PLoS ONE: Den lncRNA PVT1 Bidrager til livmoderhalskræft Fænotype and Associates med dårlig Patient Prognose

Abstrakt

plasmacytom variant translokation 1-genet (

PVT1

) er en lncRNA, der er blevet udpeget som et onkogen på grund af dets bidrag til fænotype af flere kræftformer. Selvom den mekanisme, hvormed

PVT1

påvirker sygdomsprocesser er blevet undersøgt i flere typer kræft, dens rolle i cervikal tumorigenese fortsat ukendt. Således blev den nuværende undersøgelse designet til at undersøge den rolle,

PVT1

i livmoderhalskræft

in vitro

in vivo

.

PVT1

udtryk blev målt ved kvantitativ PCR (qPCR) i 121 invasive cervikale carcinom (ICC) prøver, 30 normale livmoderhalsen prøver, og livmoderhalsen cellelinjer. Funktionelle assays blev udført under anvendelse af både siRNA og LNA-medieret knockdown at undersøge

PVT1 ‘

s virkninger på livmoderhalskræft celleproliferation, migration og invasion, apoptose, og cisplatin modstand. Vores resultater viser, at

PVT1

udtryk øges betydeligt i ICC væv versus normal livmoderhalsen og at højere udtryk for

PVT1

korrelerer med dårligere samlet overlevelse. I livmoderhalskræft cellelinjer,

PVT1

knockdown resulterede i signifikant nedsat celleproliferation, migration og invasion, mens apoptose og cisplatin cytotoksicitet blev forøget betydeligt i disse celler. Endelig viser vi, at

PVT1

udtryk forstærkes som respons på hypoxi og immunrespons stimulation og at denne lncRNA forbinder med den multifunktionelle og stress-responsive protein, Nucleolin. Kollektivt, vores resultater giver stærke beviser for en onkogen rolle

PVT1

i livmoderhalskræft og låne indsigt i potentielle mekanismer, som

PVT1

overekspression hjælper drive livmoderhalskræft carcinogenese.

Henvisning : Iden M, Fye S, Li K, Chowdhury T, Ramchandran R, Rader JS (2016) den lncRNA

PVT1

Bidrager til livmoderhalskræft Fænotype and Associates med dårlig Patient Prognose. PLoS ONE 11 (5): e0156274. doi: 10,1371 /journal.pone.0156274

Redaktør: Bibekanand Mallick, National Institute of Technology, Rourkela, INDIEN

Modtaget: August 15, 2015; Accepteret: 11 maj 2016; Udgivet: May 27, 2016

Copyright: © 2016 Iden et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af kvinders sundhed Research Program på Medical College of Wisconsin (https://obgyn.mcw.edu/research/whrp/). De finansieringskilder havde ingen rolle i nogen del af udarbejdelsen af ​​dette manuskript

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lang kodende RNA’er ( lncRNAs) giver vigtige mål for diagnostik og terapi kræft på grund af deres afgørende rolle i mange cellulære processer såsom epigenetiske forandringer, gen forstærker og tumor suppressor aktivitet og miRNA sekvestrering. LncRNAs er udbredt i genomet, ofte vise celle type- og tidsmæssig regulering af genekspression, og kan påvirke mange cellulære processer via flere forskellige mekanismer [1]. Plasmacytom variant translokation 1 (

PVT1

) er et højt konserveret lncRNA ~ 50 kb nedstrøms for

MYC Hoteller, som har tiltrukket stor opmærksomhed fra kræftområdet på grund af sin hyppige co-forstærkning med

MYC

i flere faste tumorer [2]. De første undersøgelser, der beviser, at

PVT1

kan bidrage til carcinogenese viste hyppige translokationer i mus plasmacytomer [3,4] og humane Burkitts lymfomer [5-7]. De onkogene virkninger af

PVT1

er blevet yderligere fremhævet af flere nyere undersøgelser der viser dets overekspression og forstærkning i flere typer kræft [8-17]. Endnu vigtigere er,

PVT1

udtryk er blevet signifikant korreleret med kliniske funktioner såsom risiko, tilbagefald og overlevelse i forskellige kræftformer [8,11-13,18].

