PLoS ONE: topoisomerase-I PS506 som en dobbelt funktion Cancer Biomarkør

Abstrakt

Nye biomarkører for kræft diagnose og udvælgelse terapi er et presserende behov for at lette tidlig påvisning og forbedre terapi resultater. Vi har tidligere identificeret en hidtil ukendt phosphoryleringssted ved serin 506 (PS506) på topoisomerase-I (topo-I) og har vist, at det udtrykkes bredt i cellelinjer afledt fra flere kræftformer, herunder lungekræft, men er lav i cellelinier afledt fra ikke-cancerøse væv. Her har vi undersøgt, hvordan PS506 ekspression i lunge vævsprøver korrelerer med deres malign status. Vi finder, at PS506 ekspression signifikant forhøjet i maligne tumorer af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) sammenlignet med tilstødende, ikke-kræft lungevæv og godartede lungetumorer. PS506 ekspression var op til 6 gange højere i maligne prøver end i parrede ikke-malignt væv. Brug af velkarakteriserede NIH /NCI 60-cellelinje panel, vi korrelere de forhøjede ekspressionsniveauer af PS506 i lunge, ovarie, og coloncancer cellelinier med forøget følsomhed over for camptothecin, en plante alkaloid, der er målrettet topo-I. Dette er i overensstemmelse med vores tidligere studier i et mindre udsnit af cellelinjer og med vores fund, at PS506 øger topo-I DNA-binding. To udbredte kemoterapeutiske lægemidler til æggestokkene og tyktarmskræft, topotecan og irinotecan henholdsvis stammer fra camptothecin. Irinotecan har også vist effekt i kliniske forsøg med NSCLC. Vores resultater antyder, at forhøjet PS506 ekspression kan korrelere med klinisk kemosensitivitet over for disse stoffer i æggestokkene, colon og NSCLC. PS506 kan derfor tjene som en biomarkør til diagnosticering eller udvælgelse terapi

Henvisning:. Zhao M, Gjerset RA (2015) Topoisomerase-I PS506 som en dobbelt funktion Cancer Biomarkør. PLoS ONE 10 (8): e0134929. doi: 10,1371 /journal.pone.0134929

Redaktør: Zhiqian Zhang, Peking University Cancer Hospital Institut, KINA

Modtaget: 4. oktober, 2014 Accepteret: 15 juli 2015; Udgivet: 6. august, 2015

Copyright: © 2015 Zhao, Gjerset. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. RG Biopharma ydet støtte i form af lønninger til forfatterne (RAG, MZ), men havde ikke nogen yderligere rolle i undersøgelsen design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller forfatterne artikuleres i afsnittet “forfatter bidrag”

Konkurrerende interesser:. MZ og RAG er tilknyttet RG Biopharma, hvor denne forskning blev udført. Dette selskab tilhørsforhold ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. RG er opfinder på US patent # 8431353 og USA foreløbig patentansøgning 62054242.

Introduktion

Nye molekylære biomarkører for kræft, især relevante for den mekanisme af kræft eller kræftbehandling, kunne øge magt øjeblikket anvendes diagnostiske metoder, reducere risikoen på over diagnose, lette behandlingsvalg, og i høj grad forbedre kræft overlevelse. Vi har tidligere identificeret en roman fosforylering site på topoisomerase I (topo I) på serinrest 506 (PS506), der er stærkt udtrykt i cancer-afledte cellelinjer, men er lav til målbart i cellelinjer afledt fra normale væv, hvilket gør det til en mulig kandidat som en malignitet-associeret biomarkør til diagnose [1].

