PLoS ONE: DLK1 Fremmer Lung Cancer Cell Invasion gennem opregulering af MMP9 Expression Afhængigt Notch Signaling

Abstrakt

transmembrane og udskilles protein delta-lignende en homolog (

DLK1

) tilhører EGF-lignende familie. Det er almindeligt accepteret, at

DLK1

spiller vigtige roller i reguleringen celledifferentiering, såsom adipogenese og osteogenese. Afvigende udtryk for

DLK1

er fundet i forskellige typer af humane kræftformer, herunder lungekræft. En tidligere undersøgelse i dette laboratorium har vist, at

er DLK1

forbundet med tumor invasion, selvom mekanisme er stadig ukendt. At udforske de potentielle virkninger, som

DLK1

kan have på invasion,

DLK1

blev overudtrykt eller slået ned i den menneskelige lunge cancer cellelinjer. Proteinets påvirkninger af celleinvasion blev efterfølgende evalueret. En transwell assay viste, at

DLK1

overekspression væsentligt fremmet kræftcelle invasion. Western blotting og gelatinezymografi analyse viste, at

DLK1

kunne påvirke både matrixmetalloproteinase-9 (

MMP9

) udtryk og dets ekstracellulære aktivitet. En analyse af

NOTCH1

HES1

genekspression og Notch intracellulære domæne (NiCd) nuklear translokation under

DLK1

stimulation eller udtømning viste, at

DLK1

kunne aktivere Notch signalering i lunge kræftceller. Derudover forhøjede udtryk for

MMP9

induceret af

DLK1

stimulation kunne faldt betydeligt ved at hæmme Notch signalering hjælp γ-sekretase hæmmer (GSI). De data, der præsenteres i denne undersøgelse tyder på, at

DLK1

kan fremme invasion af lungekræft celler ved opregulering

MMP9

udtryk, som afhænger af Notch signalering

Henvisning:. Li L , Tan, J., Zhang Y, Han N, Di X, Xiao T, et al. (2014)

DLK1

Fremmer Lung Cancer Cell Invasion gennem opregulering af

MMP9

Expression Afhængig Notch signalering. PLoS ONE 9 (3): e91509. doi: 10,1371 /journal.pone.0091509

Redaktør: Yunli Zhou, Harvard Medical School, USA

Modtaget: November 15, 2013; Accepteret: 11 Februar 2014; Udgivet: 12 marts 2014

Copyright: © 2014 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Natural Science Foundation of China (30930042 og 81301852) og Specialized forskningsfonden for ph.d.-programmet for videregående uddannelse (20111106110017). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft død verden over, og tumormetastase er stærkt forbundet med prognosen for kræftpatienter [1], [2]. Vores tidligere undersøgelser af differentielt udtrykte gener i human lunge pladecellecarcinom (SCC) med eller uden lymfeknudemetastaser anvendelse af DNA microarray analyse fundet et sæt af metastase-associerede gener (FDR 0,05, data ikke vist). Blandt de gener,

DLK1

viste mere end to gange højere udtryk i primære tumorer med lymfeknude metastaser, tyder på, at

DLK1

kan spille roller i kræft metastaser. Men både forholdet mellem

DLK1

tumormetastaser og dens mekanisme er dårligt karakteriseret.

delta-lignende en homolog (

DLK1

) gen, med aliaser

FA1

,

ZOG

PREF-1

, koder en transmembrane og udskilt protein (DLK1), der indeholder seks epidermal vækstfaktor (EGF) domæner, der er medlem af EGF -lignende familie. Dette protein er særdeles homologt med Notch-ligand DLL1 men mangler Delta /Serrate /Lag (DSL) motiv, der er kritisk for interaktion med Notch-receptorer [3], [4]. Undersøgelser af

DLK1

har afsløret sin rolle i celledifferentiering. For eksempel,

DLK1

kan fungere i modulerende adipogenese [5], [6], [7], regulering osteoblast differentiering [8], [9] og hæmme differentiering og proliferation af hæmatopoietiske celler [10]. Den ikke-klassiske ligand