På trods af den rigdom af viden vedrørende de onkogene egenskaber

PVT1

i flere kræftformer, meget lidt er kendt om dens præcise biologiske funktion. Faktisk håndfuld undersøgelser giver

PVT1

mekanistiske data overordentlig tyder på, at det udøver sin virkning i en celle-type og /eller sygdom-specifik måde. For eksempel,

PVT1

funktion er blevet tilskrevet dets binding og stabilisering af Myc [19] og Nop2 [17] proteiner i bryst- og hepatocellulært carcinom, hhv. I gastriske cancerceller,

PVT1

virker til at undertrykke ekspressionen af ​​p15 og p16 via dens fysiske interaktion med Polycomb gruppe protein, EZH2 [20]. Også via EZH2 rekruttering og regulering af TSH receptor,

PVT1

inducerer spredning af kræft i skjoldbruskkirtlen celler [21]. Endelig beregningsmæssige analyse af

PVT1

tyder på, at det kan handle via binding og binding af mir-200 familiemedlemmer i brystkræft væv [14]. På grund af deres kompleksitet og bredde af resultater, disse undersøgelser understrege vigtigheden af ​​sygdomsspecifikke undersøgelse af

PVT1

mekanismer.

Vores interesse i

PVT1

stammede fra vores arbejde og andres demonstrerer, at det er en hyppig sted af HPV integration i livmoderhalskræft, yderligere antyder en vigtig biologisk funktion [22-24]. Således har vi forsøgt at bedre at definere den rolle,

PVT1

i cervikal carcinogenese ved at undersøge

PVT1

ekspressionsmønstre i livmoderhalskræft tumorer og cellelinjer og de funktionelle effekter af denne lncRNA på kræftrelaterede processer såsom proliferation, cellemotilitet, apoptose, og kemoresistens. Endelig fordi mange lncRNAs afhængige protein partnere til at udføre deres virkninger, vi ansat RNA affinitetskromatografi og massespektrometri sekventering at belyse livmoderhalskræft celle-specifikke

PVT1

bindende partnere.

Metoder

undersøgelsen protokol den blev godkendt af den institutionelle gennemgang bestyrelse Medical College of Wisconsin IRB (PRO00011466; Molekylær karakterisering af livmoderhalskræft).

Cell kultur

SiHa (ATCC HTB35 ™), HeLa (ATCC CCL2 ™), og DoTc2 4510 (ATCC ® CRL-7920 ™) humane livmoderhalskræft cellelinjer og HPV 16 E6 /E7-transformeret, normale ektocervikale celler (Ect1 /E6E7; ATCC CRL-2614 ™ ) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Livmoderhalskræft celler blev holdt i enten Eagles minimale essentielle medium (EMEM; SiHa og HeLa) eller Dulbeccos Modified Eagles Medium (MEM; DoTc2) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; ATCC). Ect1 /E6E7 celler blev opretholdt i keratinocyt-serumfrit medium (GIBCO) med 0,1 ng /ml humant rekombinant EGF, 0,05 mg /ml oksehypofyseekstrakt, og yderligere calciumchlorid 44,1 mg /l. Den ATCC godkender alle cellelinjer ved at undersøge deres korte tandem repeat (STR) dna-profiler. Celler blev holdt ved 37 ° C i høj fugtighed med en atmosfære af 95% luft og 5% CO

2. Celler blev høstet under anvendelse af trypsin-EDTA (0,25% trypsin, 0,53 mM EDTA, ATCC) og talt ved anvendelse af trypanblåt 0,4% opløsning (Amresco, Solon, OH) og hæmacytometer tællekammer. Til nogle eksperimenter, cisplatin (1 mM; Sigma, St. Louis, MO) blev rekonstitueret i destilleret vand og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse. Celler blev udsat for cisplatin ved en koncentration på 10 pM, 50 pM, og 100 pM i vækstmedier i 4 timer i dyrkningsmediet. Cisplatin-holdige dyrkningsmedier blev fjernet og erstattet med frisk vækstmedier 4 timer senere, og celler inkuberes ved 37 ° C natten over. Til forsøg undersøger

PVT1

ekspression efter hypoxi og immunrespons stimulation, SiHa-celler blev hver behandlet med cobaltchlorid (150 uM, Sigma) eller interferon alfa (IFN-α, 10 uM, Sigma) i 48 timer forud for RNA-ekstraktion (metoder). Endelig blev andre SiHa-celler behandlet med cyclohexamid (10 uM; Sigma). Til forskellige tidspunkter, inden de underkastes lysis for Myc Western blotting

