PLoS ONE: prognostiske værdi af FDG PET Imaging i patienter med larynx Cancer

Abstrakt

Baggrund og formål

For at undersøge den prognostiske værdi af

18F-fluorodeoxyglukose positronemissionstomografi (FDG -kæledyr) hos patienter med larynx cancer.

Materialer og metoder

undersøgelsen omfattede 51 patienter, hvoraf 30 gennemgik endelig strålebehandling med eller uden kemoterapi og 21 undergik radikale indgreb med eller uden adjuverende chemoradiation terapi . FDG-optagelse af både den primære læsion og halsen node blev målt under anvendelse af det maksimale standardiserede optagelse værdi (SUVmax). Virkningerne af klinisk-patologiske faktorer, herunder primær tumor SUVmax og nodal SUVmax på progressionsfri overlevelse, lokal kontrol, nodal progressionsfri overlevelse, og fjernmetastaser overlevelse blev vurderet ved hjælp af log-rank test og Cox metode.

Resultater

median opfølgning var 48,6 måneder (interval 8 til 82,1 måneder). Univariate analyse viste, at nodal SUVmax blev N-status, og tumor TNM stadie signifikant associeret med tilbagefald, mens primær tumor SUVmax, alder, behandling strategi og T-status ikke var. Multivariat analyse viste, at kun det nodal SUVmax var en signifikant negativ faktor for progressionsfri overlevelse (p = 0,029, hazard ratio 0,54, 95% CI 0,38-0,87) og nodal progressionsfri overlevelse (p = 0,023, hazard ratio 0,51, 95 % CI 0,34-0,81). ROC kurve analyse og log-rank test viste, at patienter med en høj knudepunkt SUVmax (≧ 4) havde en signifikant lavere progressionsfri overlevelse sats end dem med en lav SUVmax ( 4; p 0,0001).

konklusioner

forbehandlingen SUVmax af nodal sygdom hos patienter med larynx cancer er prognostisk for tilbagefald

Henvisning:. Kitajima K, Suenaga Y, Kanda T, Miyawaki D, Yoshida K, Ejima Y, et al. (2014) prognostiske værdi af FDG PET Imaging i patienter med larynxcancer. PLoS ONE 9 (5): e96999. doi: 10,1371 /journal.pone.0096999

Redaktør: Juri G. Gelovani, Wayne State University, USA

Modtaget: December 24, 2013; Accepteret: 14. april, 2014 Udgivet: 12 maj, 2014

Copyright: © 2014 Kitajima et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Forskellige behandlingsstrategier bruges til at forbedre resultatet i patienter. med pladecellecarcinom i hoved og hals. Valg af passende strategier og prognosticering behandling forbliver vanskeligt for klinikere, trods omhyggelig evaluering af kliniske faktorer, TNM mellemstationer, og anatomisk underordnede websted. Identifikation af nye forbehandling imaging biomarkører, der potentielt ville forudsige langsigtede resultat ville være klinisk signifikant.

Med brugen af ​​

18F-fluorodeoxyglukose (FDG), en glukose analog, positronemissionstomografi (PET) giver ikke-invasiv vurdering af glucosemetabolisme i en lang række forskellige tumortyper, herunder hoved- og halscancer. Tumor FDG-optagelse er blevet forbundet med forskellige cellulære egenskaber såsom cellelevedygtighed og proliferation aktivitet [1], [2]. Således analyser af metaboliske parametre, som er uafhængige af morfologiske forandringer, forventes at tilbyde en vigtig mulighed for at forudsige individuelle tumor adfærd.

Selv om flere undersøgelser har vist, at metabolisk aktivitet tydeligt FDG-PET i patienter med forskellige af hoved og hals kræft undertyper (dvs. nasopharynx, oropharynx, hypopharynx, strubehoved, oral tunge, gummi, mundslimhinden, mund sal) har prognostisk betydning [3], [4], den prognostiske værdi af FDG-PET for pladecellekræft hoved- og halscancer stadig kontroversielt. Desuden er der ingen oplysninger om den prognostiske værdi af FDG-PET kun larynxcancer, og det er stadig uvist, om FDG-PET i patienter med larynx cancer faktisk giver prognostisk information. Vi udførte en retrospektiv gennemgang af 51 patienter med larynx cancer, som gennemgik FDG-PET ved første præsentation at afgøre, om FDG optagelse af den primære tumor og hals lymfeknuder er korreleret med recidiv.