Topo i spiller en vigtig rolle i DNA metabolisme, og er den unikke cellulære mål for irinotecan og topotecan, to udbredte kemoterapeutiske lægemidler afledt fra planten alkaloid camptothecin (CPT) [2, 3]. Ved at slække DNA supercoils der dannes under DNA-replikation og transkription, topo jeg lindrer torsionspåvirkning på DNA og tillader yderligere progression af replikationsgaflen og transkription kompleks henholdsvis [4-6]. Et basalt niveau af phosphorylering, primært på serinrester i N-terminalen domæne adskiller sig fra PS506 er nødvendig for topo I DNA-binding og aktivitet [7]. Øget topo I phosphorylering forekommer i mange cancer-afledte cellelinjer og korrelerer med ekspression af PS506 i kernen domæne i proteinet [8, 9]. Vi fandt, at PS506 ekspression også korrelerer med øgede niveauer af serin-threonin-proteinkinase, CK2, og at rekombinant topo I kan phosphoryleres på serin 506 af oprenset [1] CK2. CK2, som udtrykkes konstitutivt i lave niveauer i normale celler [10], tendens til at stige i cancer, og høje niveauer er tegn på dårlig prognose [11-15]. Hos mus, forhøjet CK2 forstærker pro-onkogene signalveje og samarbejder med onkogener at fremme tumorer [16-22], hvilket tyder på, at CK2 kan spille en fundamental rolle i kræft ved at skabe et gunstigt miljø for yderligere onkogene ændringer. Således kan afvigende ekspression af PS506 være symptomatisk for den pro-onkogen miljø skabt af forhøjet CK2.

Den terapeutiske relevans topo jeg også gør PS506 en potentiel biomarkør for behandlingsvalg. CK2-medieret S506 phosphorylering af basalt phosphoryleret rekombinant topo I genererer en topo I med øget DNA bindende aktivitet og øget DNA afslapning aktivitet på supercoilede plasmider [1, 8]. Vi observerede, at cellelinier, som udtrykker forhøjede PS506 niveauer var ofte mere følsomme over for CPT, i overensstemmelse med virkningsmekanismen af ​​dette stof, som bruger den enzymatiske aktivitet af topo I til skabe sin dødelig virkning [1]. Fordi CPT og beslægtede lægemidler tillader topo I-medieret DNA-nicking men inhiberer topo I-medieret DNA-religering, de forårsager DNA-strengen pause at fortsætte og i sidste ende at danne en dødelig DNA dobbeltstrenget brud. Denne mekanisme menes at redegøre for de terapeutiske virkninger af irinotecan og topotecan [2, 23, 24]. Den forbedrede DNA-binding og DNA afslapning aktivitet vi observerer med PS506 form af topo jeg kan derfor bidrage til klinisk respons på irinotecan og topotecan ved at fremme dannelsen af ​​DNA dobbelt-strenget pauser.

I denne undersøgelse har vi undersøgt den hypotese, at PS506 ekspression er karakteristisk for malignitet, og at de højeste niveauer af ekspression korrelerer med cellulære reaktioner på CPT-baserede lægemidler. At vurdere forholdet af PS506 til malignitet vi har undersøgt vævsprøver af maligne lungetumorer, parrede ikke-malign tilstødende lunge epitel, og godartede lungetumorer. For at vurdere nytten af ​​PS506 som en indikator for modtagelighed for CPT-baserede lægemidler, har vi screenet sit udtryk i cellelinier fra NCI-60 cellelinje panel til hvilke CPT følsomhed profiler var tilgængelige fra National Cancer Institute /Developmental Therapeutics Program ( NCI /DTP) database. Resultaterne indikerer en meget selektiv overekspression af PS506 i alle maligne lungeprøver undersøgte, sammenlignet med tilstødende ikke-malignt væv og benigne tumorprøver. I cellelinjer afledt af lunge-, tyktarms- og ovariecancer, finder vi, at de højeste niveauer af PS506 udtryk korrelerer med øget CPT følsomhed.

Materialer og metoder

Antistoffer

den pAb506P kanin IgG blev genereret til et 21-aminosyre-phosphopeptid (TVGCCS * LRVEHINLHPELKKC, hvori phosphoserin 506 er angivet med *), som tidligere beskrevet [1]. Gede-anti-topo I IgG, som genkender topo I C-terminus, og muse monoklonale anti-actin blev købt hos Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Muse monoklonalt anti-tubulin blev indkøbt fra Novus Biologicals (Littleton, CO). De sekundære antistoffer blev gede-anti-kanin-peberrodsperoxidase (HRP), gede-anti-muse-HRP, og æsel-anti-gede-HRP (Santa Cruz Biotechnology). For post-immunopræcipitation Westerns, blev det primære antistof påvises ved anvendelse Pierce Clean-Blot IP Detection Reagent (Thermo Scientific, Waltham, MA), som genkender kun hele, intakte IgG og ikke de dissocierede let eller tung kæde underenheder.

