PLoS ONE: Identifikation af en roman TGFp /PKA Signaling Transduceome ved mediering Kontrol af Cell Overlevelse og Metastase i Colon Cancer

Abstrakt

Baggrund

Forståelse drivere til metastase i human cancer er vigtigt for udviklingspotentiale af behandlinger til behandling metastaser. Rollen for tab af TGFp tumor suppressor aktiviteter i metastatiske proces er hovedsagelig ukendt.

Metode /vigtigste resultater

Ved hjælp

in vitro

in vivo

teknikker, vi har vist, at tabet af TGF tumor suppressor signalering er nødvendigt at give det sidste trin i den metastatiske proces – kolonisering af metastatisk site. Dette arbejde viser for første gang, at TGFp-receptor rekonstituering fører til nedsat metastatisk kolonisering. Desuden har vi identificeret en roman TGF /PKA tumor suppressor vej, der virker direkte på et kendt celle overlevelse mekanisme, der reagerer på stress med survivin /XIAP afhængig hæmning af caspaser herpå apoptose. Koblingen mellem TGF /PKA transduceome signalering og kontrol af metastaser gennem induktion af celledød blev vist ved TGF-receptor restaurering med reaktivering af TGF /PKA-vejen i receptor mangelfulde metastatiske kolon kræftceller, der fører til styring af afvigende celle overlevelse.

Konklusion /betydning

Dette arbejde påvirker vores forståelse af de mulige mekanismer, der er afgørende for vækst og vedligeholdelse af metastaser samt forståelse af en roman TGF funktion som metastatisk lyddæmper. Disse resultater rejser muligheden for, at regenerering af svækket TGFp signalering ville være et effektivt mål i behandlingen af ​​metastaser. Vores arbejde viser det kliniske potentiale for at udvikle anti-metastase terapi baseret på hæmning af dette meget vigtige afvigende celle overlevelse mekanisme den mangesidede TGFp /PKA transduceome induceret vej. Udvikling af effektive behandlinger for metastatisk sygdom er et presserende behov for, da metastaser er den største dødsårsag i solide tumorer

Henvisning:. Chowdhury S, Howell GM, Rajput A, Teggart CA, Brattain LE, Weber HR, et al. (2011) Identifikation af en roman TGFp /PKA Signaling Transduceome ved mediering Kontrol af Cell Overlevelse og Metastase i tyktarmskræft. PLoS ONE 6 (5): e19335. doi: 10,1371 /journal.pone.0019335

Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: Februar 18, 2011; Accepteret: 27 marts 2011; Udgivet: 3 maj 2011

Copyright: © 2011 Chowdhury et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health giver CA72001 og CA38173 til MGB. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de mest almindelige maligne sygdomme med høj incidens globalt [1] og er den næsthøjeste årsag til kræft dødsfald blandt voksne i USA [2] Stater. CRC kan helbredes ved kirurgi og multimodal behandling i omkring halvdelen af ​​de personer med denne sygdom (fase I-III). Imidlertid metastase til fjerne organer (trin IV) er den hyppigste årsag til behandlingssvigt [2]. Nyligt arbejde har understreget betydningen af ​​udviklingen af ​​uhensigtsmæssig celleoverlevelse signalering af forskellige trin i den metastatiske proces. Særligt bemærkelsesværdigt i forbindelse med overlevelse signalering i den metastatiske proces er betydningen af ​​aberrerende celle overlevelse til vellykket kolonisering ved metastatiske steder i distale organer [3]. Vigtigere er molekylære mekanismer involveret i den tidlige fase af metastase kritisk til diagnose og terapi ikke godt forstået [1]. Flere vigtige spillere, herunder Bcl-2, inhibitor-of-apoptosis (IAP) proteiner XIAP og survivin, og phosphoinositid 3-kinase (PI3K) – AKT /PKB som overfører anti-apoptotiske signaler i at fremme cancercellevækst har været impliceret i metastase [4], [5].

