikante korrelationer blev noteret mellem ADM og alder (

ρ

= -0,008,

s

= 0,91) og CA125 og alder

(ρ

= -0,139,

p

= 0,17), mens en signifikant omvendt korrelation blev fundet mellem CA125 og ADM (

ρ

= -0,23,

s

= 0,003). ADM værdier blev også analyseret ved histologisk type og stadium af sygdommen under anvendelse af Kruskal-Wallis test. ADM udtryk ændrede sig ikke, når man sammenligner mellem histotypes (χ

2 = 5,14,

s

= 0,39) eller klinisk fase (χ

2 = 3,94,

s

= 0,14) . Når patienterne blev stratificeret i høje og lave ekspressionsniveauer, der var igen en signifikant omvendt sammenhæng (χ

2 = 10,7,

s

0,01) mellem niveauerne af CA125 og ADM udtryk (. Fig 8C) . Disse data antyder, at tumorer med lavere ekspression af ADM har en større masse end dem med højere ADM ekspression. I overensstemmelse med denne hypotese, niveauerne af PLK1-en faktor i forbindelse med antallet af celler i M fase-blev også signifikant reduceret (χ

2 = 4,6,

s

= 0,03) i gruppen med lav ADM ekspression (fig. 8D). Disse resultater tyder på, at høj ekspression af ADM udøver vækst-undertrykkende virkning på kræft i æggestokkene celler og er knyttet til positivt resultat. For at vurdere denne hypotese, Cox univariat analyse, som tog hensyn til klinisk fase, histotype, alder, CA125, ADM, og PLK1 (sidstnævnte 4 parametre blev taget som kontinuerte variable) blev udført ved hjælp af både OS og PFS som variabler for udfaldet (tabel 2). Variabler i stand til at forudsige udfaldet i univariate analyse blev udvalgt til at udføre Cox multivariat analyse. Som tidligere rapporteret [12], kliniske stadium var den vigtigste variabel til at forudsige risikoen for dødsfald hos patienter med ovariecancer. Dette faktum var tydelig i både OS og PFS-analyse i univariate og multivariate analyse. Den histotype endometrioide var karakteristisk for patienter med et bedre OS og PFS i univariat analyse, en effekt opretholdes i multivariat analyse til OS. Høje ekspressionsniveauer af ADM blev relateret til bedre OS og PFS. Denne effekt, selv om beskeden med hensyn til risiko, blev opretholdt i både univariate og multivariate analyse, støtter hypotesen om, at høje ekspressionsniveauer af ADM er prædiktive for positivt resultat i æggestokkene kræftpatienter.

