PLoS ONE: Den mTORC2 Component Rictor Bidrager til cisplatin Modstand i Human kræft i æggestokkene Cells

Abstrakt

Modstand mod cisplatin-baseret terapi er en væsentlig årsag til behandlingssvigt i human kræft i æggestokkene. En bedre forståelse af mekanismerne i cisplatin modstand vil give nye indsigter til nye terapeutiske strategier for denne dødelige sygdom. Akt og p53 er determinanter for cisplatin følsomhed. Rictor er en bestanddel af mTOR proteinkinase kompleks 2, der er påkrævet for Akt phosphorylering (Ser473) og fuld aktivering. Imidlertid forbliver den præcise rolle Rictor og forholdet mellem Rictor og p53 i cisplatin modstand dårligt forstået. Her, under anvendelse følsom vildtype p53 (OV2008 og A2780s), resistent vildtype p53 (C13 * og OVCAR433), og p53 kompromitteret (A2780cp, OCC1, og SKOV-3) ovariecancerceller, har vi vist, at (i) Rictor er en afgørende faktor for cisplatin modstand i chemosensitive humane ovariecancerceller; (Ii) cisplatin nedregulerer Rictor indhold ved caspase-3 spaltning og proteasomalaktivitet nedbrydning; (Iii) Rictor nedregulering sensibiliserer kemoresistente ovariecancer celler til cisplatin-induceret apoptose i en p53-afhængig måde; (Iv) Rictor undertrykker cisplatin-induceret apoptose og bibringer resistens ved at aktivere og stabilisere Akt. Disse resultater udvide nuværende viden på det molekylære og cellulære grundlag af cisplatin modstand og giver et rationale grundlag for Rictor som et potentielt terapeutisk mål for kemoterapi kræft i æggestokkene

Henvisning:. Im-Aram A, Farrand L, Bae SM, Song G, Song YS, Han JY, et al. (2013) Den mTORC2 Component Rictor Bidrager til cisplatin Modstand i Human æggestokkene cancerceller. PLoS ONE 8 (9): e75455. doi: 10,1371 /journal.pone.0075455

Redaktør: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, USA

Modtaget: 24. maj 2013; Accepteret: August 15, 2013; Udgivet: 23 september, 2013 |

Copyright: © 2013 Im-Aram et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af World Class University (WCU) program gennem Ministeriet for undervisning, videnskab og teknologi og finansieret af Grundforskningsfonden Korea (R31-10056) og af de canadiske Institutes of Health Research (m0p-126.144). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

epitelovariecancer er den mest dødbringende gynækologisk malignitet blandt kvinder på verdensplan [1]. Trods fremskridt i vores forståelse af tumor biologi, den samlede dødelighed af ovariecancer (OVCA) er fortsat høj. Øjeblikket, kemoterapi i kombination med kirurgisk debulking er den foretrukne behandling mulighed og derivater af cisplatin (CDDP: cis-diammindichlorplatin) er first-line kemoterapeutiske lægemidler. CDDP inducerer cytotoksisk celledød gennem dannelsen af ​​DNA-platin addukter, hvilket resulterer i DNA-skader og aktivering af apoptotiske veje [2].

Den effektive behandling af OVCA vanskeliggøres ofte af sen diagnose og fremkomsten af ​​resistens over for kemoterapi efter successive runder af behandling. Resistens over for kemoterapi involverer komplekse mekanismer, der kan følge af dysreguleret signalering, forbedret DNA-reparation, ændret kræftcelle stofskifte [3,4], transport narkotika og metabolisme [5], og dysregulering af overlevelse faktorer, herunder FLIP, XIAP og Akt [6 -9]. Disse molekylære og cellulære begivenheder ændrer den samlede respons af cellen til genotoksiske stoffer som CDDP og indflydelse cellen mod pro-overlevelse beslutninger.