tumorsuppressorgener (GTS) bidrage til induktion af apoptose som reaktion på stress. Den manglende inducere apoptose som reaktion på forskellige typer af cellulære skader har været længe anerkendt som bidrager til onkogenese. Et eksempel på GTS tab bidrager til dannelse kræft og progression er TGFp signalering [2]. The TGFp-signalvejen har bidraget både negativt og positivt i regulering vækstinhibering, proliferation, replikation, invasion, metastase, apoptose, immun-overvågning og angiogenese i en kontekst-afhængig måde [6]. TGFp inhiberende /tumor suppressor responser faldt med stigende progression og i sen maligniteter ofte beskadiget på en måde, der understøtter invasion og metastase [6]. Mens korruption TGFp svar til støtte metastaser indebærer tilstedeværelsen af ​​funktionelle receptorer i disse celler, er det lige så klart, at der er betydelige antal modeller, der spænder fra transgene mus til humane cancer xenografter indikerer, at tab eller dæmpning af receptor udtryk i en lang række tumortyper fører til forøget malignitet [7], [8], [9], [10]. Disse resultater tyder på, at nogle undergrupper af cancere har ført en vej mod malign progression involverer tabet af TGFp receptorekspression mens andre har, i en endnu ukendt måde misbruges TGFp signalering at drive malign progression. Der er flere eksempler på, TGF-receptor nedregulering i kliniske prøver indikerer, at TGF-receptor RI og /eller RII (betegnet TGFβRI og TGFβRII henholdsvis) nedregulering er tidlige begivenheder i onkogenese og at tab af receptor ekspression ved epigenetisk inaktivering korrelerer til malign progression i undergrupper af flere kræfttyper [11], [12].

Vi har vist, at TGFp signalering i et tidligt stadium non-metastatisk coloncarcinom model fører til celledød i colon cancerceller som reaktion på stress i forbindelse med inaktivering af Pakt og inhibering af ekspressionen af ​​IAP-protein survivin [13]. Kompleksdannelse mellem survivin og anden IAP-protein XIAP i cytoplasmaet som reaktion på stress muliggør stabilisering af XIAP og inhibering af dets effektor og bøddel caspase mål at inhibere celledød [14]. Henset den dominerende rolle PI3K /AKT-signalering i celle overlevelse mekanismer og sammenslutningen af ​​XIAP og survivin i kræft progression [5], vi postulerede, at tabet af TGF-signalering kan bidrage til øget XIAP /survivin udtryk og dermed tab af TGF-signalering kan være en nøgle til en afvigende overlevelse mekanisme tillader metastatisk vækst ved distale organsteder i modsætning til den aktuelle visning, at TGFp TSG er primært en gatekeeper at forhindre onkogenese.

TGFp signalering har vist sig at aktivere cAMP- afhængige Protein kinase A (PKA) [15]. PKA spiller en dominerende rolle i integrationen af ​​flere signal transduktion netværk [16], herunder evnen til at afbryde XIAP /survivin kompleks gennem fosforylering af survivin på Ser

20 [17].

De molekylære mekanismer involveret i TGFp-medieret nedregulering af IAP blev undersøgt for at bestemme virkningerne af TGFp-receptor signalering på metastase i en metastatisk ortotopisk model af coloncarcinom. Vi har nu rapporterer identifikation af en roman TGF /PKA /AKAP medieret transduceome der konvergerer på XIAP funktion i at kontrollere afvigende celle overlevelse. Derudover har vi vist, at TGFp-receptor redning i stærkt metastatiske celler med epigenetisk inaktivering af TGFp-receptorer fører til nedsat metastaser i en TGFp /PKA signaling pathway afhængig mekanisme i en yderst metastatiske ortotopisk coloncancer modeller in vivo. Redning af specifikke tumor suppressor aspekter af TGFp signaleringsvej kan tilvejebringe terapeutiske fordele uden at fremme cellens overlevelse og metastatiske virkninger af TGFp. Hvis disse TGFp tumor suppressor effekter kan efterlignes i sene fase tumorer, i sidste ende kan opnås terapeutisk værdi mod metastaserende CRC.

