PLoS ONE: genipin-induceret hæmning af Afkobling Protein-2 sensibiliserer resistente Cancer Cells for cytostatika

Abstrakt

Frakobling protein-2 (UCP2) er kendt for at undertrykke mitokondrie reaktive ilt arter (ROS) produktion og er ansat af narkotika-resistente kræftceller til at afbøde oxidativ stress. Brug af lægemiddelrelaterede følsomme HL-60-celler og resistente MX2 sublinie som modelsystemer, viser vi, at genipin, en UCP2 inhibitor, sensibiliserer medikamentresistente celler til cytotoksiske midler. Øget MX2 celledød blev observeret ved samtidig behandling med genipin og forskellige doser af menadion, doxorubicin, og epirubicin. DCFH-DA fluorimetri afslørede, at stigningen i MX2 celledød blev ledsaget af forbedrede cellulære ROS niveauer. Den lægemiddel-inducerede stigning i ROS var knyttet til genipin-medieret inhibering af mitokondrisk proton lækage. State 4 og hvilende cellulære respiratoriske var højere i MX2 celler i sammenligning med de HL-60-celler, og den øgede respiration blev let undertrykt af genipin i MX2 celler. UCP2 udgjorde en bemærkelsesværdig 37% af den hvilende cellulære iltforbrug indikerer at MX2 celler er funktionelt afhængige af dette protein. Større mængder af UCP2 protein blev opdaget i MX2

versus

de HL-60 mitokondrier. De observerede virkninger af genipin var fraværende i HL-60-celler, der peger på selektiviteten af ​​denne naturlige produkt for lægemiddelresistente celler. Specificiteten af ​​genipin for UCP2 blev bekræftet ved hjælp af CHO celler stabilt udtrykker UCP2 hvor genipin inducerede en -22% fald i staten 4 åndedræt. Disse virkninger var fraværende i tomme vektor CHO celler, der udtrykker noget UCP2. Således kemiske inhibering af UCP2 med genipin sensibiliserer multiresistente cancerceller over for cytotoksiske midler

Henvisning:. Mailloux RJ, Adjeitey CN-K, Harper ME (2010) genipin-induceret hæmning af Frakoblingsmoduler protein-2 sensibiliserer drug-Resistant Cancer Cells for cytostatika. PLoS ONE 5 (10): e13289. doi: 10,1371 /journal.pone.0013289

Redaktør: Maria Moran, Hospital 12 Octubre Madrid, Spanien

Modtaget: Maj 27, 2010; Accepteret: 14. september 2010; Udgivet: 13. oktober 2010

Copyright: © 2010 Mailloux et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Funding var tilvejebragt af den canadiske Institutes of Health Research: Institute of Nutrition, Metabolism og Diabetes for Mary-Ellen Harper, og Dr. Ryan Mailloux er modtageren af ​​en postdoc Fellowship fra et hjerte og Stroke Foundation of Canada Program Grant, udstedt af Molecular Function og Imaging gruppe fra University of Ottawa Heart Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Intrinsic eller erhvervet lægemiddelresistens til kemoterapeutiske midler, er en stor hindring overfor vellykket udryddelse af cancere [1]. Evnen hos cancerceller til at unddrage lægemiddeltoksicitet tilskrives induktionen af ​​kunstfærdige afgiftning mekanismer. Faktisk kan kronisk eksponering af cancerceller til kemoterapimidler fremkalde pro-overlevelse responser karakteriseret ved forøget evne til at gøre kemoterapeutika uskadelige [2], [3]. Selv om cancerceller påberåbe talrige strategier til at ophæve toksiner, stram kontrol med ROS-niveauer udgør en stor adaptiv reaktion [4]. Sikring af, at ROS niveauer forbliver i den ikke-toksiske område er en kontinuerlig udfordring for kræftceller Faktisk er kræftceller løbende udsat for høje niveauer af ROS produceret af kompromitteret aerobe stofskifte, kemoterapeutika, næringsstof afsavn, og vært immunreaktioner [5], [ ,,,0],6], [7]. Hvis der ikke gøres noget disse singlet elektron luftfartsselskaber kan skade vigtige cellulære makromolekyler, der fører til celledød [8], [9]. Derfor er en suite af antioxidative forsvarsstrategier påberåbes af kræftceller til at opretholde ROS niveauer inden for acceptable grænser.