pattedyr mål for rapamycin (mTOR) vej har vist sig som en kritisk regulator af cellulære metabolisme, vækst, proliferation og overlevelse. Dens aberration, som er til stede i op til 50% [10] af OVCA patienter, har vist sig at give resistens mod CDDP-baseret behandling og er forbundet med en negativ prognose [11-14]. Den mTOR pathway involverer to signalering komplekser: mTORC1 og mTORC2. mTORC1 er følsom over for rapamycin og kontrol proteinsyntese og cellulær metabolisme, mens mTORC2 er afgørende for cellelevedygtighed [15]. mTORC2 er også kendt for sin rolle i phosphorylering af Akt ved Ser473 tillader fuld aktivering og proteasomalaktivitet nedbrydning [16-18]. Akt aktivering og /eller overekspression er en afgørende faktor for CDDP følsomhed i human OVCA. Akt aktivering resulterer i stabilisering af en række caspaseinhibitorer [19,20] hæmmer mitokondrie p53 ophobning og frigivelse af død proteiner [21,22], og dæmper p53 phosphorylering og nuklear funktion [8]. I modsætning hertil Akt hæmning øger p53 phosphorylering (Ser

15) og CDDP følsomhed [8,23].

rapamycin-ufølsomme følgesvend af mTOR (Rictor) er en væsentlig del af komplekset mTORC2, og er nødvendig for dets fulde funktion [24]. Over-ekspressionen af ​​Rictor øger mTORC2 aktivitet og fremmer cellevækst og motilitet [25]. Omvendt Rictor nedregulering undertrykker celledeling og tumor dannelse i visse kræftformer [26-28]. Rictor interagerer også med den integrin-linked kinase (ILK) at fremme cancer celleoverlevelse via Akt Ser473 phosphorylering, og med PKCζ for cancercelleinvasion og metastase [29,30]. Rictor er nødvendig for udvikling af prostatacancer induceret af PTEN tab [31]. Målretning Rictor inducerer cellecyklusstop på G1 fasen og formindsker cyklin D1 udtryk i bryst-, tyktarms- og prostatakræft celler [27,32]. Desuden nedregulering af mTORC2 letter kemoterapeutisk lægemiddel-induceret apoptose i brystcancerceller [33]. Imidlertid rolle Rictor i CDDP-resistens i OVCA fortsat ukendt.

p53 er en tumorsuppressor protein, der påvirker nedstrømseffektorer af apoptose gennem både transkription-afhængige og -uafhængige mekanismer [8,21]. Det er normalt aktiveres af CDDP via fosforylering på Ser15 og Ser20, som er afgørende for dens pro-apoptotiske egenskaber, og undertrykkelse af murine dobbelt minutter 2 (MDM2) og dens ubiquitinering og proteasomalaktivitet nedbrydning [34-36]. Vi har for nylig påvist, at tab af p53-funktion ved inaktivering eller mutation negativt påvirker apoptose og kemosensitivitet [7,37]. Celler, der mangler funktionelt p53 undlader at inhibere mTORC1 som respons på DNA-skade [38]. Imidlertid er koordinering og kommunikation mellem p53 status og Rictor i reguleringen af ​​kemoresistens dårligt forstået.

I den foreliggende undersøgelse, vi hypotesen, at Rictor spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​kemosensitivitet af OVCA celler, og at dens down- regulering sensibiliserer kemoresistent OVCA celler til CDDP behandling ved at lette Akt-afhængig proteasomalaktivitet nedbrydning, på en måde, afhængig af p53-status. Resultaterne af denne undersøgelse hæve den mulighed, at Rictor kan være en terapeutisk mål for OVCA, selv om effektiviteten af ​​en sådan ansøgning vil sandsynligvis være afhængig af p53 status.

Materialer og metoder

Reagenser

RPMI 1640 og DMEM /F12 dyrkningsmedier, kalvefosterserum (FBS), ikke-essentielle aminosyrer, penicillin, streptomycin og amphotericin B var fra Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). CDDP, dimethylsulfoxid (DMSO), Hoechst 33.248, aprotinin, natriumorthovanadat (Na

3VO

4), phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kanin polyklonale antistoffer: anti-phospho-Ser