Materialer og Metoder

Patient

Skriftlig forudgående informeret samtykke til at undergå FDG-PET billedbehandling og modtage behandlinger blev opnået fra alle patienter. Den institutionelle Review Board (Kobe Universitetshospital, Japan) godkendte denne retrospektive undersøgelse (nr 1401); patient informeret samtykke til optagelse i denne undersøgelse blev frafaldes. For at beskytte patientens privatliv, vi fjernet alle identifikatorer fra vores poster ved afslutningen af ​​vores analyser. Vores primære kriterier for patienter udvælgelse inkluderet dem, der gennemgik FDG-PET scanning som en forbehandling iscenesættelse undersøgelse på vores institution inden for 2 uger før behandling for biopsi bevist planocellulært larynx karcinom, mellem oktober 2006 og september 2011. På grundlag af disse primære kriterier, 60 patienter konsekutive blev udvalgt. Af disse blev 9 udelukket på grund af (a) en opfølgende varighed på mindre end 6 måneder (n = 6), og (b) tilstedeværelsen af ​​fjernmetastaser (n = 3). I alt 51 patienter (46 hanner, 5 hunner, gennemsnitsalder på diagnose 69,1 år, interval 56-86 år). Opfylder kriterierne for denne undersøgelse støtteberettigelse blev inkluderet i analysen

Forbehandling systematiske evalueringer blev udført sammen med en rutinemæssig fysisk undersøgelse, laryngoskopi og væv biopsi, serum kemi, bryst radiografi, kontrast-forstærket CT eller MR-scanning af hoved og hals, og FDG-PET scanning. Kliniske mellemstationer og behandling valg blev besluttet ved hjælp af oplysninger, der stammer fra disse undersøgelser ved hoved- og halscancer Board konference Kobe University Hospital, som bestod af hoved og hals kirurger, stråling onkologer, medicinske onkologer og radiologer.

Klinisk vurdering af prognostiske faktorer blev udført med tilbagevirkende kraft i alle 51 patienter med larynx cancer, i en undergruppe af 30 patienter, som gennemgik endelig strålebehandling (RT) med eller uden kemoterapi (RT-gruppen), og i en undergruppe af 21 patienter, som gennemgik radikale kirurgi og hals dissektion med eller uden adjuvans chemoradiation terapi (kirurgi gruppe). Efterfølgende opfølgning omfattede fysisk undersøgelse, laryngoskopi, kontrast-forstærket CT, og FDG-PET.

FDG-PET-studie

Alle hele kroppen FDG-PET scanninger blev erhvervet med en PET-scanner (Philips Allegro, Philips Medical System, Best, Holland), der leveres 45 trans-aksiale billeder med 4-mm-intervaller over en afstand på 18,0 cm. Efter mindst 6 timers faste, patienter fik en intravenøs injektion af 222 til 333 MBq (6 til 9 mCi) af FDG. Efter positionering af patienten, blev en statisk emission scanning udført med 2,5 til 3 minutter af opkøb i hver seng position, dækker overlåret til øret med i alt 9-10 bed positioner. Derefter blev en transmission scanning ved hjælp af en

137Cs ring udført over det samme område i 23 s pr seng position. Tre-dimensionel erhvervelse blev udført og PET billeder blev rekonstrueret ved hjælp en ordnet-delmængde forventning maksimering iterativ rekonstruktion algoritme (Ramla). Synsfeltet og pixelstørrelsen af ​​de rekonstruerede billeder var 57,6 cm og 4,0 mm, henholdsvis med en matrix størrelse på 128 × 128.

Efter FDG-PET-scanning var afsluttet, patienterne blev flyttet til CT værelse. CT-enhed var en multi-detektor rækken CT system med en accelerationsspænding på 120 kVp og en strøm på 80 mA. Både rekonstruerede PET og CT-data blev overført til en arbejdsstation, der kører visning-dedikeret software (Syntegra, SUN Microsystems, Milpitas, CA, USA) for at skabe smeltet PET og CT-billeder

Billedanalyse

. PET billeder blev efterfølgende fortolket af to erfarne nuklearmedicinske læger. For semikvantitativ analyse af FDG optagelse blev regioner af interesse (ROIs) defineret på target læsioner (primær læsion og hals lymfeknude) på de transaksiale PET billeder. Den maksimale standardiserede optagelse værdi (SUV) blev beregnet til kvantitativ analyse af tumor FDG optagelse, som følger:. Hvor C er vævet aktivitet koncentration målt ved PET og ID er den injicerede dosis

For nodal sygdom, den højeste SUVmax blev anvendt til efterfølgende korrelation med kliniske resultater.