Resultater

TGFp aktiverer PKA i kolon kræftceller

En kritisk rapport fra Simeone laboratorium bemærkede, at TGF-signalering aktiverer PKA i Mv1 Lu celler og medierer kontrol over TGFp væksthæmmende svar [15]. TGFp aktivering af PKA blev medieret af en Smad-afhængig, cyklisk AMP (cAMP) -uafhængig mekanisme. Dette rejste muligheden for, at TGFp signalering medieret kontrol af afvigende celleoverlevelse observeret i den tidlige fase TGFp-sensitive FET coloncarcinom model kan indebære aktivering af PKA. Vi antager, at TGFp aktiverer PKA i FET celler i en lejr uafhængig, Smad afhængig mekanisme. Til dette formål blev FET-celler behandlet med TGFp (5 ng /ml) for angivne tidspunkter, og et protein kinase assay blev udført til måling af PKA-aktivitet (figur 1A). Efter TGFp behandling, PKA-aktivitet steg med ca. 2 gange inden for 15 min og 4 gange ved 1 time. Det blev observeret, at TGFp-medieret PKA-aktivering blev helt ophævet efter forbehandling af celler med H89 (15 uM), en farmakologisk PKA inhibitor [15]. TGFp-medieret aktivering af PKA var også koncentrationsafhængig (figur 1B) med maksimal aktivitet i FET-celler observeret ved 5 ng /ml TGFp. For at bekræfte at aktivering af PKA var nedstrøms for Smad aktivering af TGFp, observerede vi, at forbehandling med H89 havde ingen virkning på phosphorylering af Smad2 af TGFp hjælp immunoblotanalyse (figur S1). Vi udviklede stabile PKA katalytisk α subunit shRNA knockdown i FET celler (betegnet FET PKACatα KD) for at validere H89 respons genetisk (figur S2). TGF behandling for de angivne tider ikke var i stand til at aktivere PKA i Knockdown celler i modsætning til robust aktivering i forældrenes FET celler (Figur 1C). Aktivering af PKA af TGFp har vist sig at være cAMP uafhængig i Mv1 Lu-celler [15]. Klassisk PKA-aktivering involverer cAMP-binding til de regulatoriske underenheder af PKA til at udløse dissociation af de katalytiske underenheder. En alternativ mekanisme for PKA-aktivering indebærer sammenslutning af IKB med PKA katalytiske subunits, og dermed bevare en inaktiv tilstand af PKA. Upon IKB-nedbrydning, er der aktivering af PKA uafhængig af cAMP-aktivering [18]. Vi afgøres, om aktivering af PKA af TGFp er afhængig af cAMP aktivering i FET celler ved at behandle celler med TGF og måle cAMP niveauer ved hjælp af en ikke-radioaktiv cAMP enzym immunoassay (Figur 1D). Det blev observeret, at TGFp var ikke i stand til at øge cAMP-produktion i modsætning til forskolinbehandling som ydes en betydelig stigning i cAMP-niveauer som forventet. Dernæst undersøgte vi IKB-proteinet efter TGFp behandling for bestemte tidspunkter for at bestemme, om aktivering af PKA af TGFp skyldtes IKB-nedbrydning (Figur S3). IKB-niveauer forblev uændret efter TGFp behandling. Derfor er PKA aktiveres af TGF i en lejr og IKB uafhængig måde i FET celler efter aftale med rapporten fra Zhang et al (2004). For yderligere at bekræfte den funktionelle betydning af TGFp-medieret PKA-aktivering, blev transkriptionsfaktoren CREB testet, som er blevet identificeret som et direkte mål for cAMP-PKA-signalvejen [15]. Vi observerede, TGFp var i stand til at stimulere phosphorylering af CREB (figur 1E) uden ændring i den samlede CREB niveauer (data ikke vist). Forbehandling af celler med H89 efterfulgt af TGFp eksponering signifikant reducerede phosphorylering af CREB. Zhang et al (2004) blev det understreget den rolle, aktiverede Smad3 i TGFp-medieret PKA-aktivering. Vi udviklede stabil shRNA Smad3 knockdown i FET celler (betegnet FET Smad3KD) (Figur S4). TGFp behandling på disse Smad3 knockdown celler var ude af stand til at aktivere PKA (figur 1F) indikerer afhængighed af TGFp-medieret PKA-aktivering på Smad3 som rapporteret tidligere [15].