Cell line

NCI-H358 humane bronchioalveolar ikke-småcellet carcinom celler (H358), katalognummer CRL-5907, blev købt i maj 2011 fra American Type Culture Collection og var mycoplasma-fri. Celler blev dyrket ved 37 ° C i 10% CO

2 i Dulbeccos modificerede Eagles medium suppleret med 10% nyfødt kalveserum og additiver, som tidligere beskrevet [8]. For camptothecin behandling blev cellerne inkuberet i 24 timer i nærvær af 0,1 eller 1 uM camptothecin (Sigma, St. Louis, MO), efterfulgt af høst og Western-analyse som beskrevet nedenfor.

Cellepellets

Frosne cellepellets fra NCI 60-cellelinie-panel blev opnået fra Division of Cancer Treatment og diagnose (DCTD) Tumor repository af National Cancer Institute (NCI) og blev opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. De cellelinier, for hvilke der blev modtaget cellepellets er angivet i (S3 tabel).

Vævsprøver

Alle vævsprøver anvendt i denne undersøgelse blev fastfrosset, anonyme, offentligt tilgængelige arkivering eksemplarer af ikke småcellet lungekræft med parret ikke-maligne kontrol væv eller prøver fra godartede lungetumorer. Alle prøver blev modtaget fra Western Division af Cooperative humant væv Network (CHTN), Vanderbilt University, Nashville, TN. Ingen identificerbare privat patient eller donor oplysninger blev leveret med prøverne. Da ingen data blev opnået gennem intervention eller interaktion med den enkelte og da ingen identificerbare private oplysninger blev leveret til os, har denne forskning ikke udgøre mennesker forskning som defineret af CFR 46.102f og OHRP Vejledning om forskning Inddragelse Kodet Private Oplysninger eller biologiske prøver , og fik fritagelse gennemgang af Torrey Pines Institut for Molekylær Studies IRB.

vestlige analyser

Cell pellets (svarende til ~ 10

7 celler /pellet) eller to nær- sammenflydende 10 cm plader af PBS-vaskede H358 celler (svarende til ~ 2 x 10

7-celler) blev lyseret ved tilsætning af 350 pi pr pellet eller 700 pi pr plade af kold RIPA-puffer (10 mM Tris pH 8, 0,15 M NaCl, 0,1% SDS, 1% NP40, 1% deoxycholat), i hvilket der protease og phosphataseinhibitorer (Roche, Nutley, NJ) blev tilsat umiddelbart før anvendelse, og behandles som beskrevet tidligere [8]. Frosne vævsprøver (gennemsnitlig vægt ~ 0,3-0,5 g) blev homogeniseret i 3 ml RIPA buffer på is under anvendelse af en vævsformaler og derefter centrifugeret for at fjerne debris. De celler og væv lysater blev alikvoteret og frosset ved -80 ° C indtil anvendelse. Et nyligt optøede lysat blev anvendt til hver gel løb.

Lysater (70 ug protein, medmindre andet er angivet) blev opløst ved SDS-PAGE under anvendelse Kriterium 10-20% Tris-HCI færdigstøbte geler (Bio-Rad Laboratories , Hercules, CA). En ækvivalent mængde af en frisk optøet alikvot af referencen bestand af H358 lysat blev inkluderet i hver kørsel som en fælles kontrol. Efter elektroforese blev proteiner overført til PVDF-membraner og immunfarvet ved inkubation med primært antistof (1: 500 for tubulin, alle andre ved 1: 100), efterfulgt af passende HRP-konjugeret sekundært antistof (1: 1000), og Pierce ECL reagens ( Thermo Scientific), efterfulgt af udsættelse for film. Film blev scannet under anvendelse af en Alpha Imager og bånd blev kvantificeret med den medfølgende software. PS506 band intensiteter blev normaliseret til referencen H358 kontrol.