DLK1

viste sig at være udtrykkes afvigende i flere humane cancere, herunder neuroblastom [11], hepatocellulært carcinom [12], [13], gliomer [14] og human prostatacancer [15]. Vores tidligere arbejde fandt også, at

DLK1

er stærkt udtrykt i human ikke-småcellet lungekræft og fungerer som et onkogen [16]. Opreguleres udtryk for

DLK1

i ikke-småcellet lungekræft er associeret med lymfeknude metastaser, men mekanismen er stadig ukendt.

Notch vej er en velkendt signaltransduktionsvej under udviklingsprocessen og celleskæbne bestemmelse. Skønt mangler DSL motiv,

DLK1

har vist sig at virke som en inhibitor af Notch signalering in vitro [17], [18]. Både membranbundet og udskilt DLK1 kan interagere med NOTCH1 [17], hvilket fører til ændrede cellulære fordeling af NOTCH1 og inhibering af Notch-reguleret genekspression [4], [5], [19]. Det er blevet rapporteret, at

NOTCH1

kan regulere ekspressionen af ​​matrixmetalloproteinase-9 (

MMP9

) i prostatacancerceller, som spiller en central rolle i cancer invasion [20]. Tager disse resultater sammen, vi hypotesen, at Notch signalering kan være involveret i

DLK1

induceret kræft celle invasion.

Undersøgelsen, som vi præsenterer her giver bevis for, at

DLK1

forbedret evne lungecancerceller at invadere den ekstracellulære matrix (ECM), som validerede vores tidligere genekspression profilering resultater afledt af microarray analyse. Desuden viste vores data, at

DLK1

forfremmet cancercelleinvasion gennem opregulering af

MMP9

udtryk og forbedring af dets ekstracellulære aktivitet, der er afhængige af Notch signalvejen.

materialer og metoder

cellekulturer og behandling

den humane lungecancer-cellelinie H520, H1299 og A549 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Cellerne blev dyrket i RPMI 1640 medium (Life Technologies, Grand Island, NY) med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 ug /ml penicillin-streptomycin i en befugtet inkubator med 5% CO

2 ved 37 ° C . Notch-inhibitoren L-685,458 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) blev tilsat til dyrkningsmediet 12 timer efter transient transfektion med det

DLK1

ekspressionsplasmid eller nul-vektoren (pcDNA3.1), med en endelig effektiv koncentration af 5 uM i RPMI 1640 medium, der indeholder 1% FBS.

DLK1

ekspressionsplasmid og små interfererende RNA (siRNA)

DLK1

eukaryot ekspressionsplasmid blev konstrueret og derefter stabilt transficeret ind i H520 celler, som tidligere beskrevet [16].

DLK1

ekspressionsplasmid blev også transient transficeret ind H520 og H1299-celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 transfektionsreagens (Invitrogen, Carlsbad, CA); og en Invitrogen Stealth siRNA duplex (Carlsbad, CA) mod

DLK1

blev udnyttet til gendæmpning hjælp Lipofectamine RNAiMAX reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), efter producentens anvisninger.

In vitro ECM invasion assay

Celler enten stabilt (H520) eller forbigående (H1299) transficeret med

DLK1

eller nul vektor blev dyrket særskilt indtil 80% sammenløb. Cellerne blev derefter vasket tre gange med phosphatbufret saltvand (PBS) og dyrkes i serumfrie medier natten over, før de underkastes en ECM invasion assay in vitro. Den chemoinvasion assay blev udført under anvendelse af BIOCOAT Matrigel Invasion Chambers med 8 um porer (BD Biosciences, Bedford, MA) ifølge producentens anvisninger. Kort beskrevet 2,5 × 10

4 celler blev resuspenderet i friske serumfri medier og podet ind i det øvre kammer i en 24-brønds plade transwell, mens det nedre kammer indeholdt frisk dyrkningsmedium med 20% FBS som en kemoattraktant. Cellerne fik lov til at invadere i 22 timer (37 ° C, 5% CO

2 atmosfære), og kamrene blev derefter vasket med PBS. De celler, som ikke invaderer gennem membranen blev fjernet. De invaderende celler på den nedre overflade af membranen blev fikseret med kold methanol, farvet med 0,2% krystalviolet og undersøges. Cellerne på hver membran blev talt i ikke mindre end fem felter under et lysmikroskop.