Transfektioner

Celler (2,0 x 10

5) celler blev udpladet i en 6-brønds skål og fik lov at adhærere natten over. Cellerne blev derefter transficeret med 2 små interfererende RNA (siRNA) designet mod

PVT1

kombineret i et ækvimolært forhold (20 eller 40 nM, flexirør Hs_PVT1_5 og Hs_PVT1_6, Qiagen, Valencia, CA) eller en negativ kontrol siRNA (AllStar negativ kontrol; Qiagen) konjugeret med Alexa Fluor 488. Transfektioner blev udført ved anvendelse DharmaFECT1 (GE Dharmacon, Lafayette, CO) ifølge producentens anvisninger. Transfektionseffektiviteten blev overvåget via fluorescensmikroskopi og bekræftet via kvantitativ PCR (qPCR) 48 timer efter transfektion. siRNA transfektioner blev udført i både SiHa og HeLa livmoderhalskræft cellelinjer og udnyttes i proliferation, apoptose og celledød, og migration og invasion assays.

For låst nukleinsyre (LNA) oligonukleotid transfektioner, celler (2,0 x 10

5) blev udpladet i en 6-brønds skål og den følgende dag transfekteret med 10 nM PVT1_10 eller PVT1_15 LNA (Exiqon, Woburn, MA) eller et kodet kontrol LNA (Negative Control a Exiqon) under anvendelse DharmaFECT 1 (GE Dharmacon) ved en koncentration på 0,2 pi pr 100 pi vækstmedium. Sekvenserne af PVT1_10 LNA, PVT1_15 LNA og negative kontrol A er 5′-AACACGTCTATACGC-3 ‘, 5′-AGATCACTGTAAATCC-3′ og 5’-GGCAGGATCTATGGCA-3 ‘. Transfektion blev mediet erstattet med frisk vækstmedier 24 timer efter transfektion og nedstrøms assays udført 48 timer senere. LNA-transficerede SiHa celler blev anvendt til at bekræfte effekten af ​​siRNA transfektion på celleproliferation, til bestemmelse af virkningerne af

PVT1

knockdown på cisplatin lydhørhed, Myc nedbrydning eksperimenter, og virkninger på nucleolin-afhængig mRNA-ekspression.

RNA isolering, cDNA syntese, og kvantitativ PCR (qPCR)

RNA blev isoleret ved hjælp af Mirvana miRNA isolation Kit (Ambion, Austin, TX) og cDNA syntetiseret ved hjælp High-Capacity-RNA-til-cDNA Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). For nogle eksperimenter, lever dyrkede celler blev vasket med 1x PBS og adskilt i cytoplasmatiske og nukleare RNA dele ved brug af ikke-ioniske detergenter efter de PARIS kit instruktioner (Life Technologies). RNA blev isoleret fra hver portion og DNase behandlet under anvendelse af DNA-free kit (Life Technologies). Angivelse af

PVT1

,

MYC

og kontrol

RPS18

blev vurderet ved hjælp EvaGreen qPCR Mastermix (MidSci, St. Louis, MO) på en StepOnePlus Real-Time PCR System ( Life Technologies). Den termisk cykling program omfattede et første enzym aktiveringstrin ved 95 ° C i 10 min, efterfulgt af 40 cykler bestående af et 10sek denatureringstrin ved 95 ° C, og en 1 min annealing /forlængelsestrin ved 60 ° C for alle primere. Fluorescensintensiteten blev målt ved 62 ° C ved afslutningen af ​​hver cyklus. Forward og reverse primere til

PVT1

var 5′-CCGACTCTTCCTGGTGAAGC-3 ‘og 5′-GTATGGTCAGCTCAAGCCCA-3′, 5’-TACCCTCTCAACGACAGAG-3 ‘og 5’TCTTGACATTCTCCTCGGTG-3’ for

MYC

, og 5′-CTTCAGTCGCTCCAGGTCTT-3 ‘for

RPS18

(for data normalisering) .s for

PVT1

var 5′-CCGACTCTTCCTGGTGAAGC-3′ og 5′-GTATGGTCAGCTCAAGCCCA-3 ‘ , 5’-TACCCTCTCAACGACAGAG-3 ‘og 5’TCTTGACATTCTCCTCGGTG-3’ for

MYC

, og 5′-CTTCAGTCGCTCCAGGTCTT-3 ‘for

RPS18

(for data normalisering).