induktion af UCP2 repræsenterer en af ​​de mange adaptive mekanismer resistente celler påberåbes for at opretholde ROS homeostase [10], [11]. UCP2 tilhører den mitokondrielle anion carrier superfamilien og har høj homologi til den oprindelige mitokondrielle afkobling protein, der er stærkt selektivt udtrykt i brunt fedt, UCP1 [12]. Forskellige undersøgelser har vist, at UCP2 kan forhindre oxidativ stress ved at øge strømmen af ​​protoner ind i matrixen hvilket gør elektron strømme gennem de respiratoriske komplekser mere effektive [13], [14], [15]. Denne funktion UCP2 kan især være vigtigt i cancerceller, da deres mitokondrier er metabolisk unormal [16].

ROS er en iboende biprodukt af aerob respiration siden mitochondriale respiratoriske komplekser I og III kan tage del i singlet elektron reduktion af diatomiske oxygen [17]. Omkring 0,2-2% af O

2 metaboliseres af mitochondrierne omdannes til ROS [18]. Dog kan ROS generation blive øget væsentligt ved forhold, der overudbud reducerende ækvivalenter til de respiratoriske komplekser og derved øge mitokondrie membran potentiale (

Δψ

m). Faktisk er det blevet rapporteret i flere undersøgelser, der ROS-dannelse ved den respiratoriske kæde er stærkt afhængig

Δψ

m [19], [20]. Selv lille depolarisering af

Δψ

m kan forbedre elektron flow gennem komplekserne og mindske mitokondrie ROS produktion. UCP2 kan opfylde denne afkobling rolle i cancerceller; andre rapporter beskriver ekspressionen af ​​andre afkobling proteiner, herunder UCP3 og UCP5 i adenocarcinom og kolon kræftceller [21], [22]. Faktisk diverse

in vivo

in vitro

undersøgelser har vist, at UCP2 er en

bona fide

afkobler af oxidativ phosphorylering og begrænser oxidativ skade på væv, mens tab af UCP2 funktion øger mitokondrie ROS produktion [13], [23], [24], [25], [26]. Endvidere er frakobling aktivitet af UCP2 dog at give en negativ feedback loop for den akutte kontrol af ROS-dannelse ved mitokondrier [27]. Således kan UCP2 spille en integrerende rolle i den adaptive respons af cancerceller til kemoterapeutika.

Inhiberende lægemiddel-resistensmekanismer repræsenterer en fremgangsmåde til sensibilisering af cancerceller for kemoterapeutika [21], [22]. UCP2 overekspression er blevet beskrevet i forskellige former for kræft, herunder leukæmi celler, humane colon cancerceller, skjoldbruskkirtel tumorer og hepatomer [28], [29], [30], [31]. For ganske nylig UCP2 knock-down har også vist sig at forbedre de toksiske virkninger af det kemoterapeutiske cisplatin [32]. Flere interessante, har UCP2 overekspression blevet foreslået at være en del af det adaptive mekanisme kræves for overlevelsen af ​​cancerceller i ugunstige miljøer [11]. For eksempel overekspression af UCP2 i HCT116 human colon cancerceller mindsker de pro-apoptotiske virkninger af kemoterapeutika, etoposid og doxorubicin [33]. Dette blev også observeret med lægemiddelresistente L1210 /DDP leukæmiceller, der anvender UCP2 at slukke kemoterapi-induceret ROS gennem en proton lækage mekanisme [10]. Således kan UCP2 repræsentere en unik mål for sensibilisering af resistente celler til kemoterapeutika. Formålet med den aktuelle undersøgelse var at teste den hypotese, at genipin, en ekstrakt fra

Gardenia jasminoides

som er blevet vist at inhibere UCP2 og forbedre insulinsekretion, kan inhibere UCP2 i lægemiddelresistent MX2 kræftceller at øge oxidative stress og tilbøjelighed til cytotoksiske midler. Genipin har vist sig at være en meget selektiv inhibitor af UCP2. Faktisk har flere undersøgelser dokumenteret, at genipin specifikt hæmmer UCP2 medieret proton lækage i pancreas P-celler, nyre mitokondrier, og i hjernevæv [34], [35]. Af note også er, at genipin er en traditionel kinesisk middel til behandling af type 2-diabetes mellitus [35].