473-Akt, anti-phospho-Ser

450-Akt, anti-Akt, anti-phospho-Ser

15-p53, anti-PARP og monoklonalt kanin anti-Rictor antistof blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Beverly, CA, USA). Muse monoklonalt anti-p53 og anti-GAPDH antistoffer var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) og Abcam (Cambridge, MA, USA), hhv. Ged anti-mus og anti-kanin sekundære antistoffer var fra Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA). Rictor og p53 siRNA blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Beverly, CA, USA). Kontrol siRNA var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Lipofectamine 2000 RNase A, N, N, N ‘, N’-tetramethyl-ethan-1,2-diamin (TEMED), TRIzol og ROX farvestof var fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). RNeasy Mini Kit var fra Qiagen (Valencia, CA, USA). Adenovirus-konstruktioner indeholdende WT-p53 og eGFP transkripter var fra Vector Biolabs (Philadelphia, PA, USA). Epoxomycin og lactacystin var fra EMD Chemical (Gibbstown, NJ, USA). Z-DEVD-FMK og Z-VAD-FMK var fra Tocris Bioscience (Ellisville, MO, USA). Rictor og GAPDH RNA-primer var fra Bioneer (Daejeon, Sydkorea) og human rekombinant aktiv caspase 3 var fra BioVision (Mountain View, CA, USA). PIPES, DL-dithiothreitol (DDT), ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og 3 [(3-cholamido-propyl) dimethyallonio] -1-propansulfonat hydrat (Chaps) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA) .

cellelinjer og Kultur

CDDP følsom (OV2008 og A2780s) og modstandsdygtig (C13 *, OVCAR-433, A2780cp, OCC-1, og SKOV3) humane OVCA cellelinjer var generøst leveres af Drs. Rakesh Goel og Barbara Vanderhyden (Ottawa Hospital Cancer Center, Ottawa, ON, Canada). Cellerne blev holdt i RPMI 1640 og DMEM /F-12 som tidligere rapporteret [20,21,36]. Den OV2008 cellelinien og dens modstandsdygtige modstykke C13 * stammede fra æggestokkene endometrioide adenokarcinom med pladedifferentiering. OCC-1, A2780s og A2780cp celler stammede fra udifferentierede ovariecarcinom tumorer. SKOV3-celler var af en klar cellecarcinom oprindelse [39] og OVCAR433 celler var af serøse cystadenocarcinomas i æggestokkene [23]. Efter de indikerede behandlinger, blev cellerne høstet til analyse.

Protein ekstraktion og Western blotting-analyse

Procedurerne for proteinekstraktion og Western blotting-analyse blev udført som tidligere beskrevet [40]. Membraner blev inkuberet ved 4 ° C natten over med anti-Rictor (1: 100), phospho-Ser

473-Akt (1: 1000), phospho-Ser

450-Akt (1: 1000), p53 ( 1: 5000), phospho-Ser

15-p53 (1: 1000) og PARP (1: 2000) antistoffer og 1 time ved stuetemperatur i anti-GAPDH (1: 10.000) og HRP-konjugeret kanin eller mus sekundært antistoffer (1: 5000 til 1: 10.000). GAPDH blev valgt som lastning kontrol siden sin cellulære indhold i OVCA celler undersøgt i de igangværende undersøgelser ikke påvirkes af CDDP behandling. Band densiteter blev analyseret for kvantificering under anvendelse af en ChemiDOC

TM XRS + (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)

Vurdering af Apoptose

Apoptose blev vurderet baseret på cellulær morfologi ved hjælp af nuklear plet Hoechst 33258. fremgangsmåden blev udført som tidligere beskrevet [20,36]. Et minimum af 400 celler pr behandlingsgruppe blev talt og tælleren blev blindet at undgå eksperimentel forspænding

siRNA transfektion

OVCA celler blev transficeret med Rictor siRNA (0-100 nM; 48 h). p53 siRNA (100 nM; 48 h), eller kontrol siRNA (0-100 nM; 48 h) og behandlet derefter med CDDP (0-10 uM; 24 h), som tidligere beskrevet [20], og høstet til yderligere analyse .

adenoviral infektion

A2780cp og SKOV3-celler blev inficeret med adenovirale wt-p53 (MOI = 10; 24 h GFP som kontrol) som beskrevet tidligere [9,20]

.

In vitro caspase-3 aktivitet

In vitro caspase-3 aktivitet blev udført med helcellelysater af OV2008 som tidligere beskrevet [23].

Statistisk analyse

Resultater udtrykkes som middelværdien ± SEM af mindst tre uafhængige forsøg. Statistisk analyse blev udført ved parret t-test, og en-vejs eller to-vejs ANOVA er relevant, ved hjælp SigmaPlot® 12 (Systat Software Suite, IL, USA). Forskelle mellem flere forsøgsgrupper blev bestemt ved Bonferroni post-hoc test. Statistisk signifikans blev udledt ved P 0.05.