Angivelse af miRNA blev udført ved hjælp af TaqMan® miRNA tests (Life Technologies) for HSA-miR-1204 (002.872), HSA-miR-1205 (002.778), HSA-miR-1206 (002.878), HSA-miR-1207 -3P (002.826), HSA-mIR-1207-5P (241060_mat), HSA-mIR-1208 (002.880), og RNU48 (001.006; for data normalisering) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev RNA isoleret ved anvendelse Mirvana miRNA Isolation Kit og cDNA syntetiseres under anvendelse af TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies) med billede primere for hver miRNA. qPCR amplifikation blev derefter udført på et StepOnePlus Real-Time PCR System anvendelse af producentens parametre. Alle prøver blev analyseret i tre eksemplarer under anvendelse af 2- ΔΔCt metode til relativ genekspression, udtrykt som 2-ΔΔCt.

RNA fluorescerende in situ hybridisering (FISH) og immuncytokemi

ViewRNA TYPE 6 probe sæt ( Affymetrix, Santa Clara, Californien) designet mod

PVT1

(NR_003367.2) blev anvendt til at visualisere

PVT1

udtryk

in vitro

. Eksperimenter blev udført i overensstemmelse med producentens protokol under anvendelse af reagenser tilvejebragt i QuantiGene ViewRNA ISH Cell Assay Kit (Affymetrix). Kort fortalt blev SiHa-celler podet på 12 mm cirkulære dækglas og dyrket til 70-90% konfluens inden de fikseret med 4% formaldehyd. Celler blev derefter vasket med 1X PBS og inkuberet i 5 min i detergentopløsning for permeabilisering. Celler blev vasket en gang mere og inkuberet med Working proteaseopløsning i 25 min. Prober blev fortyndet (1: 100) i forvarmet probesæt Diluent og inkuberet med cellerne i 3 timer ved 40 ° C. Celler blev vasket, hybridiseret med Working Forforstærker Mix opløsningen i 30 minutter ved 40 ° C, vasket igen, og hybridiseret med Working Forstærker Mix opløsningen i 30 minutter ved 40 ° C. Efter mere vask blev cellerne hybridiseret med de mærkede prober i 30 minutter ved 40 ° C. Efter denne inkubation blev dækglassene vasket, farvet med DAPI, og monteret på objektglas. Celler blev afbildet med en Zeiss LSM510 konfokal mikroskop placeret i Børnenes Research Institute Imaging Core på Medical College of Wisconsin. Billeder blev behandlet i Adobe Photoshop CS5.1.

For co-farvning af Nucleolin med

PVT1

RNA FISH, immunocytokemi blev udført forud for farvning med DAPI trin ovenfor. Celler blev vasket 3 gange med PBS + 1% BSA og 0,1% Tween-20 og derefter blokeret ved stuetemperatur i 2 timer i blokeringspuffer (PBS + 10% BSA, 0% normalt æsel serum og 0,1% Tween-20). Dækglas blev derefter inkuberet ved 4 ° C natten over i blokerende buffer indeholdende et polyklonalt antistof rettet mod Nucleolin (1: 1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Celle blev igen vasket 3 gange og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur i blok opløsning indeholdende et FITC-konjugeret sekundært antistof til visualisering af Nucleolin. Efter en sidste vask blev dækglassene monteret under anvendelse Vectashield antifade Mounting Medium med DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) og afbildes som beskrevet ovenfor.

Celleproliferationsassay

Celleproliferation blev målt ved anvendelse af celleproliferation ELISA BrdU (kolorimetrisk) kit (Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ) ifølge fabrikantens protokol. Kort fortalt, 48 timer efter transfektion, 1,0 x 10

4 celler blev udpladet i en 96-brønds skål og fik lov at adhærere natten over. Celler blev derefter mærket med BrdU i 2 timer, fikseret og inkuberet med anti-BrdU-POD. Ubundne peroxidasekonjugater blev fjernet ved vask. Substrat blev derefter tilsat, og absorbansværdier (370 nM-492 nM) blev målt 15 min senere.