Immunfældning /Western blotting

Immunopræcipitationer blev udført i det væsentlige som beskrevet [25]. Kort fortalt blev cellelysater fra eksponentielt voksende H358 celler fremstillet i RIPA-buffer som beskrevet ovenfor. Cellulære proteiner (1-2 mg) blev immunpræcipiteret ved rocking natten over med 50 pi gede-anti-topo I (~ 10 ug). Immunkomplekser blev opsamlet ved tilsætning af 20 pi protein AG agarose efterfulgt af centrifugering. Immune komplekser blev dissocieret ved lavt pH i fravær af dithiothreitol eller β-mercaptoethanol at undgå dissociation af IgG. Elektroforese prøvebuffer blev tilsat og prøver blev underkastet SDS-PAGE som beskrevet for Westerns, uden forudgående kogning til yderligere at sikre, at IgG forblev intakt. Den vestlige blev behandlet som beskrevet ovenfor, undtagen at Clean-Blot IP påvisningsreagens (Thermo Scientific) blev anvendt til at påvise det primære antistof. Salg

ELISA-analyse

serin 506-phosphorylerede og ikke-phosphorylerede former af 21-aminosyre-topo i peptid beskrevet ovenfor (se Antibodies afsnit) blev syntetiseret af Biopeptide Co., Inc. (San Diego, CA). Immulon H2B ELISA-plader (Thermo Scientific) blev overtrukket natten over ved 4 ° C med 100 pi peptider resuspenderet ved 2 ug /ml i coating puffer (50 mM NaHCO

3, pH 9). Pladerne blev vasket med vaskebuffer (Tris-bufret saltvand [TBS], pH 7,5, 0,5% Tween) og blokeret med TBS indeholdende 1% bovint serumalbumin (BSA). Plader blev vasket en gang med vaskebuffer og derefter inkuberet i 1 time med seriefortyndinger (i duplikat) af pAb506P i TBS /1% BSA, vasket igen og inkuberet i 1 time med gede-anti-kanin-HRP. Efter endnu en vask trin blev pladerne inkuberet med HRP-substrat 3,3 ‘, 5,5’-tetramethylbenzidin (1-trins SLOW TMB ELISA, Thermo Scientific) ifølge producentens instruktioner. Absorbans ved 450 nM blev aflæst.

alkalisk phosphatase behandling

300 ug cellelysat fremstillet i RIPA-puffer i fravær af phosphataseinhibitorer blev behandlet i 1 time ved 37 ° C med 300 enheder kalv intestinal alkalisk phosphatase (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO) i puffer indstillet til 0,1 M NaCl, 0,01 M MgCl

2, 0,001 M DTT som foreslået af producenten. En parallel kontrol lysat fremstillet i nærvær af phosphataseinhibitorer blev inkuberet i buffer mangler alkalisk fosfatase.

statistiske analyser

Statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad® Prism-software (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA).

Resultater

Karakteristik af pAb506P

kanin polyklonale IgG, pAb506P, hævet til en PS506-holdigt peptid unik for topo jeg har været tidligere vist at genkende 90 KDa cellulære topo i i cancer-afledte cellelinjer samt PS506-holdige form af rekombinant topo behandlet med protein kinase CK2 [1]. Antiserummet er yderst specifik for den phosphorylerede form af det immuniserende peptid, som vist ved de komparative titreringskurver i peptid ELISA-analyser (fig 1A). Yderligere mere fremtrædende pAb506P-reaktive arter migrerer ved ca. 45 kDa på SDS-PAGE /Westerns er også til stede (fig 1B, bane 1, pile angiver positionerne af 45 kDa arter og fuld længde topo I i H358 NSCLC cellelysater). En topo I-arter af lignende størrelse er blevet rapporteret i Jurkat leukæmiceller [26]. 45 kDa arter vises som en mindre bånd på blots probet med et gede-anti-topo I (Fig 1B, bane 2), og kan immunpræcipiteret fra H358 cellelysater med gede-anti-topo I (Fig 1C), hvilket indikerer, at den deler immunreaktivitet med fuld længde topo i, men vil sandsynligvis være en mindre art. Den svagere reaktivitet fuld længde topo I med pAb506P kan indikere, at det ikke er helt phosphoryleret på dette site. pAb506P reaktivitet reduceres følgende behandling af H358 cellelysater med alkalisk phosphatase, hvilket bekræfter, at det repræsenterer en phosphoryleret art (Fig 1D). Både fuld-længde topo I og 45 kDa PS506-positive arter selektivt nedreguleres efter behandling med camptothecin (CPT), under betingelser, hvor tubulin kontrol forbliver uændret, hvilket indikerer, at fuld længde topo I og 45 kDa arter er reguleret på samme måde i respons på CPT (fig 1E). Topo I er den unikke mål af CPT, og har tidligere vist sig at være specifikt nedreguleret i CPT-behandlede celler [27]. Taget sammen antyder resultaterne, at 45 kDa arter er sandsynligvis en phosphoryleret nedbrydningsprodukt af topo I. Fordi det er den primære arter påvist i cellelysater, afprøvede vi dens ekspression i vævsprøver.