Resultater

CDDP nedregulerer Rictor indhold og inducerer apoptose i chemosensitive men ikke resistente OVCA celler

For at afgøre om Rictor indhold ændres under CDDP behandling i OVCA, chemosensitive OVCA (OV2008 og A2780s) og kemoterapi (C13 *, A2780cp *, OVCAR433, OCC1 og SKOV-3) OVCA cellelinjer blev behandlet med CDDP (0-10 uM; 24 h) og Rictor indhold blev vurderet ved immunoblotting [Figur 1 ]. CDDP betydeligt nedreguleret intakt Rictor indhold (200 kDa) og induceret apoptose i chemosensitive (OV2008, *** P 0,001 og A2780s, ** P 0,01), men ikke i kemoterapi OVCA uanset CDDP koncentration (C13 *, A2780cp, OVCAR433, OCC1 og SKOV-3; p 0,05). Disse resultater viser at Rictor ikke udsættes for nedregulering af CDDP i kemoresistent OVCA celler, et fænomen, der kan bidrage til den resistente fænotype.

Rictor proteinekspression nedreguleres i chemosensitive (OV2008 og A2780s) men ikke kemoterapi OVCA (C13 * og A2780cp *) under CDDP behandling (0-10 uM CDDP, 24 h). Nedsat Rictor indhold i OV2008 og A2780s følgende CDDP behandling var forbundet med øget apoptose. Rictor proteinindhold i kemoterapi OVCA (OVCAR433, OCC1 og SKOV3) blev ikke påvirket af CDDP. Rictor indhold blev normaliseret mod GAPDH (lastning kontrol). Et repræsentativt Western blot fra tre uafhængige forsøg er vist. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SEM for tre uafhængige forsøg. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, # p 0,05 (vs CTL i sensitive celler). Hoechst 33258 farvning blev anvendt til vurdering af apoptose som nævnt i eksperimentelle procedurer.

CDDP inducerer Rictor behandling og kemosensitivitet i et caspase-3- og proteasom-afhængig måde

For at afgøre, om CDDP-induceret Rictor nedregulering kan skyldes posttranslationel processering, vi først undersøgt muligheden for caspase-afhængig spaltning af Rictor i OV2008 og A2780s når de behandles med den pan-caspase inhibitor Z-VAD FMK (10 uM) før ( 30 min) og under CDDP udfordring (0-10 uM; 24 h). OV2008 celler behandlet med CDDP alene udviste en intakt Rictor (200 kDa) og to immunoreaktive spaltede produkter, der migrerede ved 160 kDa og 130 kDa [Figur 2]. CDDP faldt intakt Rictor indholdet og 160 kDa-protein, men markant øgede niveauerne af 130 kDa-båndet. Selvom behandling af A2780s med CDDP resulterede også i nedregulering af intakt Rictor (200 kDa) blev niveauet af 160 kDa-protein markant forhøjet mens den 130 kDa ikke var signifikant påvirket. Forbehandling af cellerne med caspaseinhibitoren betydeligt svækkede de CDDP-inducerede ændringer i intakte og spaltede Rictor indholdet i begge sensitive celler (P 0,05 og P 0,01 i OV2008 og A2780s henholdsvis figur 2), hvilket antyder, at CDDP ned -regulates Rictor delvist af øgede caspase aktivitet, og at spaltning på forskellige caspase konsensus sites kan være involveret. Desuden forbehandling af OVCA celler med den specifikke caspase-3 inhibitor Z-DEVD-FMK producerede lignende resultater, hvilket viser, at caspase-3 er involveret i CDDP-induceret Rictor forarbejdning. Interessant, mens CDDP-induceret apoptose i både chemosensitive cellelinier, forbehandling af cellerne med enten den pan-caspase eller specifik caspase-3-inhibitor svækkede denne reaktion, hvilket antyder, at CDDP inducerer Rictor behandling af caspase-3 og dysregulering af denne proces giver kemoresistens i OVCA celler