PrestoBlue® cellelevedygtighed assay blev også anvendt ifølge producentens anvisninger. SiHa-celler blev transficeret med LNA som beskrevet ovenfor. Otteogfyrre timer senere blev celler udpladet på en plade med 96 brønde (1,0 x 10

4 celler /brønd) og udsat for cisplatin (Sigma) ved en række koncentrationer mellem 10-200 uM i 4 timer. Cisplatin dyrkningsmedier blev fjernet og erstattet med vækstmedie efter 4 timers udsættelse og derefter inkuberet ved 37 ° C natten over. Den følgende dag fluorescensværdierne blev målt efter inkubation af celler med PrestoBlue® reagens i 1 time ved 37 ° C.

celledød og apoptoseassays

Celledød blev analyseret under anvendelse af celledød Detection ELISA Kit (Hoffmann-La Roche), som pr fremstilling retninger. Kort fortalt, 48 timer efter transfektion blev 0,5 x 10

5 celler høstet og lyseret. Cellular nukleosomer var bundet til den forberedte ELISA-pladen gennem histon komponenter. Anti-DNA-peroxidase blev tilsat, og ubundne peroxidasekonjugater blev fjernet ved vask. Substrat blev derefter tilsat, og absorbansværdier blev målt 15 min senere (405 nM-490 nM). Apoptose blev karakteriseret ved at måle aktiv caspase-3 (ng /mg samlet cellelysat) anvendelse af den humane Caspase-3 (Active) ELISA Kit (Life Technologies, Grand Island, NY). Tooghalvfjerds timer efter transfektion, celler (1,0 x 10

6) blev lyseret i Cell Extraction Buffer (Life Technologies) suppleret med Protease Inhibitor Cocktail (Sigma) og phenylmethansulfonylfluorid (Sigma).

Cellemigration og invasion assays

Otteogfyrre timer efter transfektion, medier indeholdende serum blev fjernet, og cellerne blev vasket med 1 x PBS og derefter dyrket i 24 timer i serumfrit EMEM. Efter sult periode blev cellerne høstet under anvendelse HyQTase og udpladet (1 x 10

5 celler) og onto Corning Transwell Permeable støtter (Corning, Tewksbury, MA). For migration assays blev Transwell membraner udlignet i vækstmedier 24 timer før celle såning. For invasion assays blev Transwell membraner coatet med Matrigel Matrix (Corning; 1: 6 i EMEM) og tørret i 6 timer ved 37 ° C. Celler blev dyrket i nærvær og fravær af kemoattraktant (EMEM + 20% FBS) og høstet 6 timer eller 48 timer senere for analyse af migration og invasion, hhv. Ikke-vandrende celler blev fjernet fra den øvre flade af Transwell membran med en vatpind, mens vandrende celler blev fikseret og farvet med krystalviolet (EMD Millipore, Billerica, MA) og visualiseret /talt under anvendelse af lysmikroskopi.

Western blotting

Frisk frosset cervikal væv eller 3,6 x 10

6 cellerne blev vasket med 1 x PBS og lyseret i 10 min på is under anvendelse af Cell Extraction Buffer (Life Technologies) suppleret med 1 mM PMSF (Sigma) og en blanding af proteaseinhibitor (Sigma). Ufordøjet cellerester blev pelleteret ved centrifugering ved 10.000 RPM og resterende lysat blev kvantificeret under anvendelse af Bradford-assay (Sigma). Lysat (20 ug) blev kørt ud på en Kriterium Tris-HCI polyacrylamidgel (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), overført til PVDF-membraner, blokeres med 1X TBS + 10% fedtfri tørmælk ved stuetemperatur i 1 time, og inkuberet med primært antistof (Myc eller Nucleolin, 1: 1000; Cell Signaling Technology) natten over ved 4 ° C. Den følgende dag blev membraner vasket, inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med HRP-konjugeret gede anti-kanin IgG (1: 5000; Cell Signaling Technology), og fremkaldt under anvendelse af ECL (Life Technologies). Kemiluminescens blev målt ved hjælp af Molecular Imager ChemiDoc XRS + (Bio-Rad Laboratories) og visualiseres proteinbånd blev kvantificeret ved hjælp af billede Lab Software (Bio-Rad Laboratories).