FET celler behandlet med TGFp (5 ng /ml ) aktiveret PKA i en tid (a) og koncentration (B) afhængig måde. PKA inhibitor H89 (15 uM) blev anvendt til at inhibere PKA-aktivering. Forskolin (10 pM) blev anvendt som en positiv kontrol. Sammenligning af forældrenes FET og FET PKACatα KD celler til TGFP medieret PKA-aktivering (C). Knockdown af katalytisk α-underenhed ophævet PKA-aktivering af TGFp. PKA-aktivering med TGFp er uafhængig af cAMP generation som bestemt ved cAMP assay (D). TGFp fører til CREB aktivering i FET celler (E). Actin blev anvendt som ladningskontrol til western blots. PKA-aktivering af TGFp er Smad3 afhængig bestemt ved knockdown af Smad3 i FET celler (F). Resultaterne er udtrykt som middelværdi ± S.E.M (n = 3). Alle forsøg er blevet gentaget tre gange uafhængigt af hinanden.

TGFp /PKA signalering medieret XIAP nedregulering

XIAP og survivin er godt karakteriserede IAP familiemedlemmer nylig dokumenteret som metastatiske gener [5]. Deres samordnet rolle i at fremme celle overlevelse og metastase giver en stærk begrundelse for at målrette ekspression og /eller aktivitet af disse IAP i fremskredne stadier af kræft. En tidlig hændelse i forbindelse med PKA-aktivering er phosphorylering af survivin på Ser

20 i cytosolen, men ikke i mitokondrier [17]. Denne phosphorylering af survivin har vist sig at forstyrre bindingen interface for XIAP, hvilket fører til XIAP nedbrydning. Vore data samt tidligere rapporter viser, at PKA-aktivering respons er en tidlig hændelse efter TGFp behandling, og det opnår maksimale niveauer inden for 1 time af TGFp behandling. Vi hypotese, at TGFp forårsager en frigørelse af afvigende celleoverlevelse ved at stimulere PKA medieret afbrydelse af XIAP /survivin kompleks. FET-celler blev behandlet med TGFp for de specificerede gange efterfulgt af bestemmelse af XIAP og survivin (figur 2A og S5). TGF behandling nedreguleret både XIAP og survivin på de angivne tidspunkter. Som survivin fosforylering allerede har vist sig at være knyttet til PKA-aktivering, vi fokuserede vores opmærksomhed på reguleringen af ​​XIAP. Nedbrydning af XIAP blev blokeret af H89 forbehandling forud for TGF eksponering for de angivne tidspunkter (figur 2B). For at undersøge specificiteten af ​​svaret, vi sammenlignede effekten af ​​TGFP på FET PKACatα KD celler og forældrenes FET celler (Figur 2C). TGFp behandling havde ingen virkning på XIAP proteinniveauer i FET PKACatα KD-celler indikerer afhængighed af PKA katalytiske subunit i TGFp-medieret tab af XIAP-protein. For at bekræfte specificiteten af ​​TGF /PKA-vejen i dette svar, blev FET Smad3 KD celler behandlet med TGFp for de angivne tidspunkter og XIAP proteinekspression blev bestemt (figur 2D). I overensstemmelse med Smad3 afhængighed af TGFp medieret PKA-aktivering, stabil shRNA knockdown af Smad3 ophævet XIAP nedregulering. En proteasomalaktivitet inhibitor (MG132) blev anvendt til at bestemme, om tabet af XIAP var afhængig proteasomalaktivitet nedbrydning (Figur 2E). Det blev observeret, at forbehandling af FET celler med MG132 (15 uM) i 1 time før TGFp behandling fuldstændigt ophævede XIAP nedbrydning indikerer, at XIAP nedbrydes inden for proteasomet. PKA er en vigtig regulator af proteasomalaktivitet og PKA har vist sig at co-oprenses med proteasomet [19], [20]. Vi antager, at TGF /PKA medieret regulering af proteasomalaktivitet kan give endnu et lag af kontrol over IAP udtryk (ud over den PKA induceret fosforylering af survivin på Ser

20). Tidligere rapporter indikerer, at PKA phosphorylerer Rpt6 ATPase, som udfolder og transporterer substrater til proteasomet og denne phosphorylering forbedrer chymotrypsin proteasomalaktivitet aktiviteter proteasomet [21]. Til dette formål har vi fastslået, om TGFp-medieret PKA-aktivering er i stand til at øge chymotrypsin-lignende proteasomalaktivitet anvendelse af en proteasomalaktivitet assay. TGFp behandling af FET celler selektivt stimuleret chymotrypsin-lignende aktivitet af proteasomet inden for 1 time (figur 2F). H89 forbehandling før TGFp eksponering fuldstændigt ophævet basisniveauet af proteasomalaktivitet chymotrypsin-lignende aktivitet og helt afskaffet de stimulerende virkninger af TGFp på proteasomet.