RNA ekstraktion og kvantitativ revers transkription-PCR

Total RNA blev isoleret fra cellerne med TRIzol reagens (Invitrogen , Carlsbad, CA) og 1 pg totalt RNA blev anvendt til revers transkription med en SuperScript II revers transkription (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. Real-time PCR-analyse af

MMP9

HES1

ekspression blev udført med følgende primere: MMP9-F 5′-TTTGACAGCGACAAGAAGTG-3 ‘, MMP9-R 5′-CAGGGCGAGGACCATAGAGG-3′ , HES1-F 5’-TAGCTCGCGGCATTCCAAG-3 ‘og HES1-R 5′-AAGCGGGTCACCTCGTTCA-3’. Husholdning gen

18S

ribosomale RNA blev plukket som en intern kontrol i denne undersøgelse, med primerne som 18S-F 5′-GAAACGGCTACCACATCC-3 ‘og 18S-R 5′-ACCAGACT2TGCCCTCCA-3’. En SYBR Premix Ex Taq kit (Takara, Shiga, Japan) blev anvendt til realtids-PCR-analyse med en standard amplifikationsprotokol: 95 ° C i 10 s, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 30 s og en afsluttende ekstension ved 72 ° C i 3 minutter. Efter forstærkning blev en procedure standard smeltende kurve udført for hvert gen at undersøge specificitet forstærkning.

Western blotting analyse

Samlet protein blev ekstraheret fra ca. 2 × 10

6 dyrket celler med RIPA-buffer, og nuklear protein blev ekstraheret under anvendelse NE-PER nukleare og cytoplasmiske ekstraktionsmidler reagenser (Pierce, Rockford, IL) ifølge producentens medfølgende protokol. I alt blev 40-80 ug af proteinerne separeret ved elektroforese og derefter overført til en PVDF-membran, som beskrevet tidligere [21]. Membranen blev blokeret med 5% fedtfrit mælk og inkuberes med et primært antistof mod DLK1 (Proteintech Group, Chicago, IL), NOTCH1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), kløvet NOTCH1 (Val1744, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) eller MMP9 (Aviva Systembiologi, San Diego, CA). Den anti-Notch intracellulære domæne (NiCd) antistof anvendt i denne undersøgelse kan kun genkende spaltes og aktiveres NOTCH1 men ikke fuld længde NOTCH1. Efter vask med PBS indeholdende 0,1% Tween-20 (PBST) blev membranen inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (Dako, Glostrup, Danmark), og overflod af proteiner blev påvist med kemiluminescens reagenser. Membranen blev testet igen med et antistof mod GAPDH (KangChen Bio-Tech, Shanghai, Kina) eller TBP (Abcam, Cambridge, MA) som interne kontroller for tilsvarende protein lastning.

gelatinezymografi

stabilt

dLK1

udtrykkende H520-dlk1 celler, sammen med null-kontrol H520-pcdb og forældreorlov H520 celler, blev dyrket separat i 10 cm skåle indtil 80% sammenløb. De konditionerede medier blev opsamlet og opkoncentreret ved anvendelse af en Amicon-filter (Millipore, Bedford, MA) ifølge fabrikantens protokol. I alt blev 20 ug af koncentrerede proteiner elektroforeret under reducerende betingelser, og den gelatinolytiske aktivitet af MMP9 blev derefter analyseret under anvendelse af zymografi reagenser (Bio-Rad, Hercules, CA) ifølge producentens instruktioner.