RNA affinitetskromatografi og massespektrometri sekventering

adskillige overlappende sense og antisense enkeltstrengede DNA oligonukleotider (ssDNA oligoer, 100 nt lang) blev genereret mod de komplette sekvenser af exon 2 og 9 i

PVT1

(NR_003367.3; Eurofins MWG Operon, Huntsville, AL) . Exon 2 og 9 blev valgt på grundlag af deres øgede tilbøjelighed til proteinbinding som bestemt

i silico

. ssDNA blev hybridiseret til opnåelse dobbeltstrenget DNA (dsDNA), som alle havde en T7-promotorsekvens i 5′-enden. T7-promotor-indeholdende dsDNA var

in vitro

-transcribed hjælp af MaxiScript T7-kittet (Ambion) og resulterende RNA blev derpå 3′-biotinyleret med Pierce Desthiobiotinylation kittet (ThermoScientific). Desthiobiotinylated RNA’er blev inkuberet med streptavidin-bundne magnetiske perler fra Pierce Magnetic RNA-protein pull-down Kit (Thermo Scientific) i henhold til fabrikantens protokol. Efter vask, 200 ug SiHa helcellelysat blev tilsat til RNA-bundne streptavidin magnetiske perler og inkuberet ved 4 ° C under forsigtig omrøring i 90 min. Efter 3 gange vask med vaskebuffer (Thermo Scientific 20164), blev RNA proteiner elueret i SDS-prøvebuffer og opløst ved SDS-PAGE på en 12% acrylamidgel. Efter sølvfarvning, protein bands af interesse blev massespektrometri sekventeret på Taplin massespektrometri Facility (Harvard Medical School, Boston, MA). Massespektrometri “hits” blev analyseret for antallet af unikke og samlede opnåede peptider og arealet under kurven. Hvert hit var

in silico

trypsin fordøjet og antallet af opnåede peptider med

in silico

fordøjelse blev sammenlignet med antallet af peptider opnået i de massespektrometriske resultater. Kun de proteiner, der havde 20% eller flere af de trypsinlignende fordøjelige fragmenter tilstedeværende blev anset for at være sande hits. Western blotting (som beskrevet ovenfor) efter RNA-affinitetskromatografi blev yderligere anvendt til at validere ægte hits.

RNA immunoprecipitation

RNA immunopræcipitation (RIP) assays blev udført ved anvendelse af Magna RIP RNA-bindende protein Immunopræcipitation kit (EMD Millipore) efter producentens instruktioner. Total cellelysat fra 1,7 x 10

7 SiHa-celler blev anvendt til immunpræcipitation med Myc og nucieolin antistoffer (samme som for Western blotting). Som en ikke-specifik IgG kontrol blev oprenset kanin IgG gennemføres parallelt. Efter protein fordøjelse, blev RNA ekstraheret og DNase behandlet under anvendelse af DNA-free kit (Life Technologies). Niveauer af

PVT1

blev kvantificeret i input og immunopræcipiteret RNA.

Dataanalyse og statistik

Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og forskelle mellem middelværdier blev analyseret ved hjælp af Students

t Salg test (to-halet). Resultater er blevet afbildet som middelværdi ± standardfejl på middelværdien. Cisplatin dosisresponskurver blev dannet ved anvendelse af en variabel hældning model. Alle statistiske analyser og plotning af data blev udført under anvendelse af GraphPad Prism 6.0 (La Jolla, CA), bortset overlevelse analyse, som blev udført under anvendelse SPSS11.0 software (Chicago, IL). Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev afbildet og sammenlignet ved hjælp af log-rank (Mantel-Cox) tests. P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante.

Resultater

PVT1

udtryk opreguleres i tumorer fra livmoderhalskræft kræftpatienter og korreleret med dårligere overlevelse

PVT1

er en multi-exon gen med dets tilgrænsende genomisk region indeholdende en klynge af 6 kommenterede microRNA (miRNA).

PVT1

og lokale miRNA ekspressionsniveauerne blev bestemt ved qPCR for kræft og tilstødende normale væv fra livmoderhalsen kræftpatienter.

PVT1

ekspression var betydeligt højere i tumorer fra cervikale cancerpatienter versus tilgrænsende normalt væv (n = 127 tumor; n = 30 tilstødende normale; p 0,001, Fig 1A). Ekspression af miRNA 1204 og 1206 (men ikke 1205, 1207-3p, 1207-5p eller 1208; S1A-S1D Fig) var signifikant højere i tumor versus normal tilstødende cervikal væv (Fig 1B og 1C). Notatet fordi

PVT1

og

MYC

ofte co-forstærket i kræft, vi desuden undersøgt udtryk for

MYC

i livmoderhalskræft og tilstødende normale væv. Selvom vi observerede en tendens til øget

MYC

i kræft i forhold til tilstødende normale, forskellen i gennemsnit udtryk for

MYC

var ikke statistisk signifikant mellem disse to grupper (S1E Fig).