Statistisk analyse

Den aktuarmæssige progressionsfri overlevelse (PFS), lokal styring (LC), nodal progressionsfri overlevelse (NPFS), og fjerntliggende metastase overlevelse (DMFS) blev beregnet under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden. Varigheden blev beregnet ud fra den oprindelige dato for behandling til datoen for en begivenhed eller den sidste opfølgende besøg. PFS blev defineret som fravær af dødsfald på grund af enhver årsag eller fornyet. LC blev defineret som kun primær site kontrol. NPFS blev defineret som enhver regional nodal svigt efter behandling som en begivenhed. DMFS blev defineret som mangel af fjernmetastaser.

Overlevelsesdata blev analyseret ved hjælp af Kaplan-Meier plots og log-rank test. Den prognostiske værdi af de enkelte variabler blev evalueret ved hjælp af Cox proportional hazard logistisk regression. Vi bestemmes statistisk signifikant SUV cutoff værdi for overlevelse analyse ved hjælp af log-rank test og modtager opererer karakteristik (ROC) kurve analyse.

univariate Cox proportionel risiko modellering blev anvendt til at kvantificere risikoen for gentagelse af de følgende variabler : alder, behandlingsstrategi, T-status, N-status, tumor TNM stadie, primær tumor SUVmax, og nodal SUVmax. Efterfølgende de betydelige eller borderline univariate variable (p 0,1) blev indgået multivariat analyse. Resultaterne fra Cox modeller blev udtrykt som hazard ratio med 95% konfidensintervaller og p-værdier på lt; 0,05 blev anset for at indikere statistisk signifikans. Alle analyser blev udført ved hjælp af SAS-software-version 9.2 (SAS Institute, Cary, NC).

Resultater

Patient karakteristika

Patientdemografi og clinicopathologic variable demonstreret i tabel 1. med hensyn til fordelingen af ​​TNM stadier i de 51 patienter, otte var på trin i, 17 var på trin II, 12 var i stadium III, og 14 var på trin IV.

i RT gruppe (n = 30), 20 patienter modtog kun RT ved doser 66,0 til 74,4 Gy og 10 modtog RT (66,0-73,2 Gy) samtidig med kemoterapi, almindeligvis to eller tre cykler af cisplatin med eller uden kontinuert infusion af 5-fluoruracil og /eller docetaxel. I kirurgi (n = 21), alle patienter undergik radikal kirurgi med hals dissektion. Desuden fire modtog adjuverende chemoradiation terapi og en fik strålebehandling.

Prognostiske faktorer i patienter samlede

Efter en median opfølgning på 48,6 måneder for de patienter, samlet, 11 (21,6%) af de 51 patienter havde tilbagefald. Blandt disse 11 patienter, fire udviklede lokalt recidiv, to hals nodal tilbagefald, og fem lunge metastase. Den mediane samlede opfølgning varighed var 53,5 måneder (interval 17,6 til 82,1 måneder) for de 40 patienter uden tilbagefald, og 21,3 måneder (interval 8,0 til 43,4 måneder) for de 11 patienter med recidiv ved follow-up.

Den mediane primære tumor SUVmax var 4,25 (interval 1,2 til 16,65). Brug bedste diskriminerende cut-off for den primære tumor SUVmax (4.6) til at etablere to grupper baseret på ROC kurve analyse, den høje SUVmax (≧ 4.6) undergruppe viste en kortere median PFS tid end den lave SUVmax ( 4,6) undergruppe, men forskellen nåede ikke statistisk signifikans (42,7 vs. 57,3 måneder; p = 0,66) (figur 1). De 4-årige PFS satser var 44,0% mod 53,8%, hhv. Medianen nodal SUVmax var 1,75 (interval 0,8 til 14,76). Brug den bedste cut-off for nodal SUVmax (4.0) baseret på ROC kurve analyse, den høje SUVmax (≧ 4.0) undergruppe viste en signifikant kortere median PFS tid end den lave SUVmax ( 4,0) undergruppe (30,4 vs. 52,2 måneder ; p 0,0001) (fig 2). De 4-årige PFS satser var 22,2% mod 54,8%, hhv. Univariate analyse viste, at nodal SUVmax (p 0,0001), N status (p = 0,0099, figur 3), og tumor TNM fase (p = 0,015, figur 4) var signifikant relateret til PFS, hvorimod primær tumor SUVmax (p = 0,66) , alder (p = 0,11), behandlingsstrategi (p = 0,71), og T-status (p = 0,53) var ikke (tabel 2). Multivariat analyse viste, at kun nodal SUVmax (risikoforhold 0,54, 95% konfidensinterval [CI] 0,38-0,87, p = 0,029) var en uafhængig prædiktor for PFS. Vejviser

Som vist i tabel 2, ikke er faktorer fandtes at påvirke LC. Nodal SUVmax, N-status, og tumor TNM stadie var signifikant relateret til NPFS og DMFS, mens primær tumor SUVmax, alder, behandling strategi, og T-status ikke var. Multivariat analyse viste, at kun nodal SUVmax (risikoforhold 0,51, 95% CI 0,34-0,81, p = 0,023) var en uafhængig prædiktor for NPFS.