Statistisk analyse

forskelle mellem tællinger af invaderende celler i hver gruppe i invasionen assay og forskelle i relative ekspression i real-time PCR-analyse blev evalueret under anvendelse af en t-test. Alle tests var to-sidet, og en p-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle statistiske tests blev udført med SPSS softwarepakken, udgave 13.0 (SPSS, Chicago, IL).

Resultater

Overekspression af

DLK1

forbedret ECM invasion af lungekræft celler

for at løse, om

DLK1

har potentielle roller i lungekræft metastase, lunge cancercell linjer H520 og H1299 blev ansat som in vitro model, hvor endogen udtryk for

DLK1

WAS mangler. H520-celler med stabil ekspression af exogen

DLK1

(H520-dlk1) blev genereret tidligere, sammen med H520-pcdb celler, stabilt transfekteret med vektoren (pcDNA3.1) som nul-kontrollens [16]. H520-dlk1 celler blev udsat for invasionen assay, med H520-pcdb og forældrenes H520 celler som kontroller. Som vist i figur 1 panel A og B, efter en 22-timers periode under invasion var der signifikant flere H520-dlk1 celler invaderet gennem kammeret membran coatet med Matrigel, sammenlignet med H520 og H520-pcdb celler (p-værdi 0,05). Et lignende fænomen blev observeret i H1299-celler. Mere

DLK1

forbigående transficeret H1299 celler (H1299-dlk1) blev fundet invaderet gennem membranen sammenlignet med H1299-celler transficeret med nul vektor (H1299-pcdb), som vist i figur 1C og D. Disse resultater tyder på, at overekspressionen af ​​

DLK1

kunne bemærkelsesværdigt forbedre cellers evne til at invadere ECM.

A, repræsentative mikrofotografier af de invaderende celler, som migrerede gennem Matrigelcoatede membran transwell, taget fra tre grupper: H520, stamcellerne, H520-pcdb, de null vektor-kontrol celler og H520-dlk1, cellerne stabilt udtrykker DLK1. B, et histogram for tællinger af migrerende celler fra H520, H520-pcdb og H520-dlk1 grupper. C, repræsentative mikrofotografier viser H1299 celler, som forbigående blev transficeret med

DLK1

(H1299-dlk1) eller nul vektor (H1299-pcdb), der invaderede gennem Matrigel-coatede membran Transwell. D, et histogram for tællinger af migrerende celler fra H1299-dlk1 og H1299-pcdb grupper. Forsøgene blev udført i tre eksemplarer (* t-test, p-værdi 0,05).

Overekspression af

DLK1

opreguleres MMP9 udtryk og aktivitet

Baseret på den hypotese, at

DLK1

induceret kræft celle invasion blev medieret af opregulering af

MMP9

, udtryk for

MMP9

på

DLK1

stimulering blev analyseret af både real-time PCR og Western blotting. Resultaterne viste, at

MMP9

ekspression blev forøget i H520-dlk1 celler sammenlignet med H520 og H520-pcdb celler på både mRNA og protein niveauer (figur 2A og B). blev også observeret en samme tendens, når

DLK1

blev overudtrykt i en anden lungekræft cellelinje H1299. Efter kortvarigt transficeret med

DLK1

, stærkt udtrykt

MMP9

blev påvist i både mRNA og protein niveauer (Figur 2D og E). Som MMP9 protein opfylder sin funktion i en aktiveret form i det ekstracellulære rum, var betingede medier indsamlet, og gelatinezymografi blev ansat til at teste MMP9 aktivitet. I figur 2C er det vist, at

DLK1

kunne også øge MMP9-aktivitet i det ekstracellulære rum, hvorimod aktiviteten af ​​MMP2 var uændret. For yderligere at bekræfte forholdet mellem

DLK1

MMP9

blev RNA-interferens ansat til at udtømme

DLK1

udtryk i A549 celler, og

MMP9

udtryk var undersøges sekventielt. Resultaterne viste, at DLK1 ekspression faktisk blev undertrykt af RNAi på proteinniveauet (figur 2G), og MMP9-ekspression blev inhiberet signifikant ved både mRNA og protein niveauer (figur 2F og G). Disse resultater antydede, at

DLK1

kan fremme celle invasion gennem regulering MMP9 udtryk og aktivitet.