Diskussion

Stærk prækliniske og translationelle studier støtter hypotesen om, at stromale komponenter spiller en central rolle i at drive en aggressiv tumor fænotype. I denne sammenhæng ADM er en allestedsnærværende regulerende peptid med flere biologiske funktioner, såsom vaskulær aktion, vækststimulerende virkninger, og immun-modulerende aktivitet. ADM er stærkt udtrykt i en række forskellige maligniteter såsom glioblastoma [13], klar-celle renalt carcinom [14] og pancreascancer [15]. I alle disse sygdomme ADM har været betragtet som en biomarkør for dårligt resultat. Denne egenskab ved ADM er blevet tilskrevet primært til dens mitogene egenskaber og dets evne til at fungere som en overlevelsesfaktor induceret af hypoxia. Sammen med dens direkte virkninger på kræftceller overlevelse, en yderligere faktor i tumor aggressivitet består i sin egenskab af ADM til at stimulere angiogenese inde tumoren. Denne mekanisme synes særligt relevant i klar-celle renal karcinom, en sygdom karakteriseret ved intensiveret vaskularisering inde tumoren [16]. Kun få rapporter er tilgængelige, om dette fænomen forekommer i kræft i æggestokkene og om den præcise funktion af ADM i denne sygdom. I en lille klinisk indstilling af 60 patienter med ovariecancer, hjælp nonquantitative PCR-analyse, i 2000 Hata og kolleger rapporterede, at ADM var en faktor prædiktiv for dårligt resultat [17]. Bortset fra denne rapport, ingen andre translationelle studier rettet rolle ADM i kræft i æggestokkene. Virkningerne af ADM på æggestokkene cancerceller i in vitro kulturer er kontroversiel. Giacalone og kolleger rapporterede, at ADM ikke var i stand til at stimulere cellevækst i BG-1, PEO4, og PEO14 ovariecancerceller [18]. Omvendt er en nylig undersøgelse rapporterede, at silencing af ADM-genet i HO8910 ovariecancerceller blev ledsaget af væksthæmning og chemosensitization gennem nedregulering af ERK og bcl-2-ekspression [19]. Disse resultater fik os til at undersøge, om ADM er en mitogen overlevelsesfaktor i et panel af cancerceller udviser forskellige grader af lægemiddelresistens. In vitro analyse viste, at ADM udviste minimal aktivitet som en vækstfaktor, en effekt, der varierede efter cellelinie, med en beskeden stigning i celler i S-fasen af ​​cellens cyklus. Aktiviteten af ​​ADM som en overlevelse faktor blev skarpt differentieret efter cellelinje. I Hey celler, efter serum sult var der en konsekvent stigning i antallet af celler, som kan overleve og danne kolonier, mens i andre cellulære modeller en sådan virkning var knap detekterbar. Ekstrem variabilitet blev også observeret med hensyn til respons på hypoxi. I denne reaktion bemærkede vi en reduktion i ekspressionen af ​​ADM og dets receptorer i celler følsomme over for hypoxi, såsom A2780, mens i OVCAR-3 blev observeret de modsatte tendenser. Ved at kombinere resultaterne rapporteret i litteraturen og vores egne resultater konkluderede vi, at ADM udøver en beskeden effekt som vækst og overlevelse faktor i ovariecancerceller, med ekstrem variabilitet afhængigt af celle model analyseres.

En nylig rapport på melanoma foreslog, at den største kilde til ADM er makrofager [6]. For at kontrollere en sådan hypotese, vi kiggede på evne ADM til at stimulere væksten af ​​polariserede M1 og M2 makrofager. ADM var i stand til at regulere deres produktion på en autokrin måde og selektivt forøget spredning af M2, som har en lav IL-12 /høj IL-10 fænotype, og som udviste nedsat ekspression af reaktivt kvælstof mellemprodukter, lavere antigenpræsentation og tumordræbende kapacitet, og høj ekspression af angiogene faktorer, såsom VEGF, EGF, og semaphorin 4D [20]. Høj ekspression af M2 er derfor generelt forbundet med en immun miljø, der gør kræft mere aggressiv.

På trods af disse in vitro-resultater, vores translationel undersøgelse viste overraskende, at patienter med højere ekspression af ADM genet tendens til at have længere PFS og et bedre resultat. Vi bemærkede, især en omvendt korrelation mellem ekspressionsniveauer for ADM og CA125 målt på tidspunktet for første operation. Det er almindeligt accepteret, at CA125 er en markør for tumor volumen. I æggestokkræft, der reagerer på behandling, en reduktion i ekspressionen af ​​ca125 er bemærkelsesværdig. Tumorer karakteriseret ved lave niveauer af ADM udviser også højere udtryk for PLK1, en markør for mitotisk aktivitet. Det er derfor sandsynligt, at patienter, ADM udøver direkte eller indirekte, et vækst-undertrykkende virkning, med en reduktion af celler i M-fasen af ​​cellecyklussen foreslået af ekspressionen af ​​PLK1. I et stort antal undersøgelser, de store virkning ses for in vivo ADM-stimulerede celler var en stigning i cAMP (gennemgået i [8]). Midler, der forøger cAMP i cancerceller har ofte været forbundet med inhibering af celleproliferation [21], og flere stoffer, der kan efterligne cAMP er i klinisk udvikling som anticancermidler [22]. Sammen med en direkte virkning på cancerceller gennem cAMP, er det også muligt, at patienter med højere niveauer af ADM udviser tumorer med bedre vaskularisering, som påvist i klar-celle renalt carcinom [16]. Da kræft i æggestokkene er en chemosensitive sygdom hos de fleste patienter [12] vi kan spekulere, at koncentrationen af ​​kemoterapeutika væv øges, når niveauet af ADM er forhøjet, hvilket fører til bedre kontrol med sygdommen og en længere sygdomsfrit interval.

sammenfattende denne undersøgelse viste, at selv om ADM kan opføre sig som en vækst /overlevelsesfaktor in vitro, og som et middel i stand til selektivt at stimulere M2 polarisering, disse egenskaber blev ikke bekræftet i patienter. denne undersøgelse er derfor ikke understøtter brugen af ​​ADM-antagonister som et redskab til at forbedre forvaltningen af ​​æggestokkene kræftpatienter.