(A ) Sammenlignende titreringskurver af pAb506P på ELISA-plader overtrukket med et topo i peptid omgiver serin 506 stedet enten i sin phosphoryleret eller ikke-phosphorylerede form. (B) Western-analyser af H358 cellelysater (100 ug /lane) probet med pAb506P (bane 1) eller med gede-anti-topo I (bane 2). Pile viser positionerne for 45 kDa arter og fuld længde topo I. (C) Topo I immunpræcipitering (gede-anti-topo I C-terminus) efterfulgt af pAb506P Western of H358 cellelysater. Lane repræsenterer 200 ug udgangsmateriale. (D) Western-analyse af PS506 og actin i H358 cellelysater før (CNTR) og efter behandling med alkalisk phosphatase (AP). (E) Western-analyse af PS506 (under anvendelse pAb506P), fuld længde topo I (under anvendelse af gede-anti-topo I) og tubulin i H358 celler før og efter en 24 timers behandling af cellerne med 0,1 eller 1 uM CPT.

PS506 udtryk i ondartet, godartede, og normal lungevæv

pAb506P blev brugt til skærmen PS506 udtryk i anonyme eksemplarer af ikke-småcellet lunge tumorer (carcinomer, adenomer) og ikke-maligne lungevæv ( som parrede prøver fra den samme patient), samt benigne lungetumorer. Prøver blev opnået fra den vestlige Division i Cooperative humant væv Network (CHTN) og er opført med deres beskrivelser i (S1 Table Karakteristik af tumor /ikke-tumor par (leveres af CHTN).. S2 Tabel Karakteristik af godartede tumorer (forudsat af CHTN)). Vævshomogenater fremstillet ud fra den parrede ikke-småcellet lungetumor og ikke-malign lungevæv, og benigne lung tumorprøver blev analyseret ved SDS-PAGE /Western for tilstedeværelsen af ​​PS506, og niveauerne blev kvantificeret ved digital analyse af båndintensiteter. For at sikre standardisering på tværs af forskellige geler, vi udarbejdet en enkelt lysat af H358 celler, som blev frosset i portioner. En frisk optøet alikvot af denne lysat blev indbefattet i hver gel køre som en referencestandard.

Fig 2A viser et repræsentativt Western blot for PS506 i matchede maligne /non-maligne specimen parrene 8-13, sammen med H358 referencestandard. PS506 niveauer i forhold til H358 blev ligeledes vurderet for alle 21 matchede par plus 8 godartede tumorer, og resultaterne blev bekræftet i et andet uafhængigt forsøg. Gennemsnittene og standardafvigelserne for de to forsøg er anført i tabel 1 (matchede par) og tabel 2 (godartede tumorer) og afbildet i fig 2B. I alle 21 maligne /non-maligne eksemplar par blev PS506 udtryk forhøjet i de maligne eksemplar. Seksten af ​​de 21 (76%) maligne prøver udtrykt bekymring 2-6 gange mere PS506 end gjorde ikke-maligne parrede eksemplar, med den gennemsnitlige væsen ~ 3 gange højere. Femten af ​​de 21 (71%) maligne prøver udtrykt PS506 på niveauer over det samlede gennemsnit på 0,39 for alle prøver (rød stiplet linie i fig 2B). Vigtigt er det, at ingen af ​​de 8 godartede prøver og kun 2 af de 21 parrede ikke-maligne prøver (i alt 2/29 [7%]) udtrykt PS506 over dette gennemsnit niveau. Således er en ondartet eksemplar var . 10 gange mere sandsynligt end en ikke-maligne eksemplar til at udtrykke PS506 større end gennemsnittet for alle prøver