Resultater og Diskussion

genipin sensibiliserer medikamentresistente leukæmiceller til ROS toksicitet

fremkomsten af ​​lægemiddelresistente kræft fænotyper er ledsaget af købet af en effektiv kontrol over ROS homeostase. UCP2 er en vigtig modulator af ROS produktion i narkotika-resistente kræftceller [10], [11]. Denne mitokondriske indre membran protein udtrykkes i høje niveauer i lægemiddelresistente celler og har vist sig at spille en central rolle i at begrænse oxidativ stress [10], [36]. Således har vi forsøgt at bestemme, om kemisk inhibering af UCP2 kunne gøre lægemiddelresistente celler mere følsomme over for cytotoksiske midler. De medikamentresistente MX2 celler udviste forøget resistens over for superoxid-producerende menaquinon, menadion (figur 1A). Menadion producerer ROS ved hurtigt at cykle mellem quinon og semiquinon tilstand og bruges ofte til at efterligne oxidativt stress [37]. Faktisk HL-60 levedygtighed faldt væsentligt ved behandling med 10 pM menadion. Endvidere eksponering af HL-60-celler til 100 uM menadion resulterede i et fald i cellelevedygtighed 90%. Imidlertid MX2 cellerne beholdt cellelevedygtighed med koncentrationer af menadion op til 100 pM (figur 1A). Immunoblot analyser afslørede, at mitokondrier fra MX2 celler indeholdt større mængder af UCP2 protein (figur 1B). I modsætning til andre undersøgelser, fandt vi, at anti-N19-antistof gav et meget klart kemiluminescerende signal [38]. Den elektroforetiske mobilitet UCP2 blev bekræftet under anvendelse milt lysat. Den anti-C20-antistoffet gav ikke et signal selv med milten lysat (data ikke vist). Immunoblot analyser afslørede kun små stigninger i andre antioxidative forsvar enzymer i MX2-celler (Figur 1B). Så selv om medikamentresistente MX2 celler øger flere antioxidative forsvar enzymer for at øge ROS håndtering, UCP2 viser den største stigning i ekspression i forhold til lægemiddel-sensitive HL-60 modstykke. Specificiteten af ​​genipin for UCP2 blev bekræftet ved hjælp af CHO celler stabilt transficeret med enten UCP2 eller tomme vektor kontrol. Immunoblotting bekræftede, at UCP2 kun udtrykkes i CHO-celler (UCP2 Figur 1C). Det enkelte bånd i hver bane af immunblots også justeret på ~32 KDa angiver specificiteten af ​​antistof til UCP2 protein.

In situ

bioenergetic bestemmelser om CHO celler stabilt transficeret med UCP2 eller tom vektor blev brugt til at teste specificitet genipin. Måling af basal OCR før genipin behandling afslørede, at CHO-UCP2 celler vises en signifikant højere ilt forbrug sats, der var -18% mere ophøjet end CHO-EV-celler (852,523 ± 45,838 OCR /mg protein CHO-UCP3 vs 721,352 ± 15.050 OCR /mg protein CHO-EV, s 0,05, n = 3). Imidlertid genipin behandling (20 og 50 uM) føre til en nedgang 12 og 22% i OCR af CHO-UCP2 celler i sammenligning med de CHO-EV-celler (figur 1C). Derfor er disse data illustrerer klart den specifikke hæmmende virkning af genipin på UCP2. Det er værd at bemærke, at genipin behandling ikke havde nogen effekt på OCR af CHO-EV celler illustrerer specificitet genipin for UCP2.

A) levedygtighed HL-60 (fyldt diamant) og MX2 (fyldt firkant) efter udsættelse for menadion. Celler blev eksponeret i 24 timer for forskellige koncentrationer af menadion (0-100 pmol /L) efterfulgt af en vurdering af antallet af levende celler. Levedygtighed blev udtrykt som en procent af kontrolværdien. Kruskall-Wallis med en post-hoc Mann-Whitney-test, n = 3, p 0,05. * Viser statistisk signifikans for HL-60-celler sammenlignet med kontrol og # indikerer statistisk signifikans for MX2 sammenlignet med kontrol. B) Immunoblotanalyse af anti-oxidant forsvar enzymer og UCP2. Mitokondrier fra MX2 (M) og HL-60 (H) celler blev isoleret og analyseret for UCP2, MnSOD, og ​​GPx4. Cytosol blev anvendt til G6PDH bestemmelser. NADP-ICDH tjente som lastning kontrol for cytosolen og mitokondrie fraktioner. Spleen lysat (100 ug) blev anvendt som en UCP2 loading kontrol. Molekylvægten af ​​UCP2 blev bekræftet ved anvendelse af molekylære massemarkører. C)