TGFp (5 ng /ml) behandling for angivne tidspunkter nedregulerer XIAP i FET celler (A) og denne effekt er medieret af PKA som forbehandling med PKA-inhibitor H89 før TGF eksponering ophæver XIAP tab (B). Stabil shRNA knockdown af PKA katalytiske subunit i FET celler fører til ophævelse af XIAP tab (C). Stabil shRNA knockdown af Smad3 fører til ophævelse af XIAP tab i FET celler (D). TGFp (5 ng /ml) medieret XIAP nedregulering er en proteasomalaktivitet begivenhed. Forbehandling med proteasomalaktivitet inhibitor MG132 (15 uM) ophævet XIAP tab af TGF (E). TGFp-medieret aktivering af PKA fører til aktivering af chymotrypsinaktivitet i proteasomet og denne effekt ophæves af H89 (F). Resultaterne er udtrykt som middelværdi ± S.E.M (n = 3). Actin blev anvendt som ladningskontrol til western blots. Alle forsøg er blevet gentaget tre gange uafhængigt af hinanden.

Kollektivt disse data fører til den hypotese, at TGFp /PKA signalering regulerer XIAP-ekspression på flere niveauer med aktivering af PKA fører til phosphorylering af centrale proteasomalaktivitet komponenter, fremme proteasomalaktivitet nedbrydning af XIAP.

AKAP regulerer TGF /PKA medieret XIAP nedregulering

der er en overflod af A-kinase forankring proteiner (AKAP’er), som inddeler PKA og andre enzymer til i nærheden af specifikke cellulære organeller til udførelse af enzym-funktion. Vi antager, at AKAP’er er en vigtig komponent i TGF /PKA medieret XIAP nedregulering. Det er veldokumenteret, at den subcellulære lokalisering af PKA regulatoriske underenheder (PKARI og /eller PKARII) medieres gennem interaktion med AKAP’er [22]. AKAP inhibitor Ht31, har en syntetisk skjoldbruskkirtel forankring peptid vist sig at være et meget potent kompetitiv inhibitor af PKARII /AKAP interaktionen og derved forhindre PKA forankring [23]. For at sikre at Ht31 specifikt var målrettet AKAP-PKA-interaktioner, udførte vi PKA aktivitetsassays på FET celler for at bestemme omfanget af PKA-aktivering efter forbehandling med Ht31 (25 uM) forud for TGFp eksponering (figur 3A). Efter aftale med tidligere undersøgelser [15], Ht31 var i stand til at blokere for TGFP medierede PKA-aktivering. Siden AKAP-PKA interaktion synes at være et krav for TGFp medieret PKA-aktivering, vi ræsonnerede, at disse interaktioner også kan være nødvendigt for downstream signalering begivenheder, der førte til XIAP tab (figur 3B). Tilsætning af Ht31inhibitor i 1 time før TGFp behandling af specificerede tider fuldstændig ophævede XIAP tab.

AKAP inhibitor Ht31 (25 uM) behandling i 1 time før TGFp eksponering ophæver TGFp-medieret PKA-aktivitet (A) og TGFp medieret XIAP tab (B). AKAP149 siRNA knockdown blev udført på FET celler (C). Knockdown af AKAP149 fører til ophævelse af TGFp-medieret PKA-aktivitet (D) og XIAP nedregulering (E). Resultaterne er udtrykt som middelværdi ± S.E.M (n = 3). Actin blev anvendt som ladningskontrol til western blots. Alle forsøg er blevet gentaget tre gange uafhængigt af hinanden.