(A) Repræsentant PS506 Western blot af enheder af NSCLC og deres parrede ikke-maligne prøver (specimen par 8-13). H358 er referencen kontrol for kvantificering af alle PS506 blotting. Tabel 1 og 2 liste prøverne analyseret og kvantificering af PS506 niveauer i forhold til H358. (B) Bar graf af PS506 niveauer vist i tabel 1 og 2, grupperet som parrede maligne /non-maligne prøver og godartede tumorer. (C) Scatter plot af PS506 niveauer fra tabel 1 og 2, grupperet som ondartede (M), ikke-maligne (N) og godartede (B) tumorer. De p-værdier blev beregnet ved en uparret t-test Vejviser

Scatter plot i figur 2C viser PS506 niveauer i de tre sæt prøver:. 21 parrede ondartet (M) og ikke-maligne (N) væv og de 8 benigne tumorvæv (B). De gennemsnitlige PS506 niveauer (angivet med sorte streger i hvert sæt) er 0,60 (maligne), 0,24 (non-malign parret), og 0,24 (godartet). Forskelle i gennemsnitlige PS506 niveauer mellem prøvesæt blev evalueret ved en uparret, to-halet t-test. Som angivet i fig 2C, forskellen mellem malignt væv og ikke-maligne parrede væv var stærkt signifikant (

s Restaurant 0,0001), og forskellen mellem malignt væv og godartet tumorvæv var signifikant (

s

= 0,0115). Ingen signifikant forskel blev observeret mellem PS506 niveauer i godartede og ikke-maligne væv (

s

= 0,86). Disse resultater indikerer, at PS506 ekspression er stærkt associeret med malignitet.

PS506 ekspression og CPT følsomhed

I en tidligere undersøgelse af, PS506 niveauer i en række forskellige cancercellelinier, fandt vi, at den højeste PS506 niveauer var til stede i cellelinier med den største følsomhed over for topo i-målrettede plante alkaloid, CPT, med forskelle på omkring 2-3 gange mellem CPT-følsomme og resistente cellelinier [1]. For at udvide disse observationer, vi evaluerede relative PS506 niveauer blandt NCI 60-cellelinje panel, til rådighed som frosne cellepellets fra afdelingen for kræftbehandling og diagnose Tumor repository af NCI. Panelet omfatter cellelinier afledt fra en række forskellige tumortyper, herunder leukæmi, ikke-småcellet lungecancer, coloncancer, melanom, ovariecancer, renal carcinoma, prostatacancer, brystcancer og centralnervesystemet kræftformer. Fordi cellelinjer er blevet grundigt karakteriseret af NCI for følsomhed for CPT og andre eksperimentelle og etablerede kemoterapeutiske stoffer, giver de en meget standardiseret ressource med til at korrelere en potentiel biomarkør med kemosensitivitet [28].

Cellelysater fra de frosne cellepellets blev bedømt for PS506 ekspression ved SDS-PAGE /Western på samme måde som vævsprøverne. Bånd blev kvantificeret digitalt og PS506 niveauer i forhold til H358 kontrol værdien blev kontrolleret i en anden uafhængig eksperiment og gennemsnit. For de 42 cellelinier for hvilke der forelå CPT følsomhed data, fandt vi, at PS506 niveauer blev fordelt over et bredt område, som blev observeret for de tumor vævsprøver. Det gennemsnitlige niveau af PS506 i alle 42 cellelinjer var 0,37 i forhold til H358 fælles kontrol; en værdi væsentligt højere end den gennemsnitlige værdi af 0,24 observeret for ikke-malign parrede væv eller benigne tumorer (figur 2). Vi næste sammenlignet de relative PS506 værdier af de 42 cellelinjer med deres følsomhed over for CPT hjælp af NCI /Developmental Therapeutics Program (DTP)% vækst værdierne med en enkelt høj dosis (10 uM) CPT assay [29]. I dette assay en negativ procentvise vækst værdi indikerer tab af udgangsmateriale cellemasse grund celledød, hvorimod en positiv værdi angiver den procentdel af ubehandlede cellevækst, som beskrevet på DTP websted [28].