OV2008 og A2780s blev forbehandlet med Z-VAD FMK (10 uM) og Z-DEVD FMK (50 uM) i 30 minutter før og under CDDP udfordring. (0-10 uM; 24 h) og Rictor indhold og apoptose blev vurderet. OV2008 celler behandlet med CDDP alene udviste en intakt Rictor (200 kDa) og to spaltede produkter (160 kDa og 130 kDa). CDDP faldt intakt Rictor indhold og 160 kDa-protein, men markant forøgede niveauer af 130 kDa-båndet. Behandling af A2780s med CDDP resulterede i nedregulering af intakt Rictor men steg niveauet af 160 kDa-protein og havde ingen effekt på 130 kDa-proteinet. Forbehandling af cellerne med den pan-caspase inhibitor (Z-VAD) eller den særlige caspase-3 inhibitor (Z-DEVD) signifikant svækkede de CDDP-inducerede ændringer i intakte og spaltede Rictor indholdet i begge sensitive celler, og CDDP- induceret apoptose blev betydeligt, men ikke fuldstændigt svækket ved tilstedeværelsen af ​​inhibitorerne i begge chemosensitive cellelinier. Rictor indhold blev normaliseret mod GAPDH (lastning kontrol). Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SEM (n = 3 og n = 5 i OV2008 og i A2780s henholdsvis). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 (vs respektive kontroller). Hoechst 33258 farvning blev anvendt til vurdering af apoptose som nævnt i eksperimentelle procedurer.

For at afgøre, om proteasomalaktivitet nedbrydning spiller en rolle i CDDP-induceret Rictor nedregulering, OV2008 celler dyrket [30 min før behandling; 24 timer under behandling med CDDP (0-10 uM)] med Proteasominhibitorerne epoxomycin (10 nM) og lactacystin (4 uM). Henviser CDDP alene betydeligt nedreguleret intakt Rictor og induceret apoptose, som forventet, tilstedeværelsen af ​​inhibitorerne blokerede fuldstændigt CDDP-induceret Rictor nedregulering og væsentligt, men ikke fuldstændigt svækket apoptose, hvilket fremgår af PARP-spaltning og nuklear morfologi (P 0,001; Figur 3:. A)

A. OV2008 celler blev forbehandlet (30 min) med proteasomalaktivitet inhibitorer [epoxomycin (10 nM) og lacytasystin (4 uM)] og underkastet CDDP udfordring (0-10 uM; 24 h). Rictor indhold og apoptose blev analyseret ved Western blotting og vurdering cellekernemorfologi. Både epoxomicin og lactacystin effektivt blokeret CDDP-induceret Rictor nedbrydning (P 0,001), men kun delvist svækket apoptose. B. OV2008-celler blev dyrket under de samme betingelser som i A, men forbehandlet med proteasominhibitor og /eller Z-DEVD (50 uM). blev ikke observeret nogen synergistisk virkning mellem de to inhibitorer. C. Inkubation af OV2008 helcellelysat (30 min, 30 ° C) med rekombinant aktiv caspase-3 (5-20 ug /ml) resulterede i Rictor spaltning som vist ved formindsket intakt Rictor indhold (200 kDa) og voksede i det spaltede former (130 kDa og 160 kDa). Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SEM for tre uafhængige forsøg. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 (vs respektive kontroller). Hoechst 33258 farvning blev anvendt til vurdering af apoptose som nævnt i eksperimentelle procedurer.

Vi derefter undersøgt yderligere, hvis Rictor behandling ved caspase-3 aktivitet og proteasomalaktivitet nedbrydning sker i separate veje. OV2008 celler blev dyrket [30 min forbehandling; 24 timer under behandling med CDDP (0-10 uM)] med proteasominhibitorer og /eller specifik caspase-3 inhibitor. De samme resultater blev observeret, når enten inhibitor var til stede. Men ingen yderligere virkning blev observeret, når begge hæmmere blev brugt sammen [Figur 3: B]

Desuden at give yderligere bevis for, at Rictor behandling induceret af CDDP behandling er caspase-3 afhængig, hel cellelysater fra. OV2008 celler blev anvendt til at udføre en

in vitro

caspase-3-aktivitet assay.

in vitro

data var i overensstemmelse med det, der opnås fra cellen linje eksperimentet [Figur 3: C]. Taget sammen indikerer disse resultater, at CDDP nedregulerer intakt Rictor på proteinniveauet via caspase-3 spaltning og proteasomalaktivitet nedbrydning.