In situ

analyse af specificitet genipin for UCP2. Efter bestemmelse af basale forbrug ilt satser, blev virkningen af ​​genipin på OCR i CHO-UCP2 (hvide søjler) celler vurderet. Celler blev udsat for (0-50 uM) genipin i 15 minutter og derefter OCR blev testet. Dataene blev udtrykt som en% af CHO-EV OCR.

INDSA

: immunoblotanalyse af UCP2 i CHO-UCP2 og CHO-EV-celler. SDH tjente som lastning kontrol. Kruskall-Wallis med en post-hoc Mann-Whitney-test, n = 3, p 0,05. * Viser statistisk signifikans i sammenligning med kontrollen. D) Vurdering af genipin toksicitet og svaret af narkotikarelaterede følsomme HL-60 og multiresistent MX2 celler til samtidig behandling med menadion og genipin. Celler blev udsat for genipin (0-500 pmol /l) i nærvær eller fravær af 20 uM menadion i 24 timer. Efter eksponering blev cellelevedygtighed bestemt. ♦ og ▪ en eksponering til enten genipin eller genipin + menadion. Levedygtighed blev udtrykt som en procent af kontrollen. Kruskall-Wallis med en post-hoc Mann-Whitney-test, n = 3, p 0,05. * Svarer til statistisk signifikans, når celler udsat for både menadion og genipin blev sammenlignet med kontrol. # Svarer til statistisk signifikans når genipin-eksponerede celler blev sammenlignet med kontrolceller. E) Behandling med genipin og menadion øger MX2 celledød. MX2 celler blev udsat for 20 pmol /l menadion og genipin (0-500 pmol /l) i 24 timer. Mængden af ​​celledød blev bestemt under anvendelse af PI-assay. 1-vejs ANOVA med en post-hoc Tukey test, n = 5, p 0,05. * Repræsenterer betydning i forhold til 0 uM.

Det fremgår af ovenstående data, at MX2 celler udtrykker høje mængder UCP2 og genipin specifikt hæmmer UCP2. Næste vi evalueret hvis genipin kunne bevidstgøre MX2 celler til menadion toksicitet. Samt dens anvendelse ved behandling af type 2-diabetes, er genipin blevet anvendt til at behandle gliom, hepatomer, og har anti-inflammatoriske egenskaber [35], [39], [40], [41]. Der findes imidlertid en ringe information om genipin toksicitet. Vores resultater viser, at genipin højere koncentrationer end 50 uM resulterede i tab af cellelevedygtighed i både HL-60 og MX2 kulturer (figur 1D). Dette er mest sandsynligt på grund af dets proteintværbindingsforbindelse evner. Genipin tværbindende resulterer i produktionen af ​​et blåt pigment. Der blev imidlertid ikke blåt pigment observeres ved koncentrationer på genipin 100 uM (data ikke vist). Koncentrationer under 50 uM ikke havde nogen væsentlig indvirkning på levedygtigheden af ​​enten MX2 eller HL-60 celler. Endnu vigtigere er, eksponering af MX2 celler til en kombination af 20 uM menadion og genipin (koncentration så lav som 10 uM) resulterede i et kraftigt fald i celle levedygtighed (figur 1D). Der var en stigning i MX2 levedygtighed ved udsættelse for 100 pM genipin i kombination med menadion men der var stadig et signifikant fald i levedygtighed sammenlignet med kontrollen. Den sensibiliserende virkning af genipin til menadion blev bekræftet ved hjælp af PI-analysen. Eksponering af MX2 celler i 24 h til 20 uM menadion i nærvær af 10 eller 20 uM genipin resulterede i en 2-fold og 8 gange stigning i celledød, henholdsvis (figur 1E). I modsætning hertil blev koncentrationer af menadion ≥ 50 uM kræves for at inducere MX2 død når genipin var til stede (figur S1). Derudover stigningen i celledød var adskillige gange højere, når genipin var inkluderet. Propidiumiodid optagelse kan forekomme i både nekrotiske og apoptotiske celler. Således målte vi flere apoptose markører. Ingen aktiv caspase-3 blev detekteret og cytochrom C var til stede fra cytosolen i overensstemmelse med induktion af nekrose (data ikke vist). Selv om disse to apoptose biomarkører ikke blev opdaget, kræves der en mere dybtgående analyse af mekanismen af ​​celledød. Vi vurderede også virkningen af ​​forskellige mængder af genipin på ikke-kræft C2C12 myoblast cellelinje. C2C12 myoblaster vises en stigning i celledød ved behandling med ≥50 pM genipin (fig S1). Disse observationer indikerer, at genipin ikke inducerer et betydeligt tab i cellelevedygtighed ved koncentrationer under 50 uM og virkningerne af genipin på MX2 celler er på grund af dens interaktioner med UCP2. På trods af disse observationer, mere