(A)

PVT1

ekspression var betydeligt højere i primære cervikale tumorer (n = 127) sammenlignet med tilstødende normale cervikale væv (n = 30; p 0,001). Ekspression af miRNA 1204 (B; p 0,05) og 1206 (C; p 0,001), men ikke andre lokale miRNA, var også signifikant højere i cervikal tumorvæv (n = 38) sammenlignet med tilstødende normale væv (n = 18) . (D) Kaplan-Meier plot afsløret en sammenslutning af højere tumor

PVT1

niveauer med markant dårligere overlevelse gange i forhold til lavere

PVT1

niveauer (p = 0,03).

127 livmoderhalskræft patienter blev inddelt i høj og lav

PVT1

udtrykkende grupper, ved hjælp af medianen

PVT1

udtryk niveau, for at undersøge deres korrelation med prognose. Brug Kaplan-Meier overlevelsesanalyse og log-rank test, fandt vi, at høj

PVT1

udtryk var signifikant korreleret med kortere kumulativ overlevelse tid for livmoderhalskræft kræftpatienter (p = 0,03, Fig 1D). Sammen antyder disse data, at der generelt,

PVT1

udtryk er forhøjet i livmoderhalskræft tumorer, og at jo højere udtryk for

PVT1

, jo dårligere er prognosen.

PVT1

udtryk i livmoderhalskræft cellelinjer

for at begynde vores

in vitro

undersøgelse ind i rollen som

PVT1

i livmoderhalskræft celler, vi bestemt

PVT1

ekspressionsniveauer i forskellige kommercielt tilgængelige cervix-afledte cellelinier via qPCR (figur 2A). Ud af 4 cervikale linjer, HPV 16-positive SiHa celler udviste den højeste

PVT1

udtryk, mens den laveste

PVT1

udtryk blev observeret i HPV 16 E6 /E7-transformerede celler afledt fra normal ectocervix (Ect1 /E6E7). Dernæst søgte vi at identificere specifikke onkogene stressfaktorer, der kan drive forbedrede

PVT1

udtryk i livmoderhalskræft. Til dette formål har vi udsat SiHa celler (anvendt for resten af ​​vores undersøgelser) til forskellige transformative stimuli før måling virkningerne på

PVT1

udtryk via qPCR. Interessant fandt vi, at

PVT1

ekspression i SiHa-celler blev signifikant forøget i respons på 48 h inkubation med INF-α eller hypoxi mimetiske, cobaltchlorid (CoCl

2, Fig 2B). Andre stimuli, såsom epidermal vækstfaktor (EGF), insulin-lignende vækstfaktor (IGF), phorbol-12-myristat-13-acetat (protein kinase C-aktivator) og gamma-bestråling påvirkede ikke signifikant

PVT1

ekspression (data ikke vist). Endelig undersøgte vi subcellulære lokalisering af

PVT1

bruge RNA FISH og fundet udtryk for

PVT1

i både cytoplasmaet og kernen i SiHa celler. Endvidere kontrol antisense-transficerede SiHa (fig 2C) udviste lignende nukleare og cytoplasmatisk

PVT1

farvning, hvoraf var fraværende i

PVT1

knockdown celler (Fig 2D). Sammenfattende

PVT1

udtrykkes i forskellige cellelinier fra humant livmoderhalsen, kan udvides med immun- og hypoxiske stimuli, og er lokaliseret i hele kernen og cytoplasmaet tyder på, at denne lncRNA kan deltage i forskellige livmoderhalskræft celle processer , eventuelt via mere end én unik mekanisme.

(A)

PVT1

udtryk i kommercielt tilgængelige cervikale cellelinjer. Laveste

PVT1

ekspression blev observeret i HPV 16 E6 /E7-transformerede celler afledt fra normal ectocervix (E6 /E7-Ecto), mens SiHa cervical cancerceller opvise den største

PVT1

ekspression sammenlignet med 2 andre livmoderhalskræft-afledte linier (HeLa og DoTc2). (B) Ekspression af

PVT1

i SiHa-celler blev yderligere forøget ved 48h behandling med INF-α (10 uM) eller hypoxi mimetiske cobaltchlorid (CoCl

2; 150 pM). Repræsentative billeder af RNA FISH eksperimenter i SiHa-celler transficeret med enten kontrol (C) eller

PVT1

(D) LNAs. Kontrol LNA-transficerede celler udviste punktformig signaler til

PVT1

(rød) i både kernen (farvet med DAPI med blåt) og cytoplasmaet. Både nukleare og cytoplasmatisk