Materialer og metoder

cellelinier og reagenser

A2780 og OVCAR-3 cellelinier opnåedes fra ATCC. A2780 er en human ovariecancer cellelinie afledt fra tumorvæv hos en ubehandlet patient. A2780 TC1 og A2780 TC3 er Paclitaxel-resistente cellelinjer skabt på grundlag A2780 efter langvarig behandling med cyclosporin og paclitaxel (venligst stillet til rådighed af Indena). OVCAR EPO10 og HEY EPO8 er Epothilon B (EpoB) resistente cellelinjer skabt på grundlag OVCAR-3 og HEY henholdsvis efter langvarig behandling med EpoB. Alle disse cellelinjer er tidligere blevet [23] beskrevne. Cellelinier blev dyrket under standardbetingelser (37 ° C, 5% CO

2) i RPMI 1640 med glutamin suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 0,1 mM MEM ikke-essentielle aminosyrer og 0,1 mg /ml kanamycin. Alle reagenser blev erhvervet fra Sigma-Aldrich, hvis andre leverandører ikke var angivet. Forsøg i hypoksi blev udført som tidligere beskrevet [24].

Fremstilling af Makrofager Primære kulturer Salg

Lymphomonocytes blev isoleret fra buffy coat af en rask donor ved densitetscentrifugering gradient under anvendelse Histopaque-1077 (Sigma -Aldrich) og resuspenderes i RPMI 1640 suppleret med 10% humant AB-serum (Sigma-Aldrich), 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (GIBCO). Omkring 10

7 lymphomonocytes per brønd blev podet i 6-brønds primær kultur plader (BD Falcon) og inkuberet ved 37 ° C 5% CO

2 i 2 timer for at tillade monocytter (10% til 30%) til at klæbe til bunden af ​​brøndene. Frisk dyrkningsmedium indeholdende enten 50 ng /ml rekombinant human GM-CSF eller 50 ng /ml rekombinant human M-CSF (R A2780, A2780 TC1, A2780 TC3, og OVCAR EPO10: 8 × 10

4 /brønd; OVCAR-3 og HEY EPO8: 10

5 /brønd). Rekombinant human ADM sattes til mediet efter adhæsion af celler til bunden af ​​brøndene. Efter 72 timer blev de flydende celler i supernatanten høstet. Adhærerende celler blev behandlet med trypsin-EDTA og opsamlet, sammen med deres tilsvarende supernatanter. Totale celletællinger blev udført under anvendelse af et hæmocytometer (Burker kammer, Nalgene). Hypoxiske betingelser blev udført ved at inkubere cellerne i en Billrop kammer.

I nogle eksperimenter, HEY, HEY EPO8, OVCAR, og OVCAR EPO10 celler blev dyrket under sult betingelser (uden FBS) til forudbestemte tidspunkter, med eller uden tilsætning af ADM. Den positive kontrol bestod af celler dyrket i komplet medium.

Type 1 og type 2 makrofager blev behandlet med rhADM i 72 timer, derefter høstet efter behandling med trypsin-EDTA og talt i en Burker kammer.

klonogene assays

Efter at tælle OVCAR-3, OVCAR EPO10, HEY, og hey EPO8 celler fra serum sult eksperimenter, hver celle suspension blev fortyndet i FBS-medium til meget lave celledensiteter. For OVCAR-3, OVCAR EPO10, og HEY EPO8 blev hver opløsning fortyndet til 36, 18 og 9 celler /ml, blev derefter 10 ml prøver af hver cellesuspension anbringes i petriskåle, således at brønde blev befolket med 360, 180