Siden AKAP familien omfatter mere end 50 medlemmer [24], udfordringen var at identificere en individuel AKAP der reagerede på de TGFp /PKA virkninger på XIAP . Efter indledende screening for tilstedeværelsen af ​​forskellige AKAP familiemedlemmer i FET celler, fandt vi AKAP149 proteinekspression i disse colon cancerceller. AKAP149 (som også benævnes D-AKAP1 og AKAP121 i mus) er blevet identificeret som et membranprotein af mitokondrierne [25]. Det er blevet rapporteret, at mitokondriel AKAP121 er involveret i at målrette cAMP aktiverede PKA til den ydre mitokondriske membran (OMM) og spiller en rolle i mitokondrie biogenese og overlevelse [26]. Vi hypotese baseret på den forståelse, at mitokondrie XIAP og survivin flytte til cytoplasmaet efter en stress reaktion, at AKAP149 kunne regulere TGFp /PKA medieret XIAP nedbrydning. Ekspression af et AKAP149 lille interfererende RNA (siRNA) forhindrede TGFp-medieret PKA-aktivering (figur 3C-D). Yderligere observerede vi, at TGFp var ikke i stand til at nedregulere XIAP protein i AKAP149 siRNA knockdown celler sammenlignet med parentale FET kontrolceller (figur 3e). Dette pro-apoptotiske funktion AKAP149 er i modsætning til den kendte funktion af mitokondriel AKAP121 (eller dets humane homolog AKAP149) at fremme overlevelse.

Vi næste spørgsmålstegn ved, om virkningen af ​​AKAP149 var selektiv i denne TGFp /PKA virkning . Mens AKAP-PKA interaktion er et globalt fænomen, validering af AKAP149 som selektivt regulerer TGFp /PKA signalering ville være en roman udvidelse af vores forståelse af TGF /PKA medieret XIAP nedregulering. AKAP220 er blevet vist at regulere proteinphosphatase 1 (PP1) -aktivitet ved at koordinere placering af PKA og PP1 katalytiske underenhed [27]. Vi tavshed udtryk for AKAP220 i FET celler med AKAP220 siRNA. Disse transficerede celler ved behandling med TGFp ikke havde nogen virkning på hverken induktionen af ​​PKA aktivitet eller XIAP nedregulering (data ikke vist). Tilsammen AKAP stilladser spiller en central rolle i TGF /PKA-vejen medieret XIAP nedregulering med mitokondrie lokaliseret AKAP149 er nødvendigt for TGF /PKA medieret respons.

Inddragelse af PP2A i TGFp /PKA medieret XIAP nedregulering

det er blevet observeret, at aktivering af PKA fører til inaktivering af AKT gennem dephosphorylering af proteinphosphatase 2A (PP2A) [28]. Dette førte til den hypotese, at TGFp-medieret aktivering af PKA er ansvarlige for undertrykkelsen af ​​AKT-aktivering, som vi tidligere rapporteret som følge af TGFp signalering [13]. Derfor bestemte vi PP2A aktivitet i FET celler (Figur 4A). TGF behandling for bestemte tidspunkter markant øget PP2A aktivitet. PP2A selektiv inhibitor okadainsyre (OA, 50 nM) var i stand til helt at afskaffe PP2A aktivering, når de behandles alene eller forbehandlet før TGF eksponering. Dernæst testede vi rolle TGF i mediere AKT inaktivering og XIAP tab (figur 4B). Det blev observeret, at TGFp-medieret dephosphorylering af AKT er PP2A afhængig som afspejlet ved evnen af ​​OA til at blokere TGFp-medieret dephosphorylering af AKT. XIAP nedregulering blev også afskaffet ved OA behandling. Selvom PP2A er en tumorsuppressor involveret i kontrollen af ​​flere celleoverlevelsesforløb [29], dokumentation af en rolle i at undergrave celle overlevelse signalering i TGFp-vejen er en hidtil ukendt forlængelse af PP2A funktion.

FET celler blev behandlet med TGFp (5 ng /ml) i den angivne tid og PP2A-aktivitet blev bestemt under anvendelse PP2A-aktivitet assay-protokol som beskrevet i materialer og fremgangsmåder (A). PP2A inhibitor okadainsyre (OA, 50 nM) blev anvendt til at inhibere PP2A. Forbehandling med OA før TGF (5 ng /ml) behandling ophævet TGFp medieret XIAP tab og dephosphorylering af AKT (B). Stabil shRNA knockdown af PP2A katalytisk α-underenhed blev udført på FET celler (C). Knockdown af PP2A katalytisk α-underenhed førte til ophævelse af TGFp (5 ng /ml) medieret XIAP nedregulering uden at påvirke PKA-aktivitet (D-E). XIAP immunopræcipitationsundersøgelser i FET celler behandlet med TGFp (5 ng /ml) eller forbehandlet med H89 eller Ht31 i 1 time før TGFp eksponering. XIAP dissocieres fra Pakt efter TGFp behandling for angivet tid (F). Hæmme PKA aktivitet ved H89 eller AKAP-PKA interaktion med Ht31 ophæver den TGFp medierede XIAP-Pakt dissociation.