Vi observerede en korrelation mellem PS506 ekspression og CPT følsomhed i en gruppering af 20 ikke-småcellet lunge-, colon-, og æggestokkræft cellelinier, der repræsenterer tre cancere for hvilke CPT-baserede terapier er enten FDA-godkendt (colon, ovarie) eller er under evaluering i igangværende kliniske forsøg (ikke-småcellet lungekræft) [30, 31]. Tabel 3 angiver disse cellelinjer, det gennemsnitlige PS506 niveauet fra de to forsøg (i forhold til H358 celler), og CPT følsomhed data om NCI /DTP hjemmeside [28]. Figur 3 viser et scatter plot af de relative PS506 værdier for de tre undergrupper defineret ved deres CPT følsomhed: de 8 mest følsomme (40%), de 8 mest modstandsdygtige (40%), og de resterende 4 med mellemliggende følsomhed (20%) . Det relative PS506 niveau faldt efter CPT følsomhed fra 0,39 (mest følsomme) til 0,21 (mellemliggende følsomhed) til 0,18 (resistente). En uparret, to-halet t-test viste en signifikant forskel (

s =

0,028) i det gennemsnitlige PS506 plan mellem den mest følsomme og de mest resistente cellelinier, i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelser med et mindre udsnit af cellelinier [1]. Disse data tyder på, at for lunge-, tyktarms-, og ovariecancere, ekspression af PS506 er en determinant for følsomhed over for CPT-baserede lægemidler. Vigtigere, halvdelen af ​​cellelinierne betegnet som CPT følsom-men ingen af ​​dem med mellemliggende CPT følsomhed eller CPT resistens-udtrykte PS506 på et niveau, som overstiger gennemsnittet af 0,37 for alle 42 cellelinjer.

Scatter plot af relativ PS506 niveauer i cellelinier, der repræsenterer de 40% mest CPT følsomme, idet 40% mest CPT resistente, og 20% ​​med mellemliggende følsomhed blandt sættet af ovariecancer, coloncancer, og NSCLC cellelinier. Den røde stiplede linje på 0,37 viser det gennemsnitlige PS506 niveau i cellelinjer, som der gives CPT følsomhed data. Den p-værdi blev beregnet ved en uparret t-test

Vi har også sammenlignet PS506 niveauer med CPT følsomhed for den større gruppe af 42 cellelinjer, der repræsenterer en bredere vifte af cancertyper (se.: S3 Table. CPT følsomhed og PS506 niveauer i cellelinjer fra NCI 60 cellelinje panel). Også her observerede vi en positiv sammenhæng mellem PS506 niveauer og CPT følsomhed, med de mest resistente cellelinier, der udtrykker lave PS506 niveauer (40% af linjer, betyder PS506 niveau = 0,34), og de mest følsomme cellelinier, som udtrykker højere PS506 niveauer (40 % af linjer, betyder PS506 niveau = 0,41), i overensstemmelse med en model, hvor PS506 bidrager til cpt følsomhed. I analysen af ​​denne større gruppe, har forskellene i middelværdier ikke statistisk signifikans, men (

s

= 0,43), muligvis på grund af det bidrag, cellulære faktorer uafhængige af topo I, såsom CPT optagelse, intracellulær CPT metabolisme og fordeling, og det cellulære respons på DNA beskadigelse, som alle kan påvirke resultatet af CPT behandlinger [32]. Alligevel er resultaterne af denne screening støtter tanken om, at PS506-niveauer kan anvendes til selektion terapi for visse kræftformer.

Discussion

Denne undersøgelse viser, at ekspression af PS506 er malignitet-specifik, og at de højeste niveauer af PS506 udtryk i kræft cellelinier af lunge, tyktarm, og kræft i æggestokkene oprindelse korrelerer med øget følsomhed over for CPT. PS506 niveauer blev forhøjet i alle 21 maligne enheder af ikke-småcellet lungekræft sammenlignet med parrede ikke-malignt væv og til 8 benigne lunge tumorprøver. I de fleste model parvis stigningen i PS506 ekspression i maligne versus ikke-malignt væv varierede fra 2-fold til 6-fold. De to ikke-maligne grupper af enheder (21 non-maligne væv og 8 godartede tumorvæv), var ikke signifikant forskellig i PS506 ekspression. Mens de absolutte niveauer af PS506 udtryk i maligne tumor prøver var variabel, 71% af maligne tumorer viste PS506 niveauer over gennemsnittet i befolkningen (alle prøver kombineret, dvs. maligne + non-maligne), mens kun 7% af ikke-maligne prøver udtrykt PS506 over gennemsnittet i befolkningen.