PVT1

farvning var fraværende i

PVT1

LNA-transficerede celler. Fase billede (nederste venstre panel) viser cellemorfologi. Scale bar (hvid) = 10 um. * P 0,05, ** p 0,01

PVT1

nedregulering aftager livmoderhalskræft proliferation, migration og invasion

Dernæst SiHa-celler transficeret med

PVT1

-targeted siRNA (siPVT1) blev anvendt til at undersøge virkningerne af denne lncRNA på livmoderhalskræft celledeling og motilitet. Transfektion med

PVT1

-targeting siRNAs resulterede i, i gennemsnit 70% knockdown af

PVT1

sammenlignet med kontrol-transficerede celler (Fig 3A). Endvidere var der ingen signifikant forskel i den lokale miRNA (1204-1208) eller

MYC

mRNA-ekspression i siPVT1 versus scrambled kontrol-transficerede celler (siCONT, S2 Fig). siPVT1-transficerede SiHa-celler udviste et signifikant fald i BrdU-inkorporering, et mål for replikerende celler, ved 72 h efter transfektion sammenlignet med siCONT, hvilket antyder, at

PVT1

spiller en rolle som drivkraft celleproliferation (Fig 3B). Disse virkninger af

PVT1

knockdown på SiHa proliferation blev også bekræftet ved transfektion med

PVT1

-targeted LNA. Endelig i sammenligning med siCONT celler, siPVT1 celler udviste et signifikant fald i migration (Fig 3C) og invasion (figur 3D) potentiale. Notatet disse virkninger af

PVT1

knockdown efterlignes i et andet livmoderhalskræft cellelinie, HeLa (S3 Fig), hvilket giver yderligere støtte til en rolle af denne lncRNA i livmoderhalsen carcinogenese.

(A ) Transfektion af SiHa cervical cancerceller med siRNA’er målretning

PVT1

(siPVT1) resulterede i en ca. 70% knockdown i

PVT1

lncRNA ekspression sammenlignet med celler transficeret med en kodet kontrol siRNA (siCONT) . (B) SiHa-celler transficeret med siPVT1 udviste et signifikant fald i proliferation i forhold til siCONT celler. Transficerede SiHa-celler blev også bedømt for ændringer i (C) migration og (D) invasion 6 timer eller 48 timer efter indføring af kemoattraktant (FBS), hhv. siPVT1 celler viste et signifikant fald i både cellemigrering og invasion sammenlignet med siCONT celler. Kvantitative resultater tegnes til venstre, mens repræsentative billeder er til højre. *** P 0,001, **** p 0,0001

PVT1

nedregulering øger apoptose og respons på cisplatin i cervikal kræftceller

Til dato, siRNA-medieret knockdown strategier rettet mod

PVT1

har vist sin rolle i cisplatin følsomhed i malignt pleura mesotheliom [25] og gastriske cancerceller [26]. Men den anti-apoptotiske signatur induceret af

PVT1

i andre cancer celletyper [8,18,20,26] kan indikere, at dens bidrag til cisplatin modstand mere vidtrækkende. Således blev vores næste forsøg designet til at undersøge den rolle,

PVT1

i apoptose og cisplatin følsomhed i livmoderhalskræft celler. Strækker de tidligere nævnte resultater, viser vores resultater, at

PVT1

knockdown i SiHa-celler signifikant forøgede niveauer af cytoplasmatiske histon-associerede DNA-fragmenter (fig 4A) og aktiv caspase-3 (Fig 4B), hvilket antyder, at

PVT1

kan også bidrage til cervikal carcinogenese via hæmning af celledød og apoptose. Endvidere

PVT1

knockdown af enten siRNA (Fig 4C) eller LNA-oligonukleotider (Fig 4D) fører til øget reaktionsevne SiHa celler til cisplatin. Kollektivt, cellen fænotypiske (tab af

PVT1

) funktionel data tyder på, at

PVT1

er nødvendig for spredning, vedligeholdelse og cisplatin modstand livmoderhalskræft celler.

siPVT1 celler udviste en betydelig stigning i celledød (a) og apoptose (B) sammenlignet med siCONT celler. (C) spredning af siPVT1 SiHa celler blev signifikant reduceret som reaktion på flere doser af cisplatin. (D) Dosis-respons kurve for kontrol og

PVT1

LNA-transficerede SiHa celler efter 4 h behandling med cisplatin.