For yderligere at validere rolle PP2A i TGFp /PKA signalering, genereret vi stabilt shRNA PP2A katalytisk underenhed knockdown i FET celler betegnet FET PP2A Cat KD (figur 4C). TGFp behandling af FET PP2A Cat KD celler viste PKA-aktivering angiver, at PKA-aktivering er opstrøms for PP2A aktivering (figur 4D). Imidlertid stabil shRNA knockdown af PP2A katalytiske subunit ophæves fuldstændigt TGFp-medieret XIAP hæmning og blev opretholdt phosphorylering af AKT samt (Figur 4E). FET PKACatα KD celler behandlet med TGFp viste også en vedvarende fosforylering af AKT (data ikke vist).

Mens hæmning af AKT aktivering ville have potentiale for mange effekter på celle overlevelse, en effekt, der er af særlig interesse som relateret til TGFp /PKA-funktionen er i den sammenhæng, at det er rettet mod XIAP stabilitet. En tidligere undersøgelse rapporterede, at XIAP phosphoryleres af AKT på Ser

87, som fører til øget stabilisering af XIAP og nedsat apoptose af ovariecancerceller som respons på cisplatin [30]. Vi ræsonnerede, at PP2A hæmning af AKT-aktivitet kan udgøre en ekstra mekanisme til afbrydelse af stabiliseringen af ​​XIAP der er målrettet af TGF /PKA vej gennem forøgelse af PP2A aktivitet. Til dette formål blev FET celler behandlet med TGFp eller forbehandlet med forskellige TGFp /PKA pathway hæmmere før TGFp eksponering for bestemte tidspunkter og immunopræcipiteret for XIAP og immunoblottedes for eventuelle proteiner bundet til XIAP. Vi fandt en sammenslutning af XIAP med Pakt (Figur 4F). Efter TGFp behandling, var der en signifikant dissociation af XIAP-Pakt kompleks. Imidlertid forbehandling med H89 eller Ht31 før TGFp eksponering fuldstændigt ophævet XIAP-Pakt dissociation af de to proteiner indikerer, at TGFp /PKA signalering medieret inaktivering af AKT destabiliserer XIAP fører frem til dets proteasomalaktivitet nedbrydning. Derfor bruger inhibitor og stabil Knockdown undersøgelser, vi understrege den hidtil ukendte opdagelse, at TGFp /PKA signalering medierer tab af XIAP protein ved en PKA-PP2A afhængige undertrykkelse af AKT aktivering fører til XIAP tab.

TGFp-receptor rekonstituering fører til faldt metastatisk kolonisering: Indvirkning på TGFp /PKA signalering

Vi har udviklet teknologi til ortotopisk colon implantation af humane coloncancer linjer i athymiske mus, der giver mulighed for reproducerbar kvantitativ analyse af metastaser til leveren og lungerne [31], [ ,,,0],32], [33]. Den metastatiske mønster vises i denne model-system afspejler karakteren af ​​metastatisk spredning i humane patienter. Meget metastatiske GEO kolon kræftceller blev brugt til yderligere at forstå konsekvenserne af TGF /PKA signalering på metastaser. GEO celler er svækket TGFβRI ekspression og dermed svækket TGFp tumorsuppressor signalering samt [8]. Vi har udnyttet colon ortotopisk implantation af subkutant dyrket xenotransplantater at karakterisere faktorer, der påvirker omfanget af metastase til leveren og lunger uden at påvirke invasion på den primære tumor site [31], [33]. GEO celler viste sig at være yderst metastatiske i denne ortotopisk model som afspejlet ved metastatisk kolonisering i 53% af de implanterede dyr (tabel 1). Redning af receptor dæmpning i GEO-celler ved transfektion af en TGFβRI ekspressionsvektor (betegnet GEORI) resulterede i en reduktion af metastatisk forekomst til ca. 20% af dyrene implanteret uden at påvirke invasion på den primære lokalitet som både GEO og GEORI transficerede dyr gav anledning til en invasiv primær tumor i 100% af implanterede dyr. GEO transplanterede dyr udviklede robust levermetastaser sammenlignet med GEORI (figur 5A). Hematoxylin og eosin (H & E) farvning viser levermetastaser i GEO-celler er vist i figur 5B. Karakteriseringen af ​​GEO tumorer viste øget celle overlevelse signalering som afspejlet af lavere TUNEL satser i forhold til GEORI tumorer indikerer en undertrykkelse af metastatisk kolonisering af TGF tumor suppressor signalering er forbundet med undertrykkelse af celle overlevelse signalering in vivo (figur 5C-D). Endvidere blev der ikke observeret nogen ændring i Ki67 IHC farvning mellem højt metastatisk GEO og dårligt metastatiske GEORI primære tumorer indikerer ingen forskel i spredning sats in vivo mellem GEO og GEORI tumorer (Fig 5E-F). In vivo resultater viser, at genoprettelsen af ​​TGFp-receptor undertrykker metastatisk kompetence i GEO-celler på niveau med metastatisk kolonisering i modsætning til at forebygge invasion.