Når vi evaluerede NCI-60 cellelinje panel, vi fandt også, at det gennemsnitlige PS506 ekspressionsniveauet tværs af cellelinjer var højere end deres indhold af ikke-maligne vævsprøver (0,37 i cellelinier versus 0,24 i ikke-maligne prøver). Vi analyserede sammenhængen mellem PS506 udtryk med cellulære følsomhed over for topo I-målrettet drug CPT, hjælp CPT følsomhed data om NCI /DTP hjemmeside. I lunge, tyktarm, og æggestokkene kræft cellelinjer, der repræsenterer tre kræftformer for hvilke CPT-afledte kemoterapeutiske lægemidler er godkendt eller er under klinisk afprøvning, fandt vi, at de 40% mest CPT-følsomme cellelinjer udtrykte betydeligt højere niveauer af PS506 end gjorde 40% mest resistente cellelinier, i overensstemmelse med vores tidligere observationer i en mindre prøveudtagning af tilgængelige cellelinier [1]. Intermediate niveauer af PS506 udtryk blev observeret i 20% af cellelinier med mellemliggende CPT følsomhed. Disse resultater antyder, PS506 kan tjene i kombination med andre kliniske faktorer, for at lette beslutningsprocessen til behandling af patienter med CPT-afledte lægemidler, irinotecan og topotecan. Det korrekte valg af lægemiddel er afgørende for en vellykket terapi. Dette gælder især for anden linje terapi, som en mislykket behandling kan resultere i en faldende fysiske tilstand af patienten og forøger sandsynligheden for, at yderligere behandlinger vil være forgæves. Der er i øjeblikket ingen pålidelige prædiktive tests for følsomhed over for CPT-afledte lægemidler. Anvendelsen af ​​PS506 som en hjælp til valg terapi ville være et afgørende skridt i retning af at opnå mere individualiserede behandlingsregimer.

Udviklingen af ​​blod assays for PS506 kan potentielt give en diagnostisk analyse til tidlig opdagelse eller overvågning af lunge cancer eller andre cancere. Flere cirkulerende proteinmarkører øjeblikket i klinisk brug for visse kræftformer, primært til opfølgning. Disse omfatter CA125 for kræft i æggestokkene, CA19-9 for kræft i bugspytkirtlen, CEA for tyktarmskræft, og PSA for prostatakræft (revideret i [33]). CYFRA21-1, en cytokeratin markør for epitelceller i plasma eller blod, er blevet forbundet med ikke-småcellet lungekræft og andre epiteliale cancere, men har stærkt varierende følsomhed eller specificitet for malignitet. En nylig rapport beskriver en ELISA-assay for thymidinkinase i blodprøver til påvisning lungekræft, [34]. Eftersom topo jeg er en af ​​de 10-25% mest udbredte af cellulære proteiner i celler og i plasma [35], en lignende test for PS506 sandsynligvis være gennemførlig og følsom. I tilfælde af lungecancer, kan en sputum-baseret assay også være muligt, da cancerceller er til stede i sputum fra patienter med lungecancer. Flere andre kandidatlande markører er blevet identificeret [36, 37]. Men ingen biomarkør er endnu ikke vist, at have den nødvendige følsomhed, specificitet og reproducerbarhed skal valideres til rutinemæssig klinisk brug, og der er behov for yderligere biomarkører.

Den mulighed, at PS506 kan kausalt forbundet med kræft øger sin interesse som biomarkør. Fordi topo jeg besidder DNA nicking /religering aktivitet, sin stramme regulering er afgørende for at undgå afvigende DNA nicking der kunne destabilisere genomet og fremme ondartet progression [38]. Ektopisk overudtrykt topo I er rekombinogene i gær og bakterier og kan derfor fremme DNA omlejringer og andre former for genom ustabilitet i mammale celler såvel [39, 40]. Denne mulighed understøttes af beviser for, at topo jeg er afgørende for kromosombrud ved fælles skrøbelige steder (CFSs), hvor DNA-rearrangementer almindeligt forekommende i kræft [41, 42]. En velkarakteriserede CFS, FRA3B, ofte omarrangeret i lungekræft [43].