in vivo

analyser på giftigheden af ​​genipin og dens anvendelighed til behandling af kræft i det kliniske miljø er påkrævet. Således genipin sensibiliserer resistente celler, der udtrykker UCP2 til ROS-producerende stoffer.

genipin sensibiliserer MX2 celler til antracyklin toksicitet

Menadion har vist sig at have en anti-cancer effekt og har været ansat med mitomycin C i fase II undersøgelser til behandling af fremskreden lungecancer [42]. Dog er menadion øjeblikket ikke ansat som kræft kemoterapeutisk. Således har vi fastslået, hvis genipin kunne bevidstgøre de MX2 celler til almindeligt anvendte kemoterapeutika, specifikt quinon-baserede anthracyclins, doxorubicin og epirubicin. MX2 celler er kendt for at være resistente over for denne klasse af kemoterapeutiske midler [43]. Som vist i figur 2A, MX2 celler var mere resistente over for forhøjede epirubicin koncentrationer (0,5 uM) i modsætning til deres lægemiddel-sensitive modpart. Imidlertid blev skarpe forhøjelser celledød observeret i genipin-behandlede MX2 celler udsat for stigende mængder af epirubicin (figur 2A). Mærkeligt, genipin og epirubicin (0,05-0,1 uM) co-behandling forøget celledød i HL-60 celler, men dette svar blev ophævet ved højere doser epirubicin (0,5 uM, MX2 celler vises en 4-dobling mens HL-60 celler vises en stigning på 2 gange). MX2 celler var også resistente over for doxorubicin behandling (figur 2B). Interessant nok HL-60-celler kun udviste en tendens til forøget celledød, men statistisk signifikans blev ikke nået (0,05-0,5 uM doxorubicin, kun en stigning 20-40%; p 0,05). Den største observation i figur 2B er den betydelige stigning i MX2 celledød ved behandling med genipin og doxorubicin (0,05-0,5 uM, ~50-110%; p 0,05). Den sensibiliserende virkning af genipin blev ikke observeret i HL-60 celler behandlet med doxorubicin, der er i overensstemmelse med den hæmmende virkning af genipin på UCP2. Anvendelse af epirubicin og doxorubicin koncentrationer over 1 um i kombination med genipin resulterede i markante stigninger i celledød af HL-60 og MX2 celler (data ikke vist). Derfor genipin afvæbner kemoterapeutisk modstand i lægemiddelresistente celler, der overudtrykker UCP2.

HL-60 og MX2-celler blev dyrket til 70% konfluens og derefter udsat for enten epirubicin (0-0,5 uM) eller doxorubicin (0-0,5 uM) i fravær eller tilstedeværelse af 20 uM genipin. Mængden af ​​celledød blev bestemt ved PI-assay. Resultaterne blev udtrykt som en procent af kontrollen. A) ♦ epirubicin kun ▪ epirubicin + genipin. 1-vejs ANOVA med en post-hoc Tukey test, n = 5, * p 0,05. * Svarer til statistisk signifikans når epirubicin og genipin behandlede celler blev sammenlignet med kontrol. # Svarer til statistisk signifikans når epirubicin-behandlede celler blev sammenlignet med kontrolceller. B) ♦ doxorubicin alene, ▪ doxorubicin + genipin. 1-vejs ANOVA med en post-hoc Tukey test, n = 5, p 0,05. * Svarer til statistisk signifikans når epirubicin og genipin behandlede celler blev sammenlignet med kontrolceller.

genipin behandling forstyrrer aerob respiration i lægemiddelresistente celler

Trods den glycolytiske fænotype af cancerceller, den enzymatiske maskineri kræves til aerob respiration ofte forbliver intakt [44]. Vedligeholdelse af funktionelle mitokondrier er afgørende for cancercelle,

f.eks.