Rictor knockdown sensibiliserer kemo-resistente OVCA til CDDP-induceret apoptose

at etablere rolle Rictor i OVCA kemoresistens blev Rictor ekspression i en wt-p53 kemoresistent OVCA cellelinje (C13 *) til tavshed af siRNA (0, 50 og 100 nM; 48 h) før behandling med CDDP (10 uM; 24 h), og apoptose blev vurderet. Intakt Rictor og dens spaltede former blev signifikant nedreguleret af siRNA i en koncentrationsafhængig måde. Et signifikant fald i intakt Rictor og spaltes Rictor blev observeret ved 50 nM (p 0,05) og en reduktion på ca. 100 nM 30%, uanset tilstedeværelsen af ​​CDDP. Disse resultater ikke blot bekræftet, at 160kDa og 130 kDa immunoreaktive bånd faktisk blev kløvet produkter af Rictor, men også vist, at Rictor knockdown induceret apoptose (p 0,05) samt forbedret CDDP-induceret apoptose i en koncentrationsafhængig måde (p 0,001) [Figur 4]. Disse resultater antyder, at Rictor er en vigtig determinant for CDDP resistens i OVCA

C13 * celler blev transficeret med Rictor siRNA. (0-100 nM; 48 h) og dyrket med eller uden CDDP (10 uM; 24 timer ). Rictor knockdown væsentligt forbedret CDDP-induceret apoptose i C13 * celler i en koncentrationsafhængig måde. Resultater udtrykkes som middel ± SEM for tre uafhængige forsøg. * P 0,05, *** p 0,001 (vs respektive CTL siRNA). Hoechst 33258 farvning blev anvendt til vurdering af apoptose som nævnt i eksperimentelle procedurer.

Apoptotisk respons på CDDP efter Rictor nedregulering er afhængig af p53 status

tumorsuppressor p53 er en vigtig mediator af CDDP-induceret apoptose [9,22]. Da omkring 50% af OVCA patienter bærer

TP53

genmutation (s) [41], er det af interesse at bestemme, om CDDP-induceret apoptose i kemoresistent celler efter Rictor knockdown er afhængig af tilstedeværelsen af ​​et funktionelt p53 . For at undersøge denne mulighed, Rictor ekspression i kemoterapi OVCA cellelinier med varierende p53 status (wt-p53, C13 * og OVCAR433; p53-mutant, OCC1 og A2780cp; p53-null, SKOV3) blev stille med Rictor siRNA (100 nM siRNA, 48 h) før behandling med CDDP (0-10 uM, 24 timer). Rictor knock-down betydeligt sensibiliseret kemoresistent wt-p53-celler (C13 * og OVCAR433, Figur 5: A; P 0,001), men ikke p53-deficiente celler (OCC1, Figur 6: A; A2780cp og SKOV3, Figur 5: B) til CDDP-induceret apoptose, hvilket tyder på, at der kan være behov et funktionelt p53 for CDDP-induceret apoptose i kemoterapi OVCA celler med Rictor knockdown. For yderligere at undersøge denne hypotese, CDDP-resistente OVCA cellelinier indeholdende en p53 mutation (A2780cp) og en p53-nul-linie (SKOV-3) blev behandlet med Rictor siRNA (0-100 nM; 48 h), efterfulgt af rekonstituering af vildtype p53 via adenoviral infektion (0-10 MOI; 24 h) og CDDP-behandling (0-10 uM CDDP; 24 h). Som vist i figur 5: B, mens Rictor knockdown alene forøgede ikke signifikant CDDP følsomhed i fravær af vildtype-p53, wt-p53 rekonstitution væsentligt forbedret virkningerne af Rictor-knockdown på CDDP-induceret phospho-p53 Ser15 indhold og apoptose i både p53-mangelfulde cellelinjer (p 0,001).

kemoterapi OVCA cellelinier med varierende p53 status (vægt-p53, C13 * og OVCAR433; p53-mutant, OCC1 og A2780cp, p53-null, SKOV3) blev transficeret med Rictor siRNA (100 nM siRNA, 48 h) med eller uden adenoviral wt-p53-infektion (0-10 MOI, 24 h; p53-deficiente celler) og CDDP-behandling (0-10 uM CDDP; 24 h). Rictor, p-p53 ser15, p53, PARP og GAPDH indhold, samt apoptose blev vurderet. Rictor knock-down betydeligt sensibiliserede kemoterapi wt-p53 celler (A, C13 * og OVCAR433; P 0,001), men ikke p53-difficient celler (A, OCC1, B, A2780cp og SKOV3) til CDDP (10 uM) -induceret apoptose. Rekonstituering i A2780cp og SKOV-3 af vildtype-p53 væsentligt forbedret CDDP-induceret apoptose (P 0,001). Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SEM for tre uafhængige forsøg. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 (vs respektive CTL siRNA), # # # p 0,05 (vs styrer Adenoviral infektion). Hoechst 33258-farvning blev anvendt til vurdering af apoptose som nævnt i eksperimentelle procedurer.