Sammenligning af GFP billeder af metastatisk progression i leveren i GEO og GEORI mus ( EN). GEO Colon Cancer Lever H & E farvning viser levermetastaser (B). Sammenligning af primære tumor sektioner af GEO og GEORI mus ved TUNEL assay farvning som nævnt i materialer og metoder til at bestemme deres apoptotiske satser (C). De apoptotiske satser blev kvantificeret (D). Sammenligning af primære tumor sektioner af GEO og GEORI mus ved Ki-67 farvning som nævnt i materialer og metoder til at bestemme deres satser for spredning (E). De spredning satser blev kvantificeret (F). TGFp-receptor rekonstituering fører til en ændring i PKA-aktivitet. Sammenligning af PKA aktivitet i meget metastatiske GEO celler vs dårligt metastatiske GEORI celler (G) og i meget metastatiske CBS celler vs dårligt metastatiske CBSRII celler (H). Sammenligning af TGF (5 ng /ml) eksponering mellem GEO og GEORI celler (I) og CBS og CBSRII celler (J). PKA-inhibitor H89 ophævet TGFP medieret XIAP tab i GEORI og CBSRII celler (K).

En nøgle til at kapitalisere på undertrykkelse af metastase af TGF signalering er opklaringen af ​​den molekylære mekanisme, hvormed metastase inhiberes. Baseret på faldet i metastatisk forekomst med TGFp-receptor rekonstituering fører til redning af TGFp signalering, vi hypotese, at TGFp /PKA-medieret XIAP nedregulering kræver en intakt TGFp signalering mekanisme, som er tabt i de stærkt metastatiske GEO celler. Men redning af TGFp signalering ved receptor rekonstituering i GEORI celler fører til nedsat metastatisk forekomst bør øge TGFp /PKA-signalering og dens downstream virkninger på XIAP. GEO celler med svækket TGFp signalering havde ingen PKA-aktivering med TGFp eksponering (figur 5G). Imidlertid GEORI celler med funktionel TGFp signalering på grund af receptor rekonstituering havde en robust stigning i PKA-aktivering med TGFp som var omkring 4 gange højere end kontrollen. En anden koloncarcinomcellelinie (CBS celler) med svækket TGFβRII signalering [34] viste også reduceret metastase efter redning af receptor-mangel (data ikke vist). En lignende reaktion i PKA-aktivitet blev observeret i meget metastatiske CBS-celler i forhold til de dårligt metastatiske CBSRII celler efter TGFp behandling in vitro (figur 5H).

Efter denne observation, vi hypotese, at den meget metastatisk GEO og CBS-celler ville være resistente over for den TGFp /PKA signalering medieret tab af XIAP-protein. Vi begrundet, at manglende evne TGFp signalering at fremkalde PKA-aktivering i disse celler på grund af receptor inaktivering ville også forhindre dens downstream virkninger på XIAP derved gøre disse celler mere metastatiske gennem øget pro-overlevelse signalering. Mens GEO og CBS begge viste ingen respons på TGF behandling på bestemte tidspunkter (figur 5I-J), viste GEORI og CBSRII celler XIAP nedregulering for lignende behandlinger (Figur 5I-J).