, Krebs cyklus enzymer giver anabolske forstadier til hurtigt delende celler [6]. Vores gruppe har tidligere vist, at mitochondrier i lægemiddelresistente leukæmiceller er koblet, og at dette er forbundet med nedsat cellulære ROS-niveauer [10]. Vi hypotese således, at den sensibiliserende effekt af genipin var på grund af sin evne til at forhindre UCP2-medieret afkobling af

Δψ

m. Som vist i figur 3A, basalraten for iltforbrug var højere i MX2 sammenlignet med HL-60-celler (~54% større, p 0,05). Dette indikerer, at mitokondrierne i MX2 celler er mere metabolisk aktive end HL-60 mitochondrier. Behandling af HL-60 og MX2 celler med oligomycin faldt respiration ved -60% og ~38% (figur 3A). Dette indikerer, at ~62% af hvilende cellulære O

2 forbrug i MX2 celler skyldes koblet respiration (

f.eks.

Ikke-ATP producerende aktiviteter). Skarpe afvigelser i mitokondrie stofskifte ofte ledsager købet af aggressive kræft fænotyper [6]. Faktisk har målrettet afbrydelse af mitochondrial metabolisme blevet beskrevet som en potentiel kræftbehandling [2]. Forbehandling med genipin betydeligt formindsket basal respiration i MX2-celler (figur 3A). Disse effekter blev ikke set i HL-60 celler. Genipin inducerede et fald ~37% i respirationsfrekvens afslører, at UCP2 er kvantitativt vigtige for opretholdelsen af ​​en ukoblet mitokondrie fænotype selv under standard inkubationsbetingelser. Til sammenligning oplevede CHO-UCP2 celler et fald -22% i OCR efter behandling med 50 pM genipin (figur 1C). Forskellen mellem CHO og MX2 celler er mest sandsynligt på grund af forskelle i dosis og eksponeringstiden mellem de to separate cellelinjer. Denne observation tyder generelt at UCP2 er en stor bidragyder til MX2 cellulære bioenergetik. Endvidere efter tilsætning af genipin at oligomycin-behandlede MX2 celler, respirationsraten var identisk med den for HL-60-celler (figur 3A). Dette indikerer, at UCP2 var fuldt ansvarlig for den øgede respiration af MX2 celler. Adskillige undersøgelser har vist, at genipin specifikt inhiberer UCP2-medieret afkobling [34], [45]. For eksempel, Zhang

et al

illustrerede, at proton lækage påvirkes ikke af genipin i UCP2

– /- celler og i væv, der ikke udtrykker UCP2 [35]. Vi observerede lignende tendenser i CHO celler udsat for genipin (figur 1C). Derfor genipin fuldstændigt inhiberer forøget cellulær respiration i MX2 celler, mens det ikke har nogen effekt på HL-60 moderceller.

A) iltforbrug målinger i celler udsat for 20 uM genipin 24 timers udsættelse. målinger iltforbrug blev udført efter en 30 minutters inkubation i reaktionsmediet i fravær (hvide søjler) eller nærvær (grå søjler) af oligomycin. 1-vejs ANOVA med en post-hoc Tukey test, n = 6, ** p 0,01. Behandlet MX2 eller HL-60 celler blev kun sammenlignet med deres tilsvarende kontrol betyder værdier. B) iltforbrug målinger i celler udsat for genipin (20 uM) og /eller menadion (20 uM) i 24 timer. 1-vejs ANOVA med en post-hoc Tukey test, n = 4, * p 0,05,

UCP2 er kendt for at være en negativ regulator af mitokondrie ROS produktion, en ejendom tilskrives dens milde afkobling aktivitet. I to elegante undersøgelser, Echtay

et al

forudsat overbevisende dokumentation for, at UCP2-medieret proton ledningsevne maksimalt aktiveres ved oxidativt stress i mitokondrierne [27], [46]. Denne type “inducerbar” proton lækage er blevet beskrevet som en vigtig sikkerhedsforanstaltning i at forebygge stigninger i mitokondrie ROS emission. Således testede vi hvis ROS behandling kunne øge proton lækage i MX2 celler. Menadion behandling ændrede ikke iltforbrug i MX2 celler (figur 3B). Disse data indikerer, at ROS ikke forårsagede yderligere stigninger i proton lækage afhængige respiration. Men i de HL-60-celler, menadion behandling signifikant formindsket iltforbrug, måske som følge af formindsket evne af disse celler til at styre cellulære ROS-niveauer (figur 3B). Mitokondrie metabolisme (

f.eks.