kemoresistent OVCA celler (C13 *) blev transficeret med Rictor siRNA (100 nM siRNA, 48 h) og forbehandlet med epoxomycin (0 -12.5 nM) 30 minutter før CDDP-behandling (0-10 uM CDDP; 24 H). Rictor, Akt, phospho- Akt (Thr450 og Ser473), og GAPDH indhold, samt apoptose blev vurderet. Rictor knock-down væsentligt forbedret CDDP-induceret apoptose i kemoterapi OVCA celler (P 0,01 og P 0,001 henholdsvis), og denne virkning blev reddet af epoxomycin (P 0,05 og p 0,001 henholdsvis) Total-Akt blev væsentligt reduceret i løbet af Rictor silencing med CDDP-behandling (P 0,05) og en massiv stigning i forholdet mellem phospho-Akt (Ser473) og total-Akt blev også observeret, hvilket signifikant nedsat, når epoxomycin blev tilsat (P 0,001 og P 0,05, henholdsvis) resultater er præsenteret som gennemsnit ± SEM for tre uafhængige forsøg. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 (vs respektive CTL siRNA), # # p 0,01, # # # p 0,05 (vs uden epoxomycin). Hoechst 33258 farvning blev anvendt til vurdering af apoptose som nævnt i eksperimentelle procedurer.

Rictor nedregulering sensibiliserer kemoterapi celler til CDDP-induceret apoptose ved at lette Akt proteasomalaktivitet nedbrydning

Rictor er kendt at være nødvendig for mTORC2 til phosphorylering Akt ved Ser473. At undersøge om og hvordan Akt er relevant for dette fænomen, var kemoterapi OVCA celler (C13 *) Rictor udtryk bragt til tavshed af siRNA (100 nM, 48 h) før forbehandling med epoxomycin (12,5 nM, 30 min) og behandling med CDDP (10 uM; 24 h), og apoptose blev vurderet. Rictor knockdown alene øgede phospho-Akt indhold (Ser473), men faldt niveauerne af phospho-Akt Ser450 [Figur 6], et phosphoryleringssite vides at blive reguleret i Akt stabilitet [18]. Stigningen i Akt phosphorylering ved Ser473 følgende Rictor silencing uden proteasomalaktivitet inhibitoren blev ledsaget af Akt nedregulering (P 0,05 i behandlingsgruppe) og blev reddet af proteasomalaktivitet inhibitor (p 0,05). Apoptoseinduktion uanset tilstedeværelsen af ​​CDDP, to svar svækkede ved tilstedeværelsen af ​​proteasominhibitor epoxomycin (figur 6; p 0,05 og P 0,001 i kontrol og CDDP behandlingsgrupper henholdsvis). Endvidere er forholdet mellem phospho-Akt ved Ser473 og total Akt blev også markant forøget i Rictor knockdown med CDDP-behandling og væsentligt nedsat, når epoxomicin blev tilsat (P 0,001 og p 0,05; med og uden epoxomycin henholdsvis). Disse resultater antyder, at Rictor spiller en rolle i Akt stabilisering og CDDP resistens i human OVCA og dens knockdown fremmer Akt proteasomalaktivitet nedbrydning og forøger CDDP følsomhed.

Discussion

kemoresistens er en stor terapeutisk forhindring i æggestokkene cancer og dets cellulære mekanisme er kompleks og dårligt forstået. Selvom mTOR signalvejen er kendt for at fremme celleproliferation og overlevelse, hvad enten Rictor er involveret i kontrollen af ​​kemosensitivitet er ukendt. I den foreliggende undersøgelse har vi undersøgt den rolle, Rictor i CDDP resistens ved anvendelse CDDP-følsomme og resistente OVCA cellelinier med forskellig p53 status. Vi har vist for første gang, at Rictor er en afgørende faktor for CDDP modstand i OVCA. CDDP nedregulerer Rictor indhold i chemosensitive celler ved caspase-3 og proteasom-afhængige nedbrydning, men ingen lignende virkning blev observeret i resistente celler. Desuden har vi vist, at Rictor undertrykker CDDP-induceret apoptose og bibringer resistens ved at aktivere og stabilisere Akt. Silencing Rictor sensibiliserer kemoresistent OVCA celler til CDDP-induceret apoptose i celler indeholdende vildtype-p53, men ikke i p53-kompromitterede celler medmindre rekonstitueres med et funktionelt p53. Tilsammen disse data understøtter den hypotese, at Rictor nedregulering sensibiliserer kemoterapi OVCA celler til CDDP behandling ved at lette Akt-afhængig proteasomalaktivitet nedbrydning, på en måde, afhængig af p53 status.