A, et histogram for den relative mRNA ekspressionen af ​​

MMP9

i H520-celler transficeret med

dLK1 Hotel (H520-dlk1) eller nul vektor (H520-pcdb) påvises ved real-time PCR-analyse. Ekspressionsniveauet af

MMP9

de tomme H520 celler blev anvendt som kontrol og sættes til 1. B, proteinet ekspression af MMP9 i H520-dlk1, H520-pcdb og H520 celler evalueret ved Western blotting-analyse. C, gelatinezymografi viser aktiviteten af ​​udskilt MMP9 og MMP2 i H520-dlk1, H520-pcdb og H520 celler. D, real-time PCR-analyse af den relative mRNA ekspressionen af ​​

MMP9

i H1299 celler transficeret med

DLK1 Hotel (H1299-dlk1) eller nul vektor (H1299-pcdb) vist i et histogram. E, Western blotting viser protein ekspression af MMP9 i H1299-dlk1 og H1299-pcdb celler. F, et histogram viser den relative mRNA ekspressionen af ​​

MMP9

i

DLK1

siRNA (A549-si-dlk1) eller nul kontrol siRNA (A549-NC) transfekterede A549 celler vurderet af real-time PCR-analyse. G proteinet ekspression af MMP9 i A549-si-dlk1, A549-NC og datoer A549-celler påvises ved Western blotting. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt.

18S

ribosomale RNA blev anvendt som en intern kontrol i real-time PCR-analyse, hvorimod GAPDH blev anvendt som en intern kontrol i den vestlige blotting analyse (* t-test, p-værdi 0,05).

Overekspression af

DLK1

aktiveret Notch signalvej

for at bekræfte sammenhængen mellem

DLK1

NOTCH1

, vi først afprøvet NOTCH1 ekspression i helcellelysater ved Western blotting. Det blev konstateret, at overekspression af

DLK1

kunne opregulere NOTCH1 ekspression i både H520 og H1299-celler (figur 3A og D). Fordi NOTCH1 aktivering efterfølges af sin spaltning i NiCd og translokation af NiCd ind i kernen for yderligere transkriptionel regulering, kunne mængden af ​​NICD i kerner afspejle Notch pathway aktivitet. Vi udvundet nukleare proteiner fra H520 celler forbigående transficeret med

DLK1

eller nul-vektoren og undersøgte mængden af ​​NICD ved hjælp Western blotting. Resultaterne viste, at NiCd translokeres i kerner mere intenst efter overekspression af

DLK1

sammenlignet med nul-kontrollens (figur 3B). Desuden udtryk for

HES1

, et eksplicit Notch pathway målgen, blev også undersøgt af real-time PCR i H520 og H1299 celler. Der var en signifikant opregulering af

HES1

efter stimulering af

DLK1

udtryk i forhold til nul-kontrol i begge celler (p-værdi 0,05, figur 3C og E). I modsætning hertil faldt ekspression af NOTCH1 og HES1 blev påvist ved Western blotting og real-time PCR, når det blev DLK1 ekspression blev udtømt ved RNAi i A549-celler (Figur 3F og G).

A, Western blotting viser NOTCH1 udtryk i H520 celler efter transfektion med

dLK1 Hotel (H520-dlk1) eller nul vektor (H520-pcdb) undersøgt i helcellelysater. GAPDH blev anvendt som en intern kontrol. B, Western blotting evaluere nuklear NICD udtryk i H520-dlk1 andH520-pcdb celler. TBP blev anvendt som en intern kontrol. C, et histogram for den relative mRNA ekspressionen af ​​Notch målgen

HES1

i H520-dlk1 og H520-pcdb celler påvises ved real-time PCR-analyse. H520-pcdb celler blev anvendt som en kontrol, og dens udtryk niveau af

HES1

blev sat til 1.