, Citronsyre cyklus enzymer og elektron transport kæden proteiner) er et vigtigt mål for ROS toksicitet. Således faldet i iltforbruget observeret i HL-60-celler udsat for menadion indikerer disse celler har en lavere kapacitet til at holde tolerable niveauer af cellulær ROS i nærvær af cytotoksiske midler. Ovenstående data fastslå, at UCP2 forhindrer ROS-inducerede nedskrivninger i mitokondrie stofskifte. Med andre ord kan den lave overflod af UCP2 i HL-60-celler, at de er i stand til at afgifte ROS. I MX2 celler, vores resultater støtter den konklusion, at UCP2 allerede maksimalt aktiveret. Faktisk, i to separate forsøg (figur 3A og 3B) genipin formindsket iltoptagelse ~37% i celler under standard inkubationsbetingelser. Desuden nonphosphorylating respiration udgjorde ~62% af O

2 forbrug i MX2 celler og genipin hæmmet over halvdelen af ​​denne respiration, hvilket resulterer i en normalisering af ikke-phosphorylerende respiration (

dvs

, til HL -60 værdier). Derfor UCP2 udgør en stor del af den nonphosphorylating respiration i MX2 celler. Således er den unikke metaboliske profil af de lægemiddelresistente kræftceller synes at omfatte forbedret UCP2-medieret mitokondriel afkobling at undgå de cytotoksiske virkninger af lægemiddel- og mitokondrie-bårne ROS.

Behandling med genipin forbedrer lægemiddelinduceret ROS produktion

ovenstående data viser, at inhibering af UCP2 ved genipin medfører induktion af lægemiddel-induceret celledød i multilægemiddelresistente MX2 celler. Da UCP2 hæmning sensibiliserer celler til ROS-producerende agenter, vi derefter testet hvis genipin behandling forbedret lægemiddel-induceret ROS-dannelse. HL-60-celler behandlet med menadion alene gav langt flere ROS end deres resistente modstykke (figur 4A). Denne observation er i overensstemmelse med den forbedrede ROS håndtering kapacitet af lægemiddelresistente celler. Imidlertid co-behandling af MX2 celler med genipin og menadion forøget ROS-niveauer. Faktisk eksponering af genipin behandlet MX2 celler til forskellige mængder af menadion resulterede i øgede ROS-niveauer (figur 4B). Ved 50 uM menadion, var der en kraftig stigning i ROS-niveauer i genipin-eksponerede MX2 celler. Kun moderate stigninger i ROS produktion blev observeret i HL-60 celler behandlet med menadion og genipin (figur 4B). Behandling med genipin alene i MX2 celler forøgede ikke ROS-niveauer (figur 4B). Således genipin gør MX2 cellerne mere følsomme over for behandling med ROS producerer agenter ved at interferere med proton lækage.

ROS niveauer blev vurderet i intakte HL-60 og MX2 celler ved hjælp DCFH-DA. A) ROS-niveauer i celler udsat for udelukkende menadion (0-50 uM) i 24 timer. 1-vejs ANOVA med en post-hoc Tukey test, n = 5, * p 0,05. B) ROS-niveauer i celler udsat for 0 eller 20 uM genipin og menadion (0-50 uM) i 24 timer. 1-vejs ANOVA med en post-hoc Tukey test, n = 5, * p 0,05, ** p. 0,01