Vores nuværende undersøgelse viser, at Rictor er nede -regulated på protein, men ikke mRNA-niveau (data ikke vist), og denne proces er forbundet med CDDP-induceret apoptose i følsomme OVCA celler, og at Rictor spiller en rolle i celle skæbne bestemmelse. Denne observation understøttes yderligere med forskningsresultater via forskellige kemoterapi OVCA cellelinjer med forskellig p53 status, i, at den manglende af CDDP at nedregulere Rictor indhold gør det muligt for cellerne at overleve CDDP behandling. Rolle Rictor i celle overlevelse er tidligere blevet påvist, og en undersøgelse har behandlet den opfattelse, at Rictor og proteiner i mTOR pathway er nedreguleret via proteasomet-ubiquitinreaktionsvejen i lungekræft celler efter kemoterapeutisk udfordring, den mulige inddragelse af Rictor forarbejdning i kontrollen af ​​kemosensitivitet blev ikke behandlet [26]. Vores resultater viser, at CDDP inducerer Rictor nedregulering via proteasomet er i overensstemmelse med dette fund. Desuden har vores nuværende undersøgelser udvidet ovenstående konklusioner ved at vise, at caspase-3 er nødvendig for CDDP induceret Rictor forarbejdning i chemosensitive humane OVCA celler. Taget sammen antyder disse resultater, at Rictor bibringer CDDP resistens i human OVCA og CDDP-induceret Rictor nedregulering afhænger både caspase-3-aktivitet og proteasomalaktivitet nedbrydning i chemosensitive, men ikke i kemoterapi OVCA cellelinier.

Tumor suppressor

TP53

er også en af ​​de hyppigst muterede gener i menneskets OVCA, og kunne være så højt som 50% i OVCA patienter [41]. Tab eller mutation af p53 kan have en enorm indflydelse på tumor aggressivitet, prognose og vellykket installering af artikler behandling [42]. Da mekanismen for CDDP-resistens er multifaktoriel og p53 status er en af ​​de største problemer i human OVCA, har vi undersøgt forholdet mellem Rictor og tumor suppressor p53, i det aspekt af kemoresistens. Vores undersøgelse derfor yderligere adresser den rolle Rictor i CDDP modstand og viser, at Rictor knockdown ikke kun fremmer apoptose, men også forbedrer CDDP-induceret apoptose i humane OVCA celler. Dette resultat korrelerer med en nylig undersøgelse, der viser, at målretning af Rictor forhindrer celle migration og fremmer apoptose i brystkræft [23]. Resultater fra vores aktuelle undersøgelse viser også, at sensibiliserende kemoresistent OVCA celler ved silencing Rictor synes at afhænge af p53-status. Denne opfattelse understøttes yderligere af den observation, at en kombination af Rictor knockdown og rekonstituering af wt-p53 øger apoptose i p53-kompromitterede celler, når fremkaldt af CDDP behandling, et resultat, der ikke eventuate uden wt-p53. Sidstnævnte reaktion sker samtidig med en stigning i p53-aktivering gennem phosphorylering ved ser15 rest, der ændrer p53 struktur og inhiberer p53-MDM2-interaktion, hvorved stabiliserende p53 [35]. Dette kunne være årsagen til stabilisering p53 observeret i A2780cp og SKOV-3 i tilstedeværelsen af ​​phospho-p53 (ser15). Tilsammen disse observationer tyder på, at Rictor knockdown inducerer apoptose og øger CDDP-induceret apoptose i en p53-afhængig måde.

Akt signalvejen er en afgørende faktor for kemoresistens og dens aktivering fremmer en kemoterapi fænotype, hyppigt påvist i så højt som 87% af tilfældene i human OVCA [10].