18S

ribosomale RNA blev anvendt som en intern kontrol. D, Western blotting viser ekspressionen af ​​NOTCH1 i H1299 celler transficeret med

DLK1 Hotel (H1299-dlk1) eller nul vektor (H1299-pcdb). GAPDH blev anvendt som en intern kontrol. E, et histogram præsentere den relative mRNA ekspressionen af ​​

HES1

i H1299-dlk1 og H1299-pcdb celler påvises ved real-time PCR-analyse. F, ekspressionen af ​​NOTCH1 i cytoplasmaet blev vurderet ved Western blotting i A549-celler transient transficeret med

DLK1

siRNA (A549-si-dlk1) eller nul-kontrollens siRNA (A549-NC). GAPDH blev anvendt som en intern kontrol. G, real-time PCR-analyse af den relative mRNA ekspressionen af ​​

HES1

i A549-si-dlk1 og A549-NC celler, og præsenteret i et histogram. Forsøgene blev udført i tre eksemplarer (* t-test, p-værdi 0,05).

DLK1

reguleret

MMP9

udtryk delvist gennem Notch signalvej

For at afgøre, om

DLK1

opreguleret

MMP9

udtryk i en Notch signalering-afhængig måde, L-685,458 blev anvendt, hvilket er en γ-sekretase hæmmer (GSI), som undertrykker NOTCH1 intercellulære domæne spaltning med γ-sekretase, således inhiberer Notch signaleringsaktivitet. Den relative ekspression af

MMP9

under stimulering af

DLK

1-ekspression med eller uden GSI-behandling blev analyseret ved real-time PCR. Resultaterne viste, at når Notch signalering blev blokeret ved behandling med L-685,458,

DLK1

stimuleret

MMP9

opregulering var signifikant reduceret (figur 4A), hvilket indikerer inddragelse af Notch signalering i denne forordning behandle. Endvidere blev det også bemærket, at selv om Notch signalering aktivitet blev undertrykt til et niveau, der svarer med en mangel på

DLK1

overekspression (angivet med

HES1

udtryk i figur 4B, dlk1 + /GSI + sammenlignet med dlk1 – /GSI +, t-test p-værdi = 0,078), udtryk for

MMP9

fulgte ikke samme tendens, hvilket tyder på, at

DLK1

kan også regulere

MMP9

udtryk gennem signalering transduktion veje end Notch. Ekspressionen af ​​

HES1

, som er et målgen af ​​Notch-signalvejen, blev evalueret parallelt som en indikator for Notch signalering aktivitet (figur 4B).

A, et søjlediagram over mRNA ekspressionen af ​​

MMP9

opdaget af real-time PCR i H520 celler med eller uden

DLK1

overekspression og med eller uden GSI behandling. Gruppen med hverken

DLK1

stimulation eller GSI behandling (dlk- /GSI-) blev anvendt som en kontrol, og ekspressionsniveauet af

MMP9

blev sat til 1.

18S

ribosomale RNA blev anvendt som en intern kontrol. B, udtryk for

HES1

evalueret ved realtids-PCR parallelt med

MMP9

udtryk er vist i et søjlediagram, der angiver Notch signalering aktiviteter på

DLK1

overekspression eller GSI behandling. Forsøgene blev udført i tre eksemplarer (* t-test, p-værdi 0,05).

Diskussion

Undersøgelser af

DLK1

har afsløret sine funktioner i celledifferentiering og proliferation [5], [6], [10]. Det er også blevet rapporteret, at

DLK1

er afvigende udtrykt i forskellige typer af humane cancerformer, herunder ikke-småcellet lungecancer [14], [16], [22], [23]. Disse undersøgelser i humane kræftformer hovedsagelig fokuseret på den unormale udtryk for

DLK1

men ikke udforske sin tilknytning til kræft metastaser. Vores tidligere arbejde med metastase-associerede gener i human lunge SCC foreslået, at

DLK1

kan fungere i tumormetastase (data ikke vist). I den foreliggende undersøgelse, vi valideret at overekspression af

DLK1

kunne forbedre den invasive evne lungecancerceller (som figur 1 er vist), hvilket er i overensstemmelse med vores tidligere fund afledt af genekspression profilering og udvider vores viden om dlk1 funktion i human cancer.