Lignende observationer blev foretaget med doxorubicin. Doxorubicin er klassisk betegnes som en topoisomerase II inhibitor [47]. Imidlertid er der blevet foreslået andre mekanismer på toksicitet, såsom ROS produktion, [48]. Behandling med doxorubicin alene resulterede i en dosisafhængig stigning i ROS-niveauer i HL-60-celler (figur 5A). I modsætning hertil blev der ikke stigninger i ROS observeret i MX2 cellerne selv ved 1 uM. Men når genipin var inkluderet i doxorubicin blev stigninger i ROS-niveauer observeret, i MX2 celler (figur 5B). Faktisk eksponering af genipin-loaded celler til koncentrationer af doxorubicin så lav som 0,1 uM resulterede i en kraftig stigning i ROS-niveauer. Selvom doxorubicin er almindeligt anvendt som et middel mod cancer, er dets virkningsmekanisme ikke fuldt forstået. I denne undersøgelse viser vi, at doxorubicin kan forøge ROS-niveauer i MX2 celler efter samtidig behandling med genipin. Det er meget muligt, at doxorubicin toksicitet målretter mitokondrierne. De anthracyclins er quinon-molekyler, såsom menadion, som er i stand til at katalysere singlet elektron reduktion af diatomiske oxygen til superoxid. Superoxide, ved høje nok koncentrationer, forstyrrer den korrekte funktion af mitokondrier. Men i denne undersøgelse produktionen af ​​ROS ved doxorubicin og menadion i MX2 celler krævede genipin behandling. Det er fuldt ud muligt, at de lægemiddel-resistente celler klare de inhibitoriske virkninger af doxorubicin og quinoner ved at opretholde mitokondrier i en ukoblet tilstand begrænser ROS-dannelse.

ROS-niveauer blev vurderet i intakte HL-60 og MX2 celler under anvendelse DCFH -DA. A) ROS-niveauer i HL-60-celler og MX2 celler eksponeret for doxorubicin (0-1 uM) i 24 timer. 1-vejs ANOVA med en post-hoc Tukey test, n = 5, * p 0,05, ** p 0,01. B) ROS-niveauer i HL-60-celler og MX2 cellerne eksponeret for 20 uM genipin og doxorubicin (0-1 uM) i 24 timer. 1-vejs ANOVA med en post-hoc Tukey test, n = 5, * p 0,05, ** p. 0,01

Vores resultater viser, at det naturlige produkt genipin kan gengive multiresistent kræft celler mere følsomme over for ROS-producerende midler. Den kliniske anvendelse af genipin som en potentiel lægemiddel-sensibiliserende middel kræver yderligere undersøgelser. Faktisk blev de lægemiddelrelaterede sensibiliserende virkninger af genipin undersøgt heri med almindeligt studerede linjer af kræftceller. Derfor, for at skabe større klarhed om den potentielle rolle genipin i kræftbehandlingen, omfattende

in vivo

analyser er nu påkrævet (

f.eks.

, Dyreforsøg). Men denne undersøgelse giver nogle vigtige indledende indblik i den potentielle anvendelse af genipin i kræftbehandling. I denne undersøgelse blev den sensibiliserende effekt af genipin tilskrevet dens interaktion med UCP2, et protein rigeligt udtrykt i MX2 celle mitokondrier. Specificiteten af ​​genipin for UCP2 blev bekræftet med CHO celler stabilt udtrykker UCP2. HL-60-celler var ikke reagerer på genipin behandling, som er mest sandsynligt tilskrives de lave mængder UCP2 udtrykt i disse celler. Den specifikke hæmmende virkning af genipin blev bekræftet under anvendelse af CHO-celler, enten udtrykker eller ikke udtrykker UCP2. Således er vores resultater er i overensstemmelse med en specifik virkning af genipin på UCP2. UCP2 udtrykkes i en række normale somatiske celler (splenocytter, pankreatiske p-celler, thymusceller og forskellige andre immun-type celler) [26]. Det beløb udtrykt i narkotika-resistente kræftceller langt overstiger protein niveauer i ikke-kræftceller og narkotikarelaterede følsomme cancerceller. Lav UCP2 proteinniveauer vedligeholdes af stram translationel kontrol og hurtig nedbrydning [49]. Mærkeligt, er glutamin blevet impliceret i induktion af UCP2 mRNA-translation [50] og lægemiddelresistente kræftceller har forbedret glutamin optagelse og metabolisme, en proces medieret af Myc [51]. Således er det muligt at glutamin afhængighed spiller en rolle i styrkelsen UCP2 proteinekspression i lægemiddelresistente celler. Det ville være interessant at bestemme, om UCP2 kan induceres ved Myc. I denne undersøgelse, mekanismen for UCP2-medierede reduktion i ROS stammer fra dens afkobling aktivitet.