Selvom DLK1 protein mangler DSL motiv, som menes at spille en nøglerolle i ligander interaktioner med Notch-receptorer, en interaktion mellem DLK1 og NOTCH1 receptoren er blevet vist i en gær to-hybrid-systemet [19]. Men DLK1 effekt på Notch signalvej er stadig kontroversiel [4], [5], [19]. Baladron et al. foreslog, at effekten af ​​

DLK1

på Notch signalering er forskellig mellem

DLK1

varianter. Ud fra følgende betragtninger udskilt DLK1 kan fungere som et Notch antagonist, kan membran DLK1 aktivere Notch. Vores resultater viste, at en blanding af membran og udskilt DLK1 kan aktivere Notch signalering i humane lungecancerceller. Anvendelsen af ​​en blanding af

DLK1

varianter her blev udført i et forsøg på at efterligne situationer in vivo. Foruden Notch signaleringsaktivering, vi også observeret en opregulering af NOTCH1 ekspression under stimulering af

DLK1

overekspression. Især aktivering af Notch signalering af

DLK1

kan være en kombineret effekt af opregulering af NOTCH1 udtryk og NOTCH1 spaltning stimuleret af DLK1 binding. Derudover er afvigende ekspression af NOTCH1 findes i forskellige typer af humane kræftformer [24], [25], herunder ikke-småcellet lungecancer [26], [27]. Fordi vores undersøgelse tyder på en regulerende forhold mellem

DLK1

NOTCH1

, er det naturligt at hypotesen, at den unormale udtryk for NOTCH1 i kræft er delvis en konsekvens af afvigende ekspression af DLK1.

Vi fandt, at

DLK1

-promoted invasion af lunge kræftceller blev associeret med opregulering af MMP9 udtryk og dets ekstracellulære aktivitet (figur 2), der er involveret i ECM nedbrydning og stærkt forbundet med tumor invasion [ ,,,0],20]. Vi undersøgte endvidere, om Notch signalering var involveret i

DLK1

-regulated MMP9 udtryk ved hjælp af en GSI at blokere Notch signalering og derefter vurdere respons MMP9 under stimulation af

DLK1

udtryk. Vi observerede et signifikant fald i forhøjede MMP9-ekspression, når Notch signalering blev blokeret (figur 4). Interessant, har vi også observeret, at

DLK1

kunne stadig moderat opregulere MMP9 udtryk, når den Notch signalvejen blev blokeret, hvilket indebærer, at

DLK1

kan fungere i kræft invasion i både Notch signalering-afhængige og -uafhængige manerer. Trods interaktionen af ​​DLK1 og NOTCH1, er det også blevet rapporteret, at DLK1 kunne fungere i andre signalveje. For eksempel kan DLK1 interagere med IGFBP1 /IGF-1-komplekser og aktivere IGF-receptoren signalering [6] og kunne også øge phosphorylering af MEK /ERK og aktivere MEK /ERK-signalering [28], [29]. Vores arbejde foreslog også, at DLK1 kunne aktiv NF-KB-signalering (data ikke vist). I betragtning af at signalveje i en celle har betydelig krydstale og at gentranskription reguleres af en kombination af forskellige veje, som vi mener er både logisk og dosisafhængig, er det ikke overraskende, at

DLK1

kunne øge celle invasion gennem flere veje.

Som konklusion data præsenteret i denne undersøgelse viste sig rollen som

DLK1

i kræft invasion og udforskede den molekylære mekanisme bag denne funktion, hvilket gør

DLK1

en ny kandidat gen i kræft metastase studier.