Prognostiske faktorer i RT-gruppen

Seks ( 20,0%) af de 30 RT patienterne lidt gentagelse: lokalt recidiv i tre, hals nodal gentagelse i en, og lunge metastase i to. Den mediane samlede opfølgning varighed var 53,5 måneder (interval 17,6 til 82,1 måneder) i de 24 patienter uden tilbagefald, og 25,0 måneder (interval 8,0 til 43,4 måneder) i de seks patienter med tilbagefald ved opfølgning.

de mediane SUVmax værdier for den primære tumor og hals knuder var 2,85 (interval 1,2 til 8,52) og 1,45 (interval 0,8 til 9,29), hhv. Ved hjælp af en bedste diskriminerende SUVmax cut-off på 4,0 for den primære tumor, den høje SUV (≧ 4.0) undergruppe viste en kortere median PFS tid end den lave SUV ( 4,0) undergruppe, men forskellen nåede ikke statistisk signifikans (38,6 vs. 57,3 måneder, p = 0,63). De 4-årige PFS satser var 37,5% mod 54,5%, hhv. Ved hjælp af en bedste cut-off nodal SUVmax værdi på 4,0, den høje SUVmax (≧ 4.0) undergruppe viste en signifikant kortere median PFS tid end den lave SUVmax ( 4,0) undergruppe (19,2 vs. 50,9 måneder; p 0,0001). De 4-årige PFS satser var 0% versus 53,6%, hhv. Univariate analyse viste, at nodal SUVmax (p 0,0001), N-status (p = 0,018), og tumor TNM stadie ( 0,0001) signifikant var relateret til PFS, mens primær tumor SUVmax (p = 0,63), alder (p = 0,31 ), og T-status (p = 0,12) var ikke (tabel 3). Multivariat analyse afslørede ingen faktorer, der blev relateret til PFS.

Som vist i tabel 3, at ingen af ​​de undersøgte faktorer påvirket LC. Nodal SUVmax, N-status, og tumor TNM stadie var signifikant relateret til NPFS og DMFS, mens primær tumor SUVmax, alder, behandling strategi, og T-status ikke var. Multivariat analyse viste, at kun nodal SUVmax (risikoforhold 0,48, 95% konfidensinterval [CI] 0,32 til 0,78, p = 0,018) var en uafhængig prædiktor for NPFS.

prognostiske faktorer i kirurgi gruppen

Fem (23,8%) af de 21 kirurgi patienter lidt gentagelse: lokalt recidiv i en, hals nodal tilbagevenden i en, og lunge metastase i tre. Den mediane samlede opfølgning varighed var 55,4 måneder (interval 29,6 til 80,8 måneder) i de 16 patienter uden tilbagefald, og 14,2 måneder (interval 11,5 til 31,3 måneder) i de fem patienter med tilbagefald ved opfølgning.

de mediane SUVmax værdier for den primære tumor og hals knuder var 8,6 (interval 3,6 til 16,65) og 2,0 (interval 1,0 til 14,76), hhv. Ved hjælp af en bedste diskriminerende SUVmax cut-off på 9,8 for den primære tumor, den høje SUVmax (≧ 9.8) undergruppe viste en kortere PFS tid end den lave SUVmax ( 9,8) undergruppe, men forskellen nåede ikke statistisk signifikans (42,7 vs . 47,3 måneder; p = 0,50). De 4-årige PFS satser var 50,0% mod 46,7%, hhv. Ved hjælp af en bedste nodal SUVmax afskæring på 4,0, den høje SUVmax (≧ 4,0) undergruppe viste en signifikant kortere median PFS tid end den lave SUVmax ( 4,0) undergruppe (30,7 vs. 60,5 måneder, p = 0,013). De 4-årige PFS satser var 28,6% mod 57,1%, hhv. Univariate analyse viste, at kun nodal UVmax (p = 0,013) havde en signifikant sammenhæng med PFS, hvorimod primær tumor SUVmax (p = 0,50), alder (p = 0,17), T-status (p = 0,56) N status (p = 0,12) og tumor TNM fase (p = 0,29) ikke (tabel 4). Multivariat analyse viste, at ingen af ​​de undersøgte faktorer påvirkede PFS.

Som vist i tabel 4, blev ingen af ​​de undersøgte faktorer relateret til LC. Nodal SUVmax og N-status var signifikant relateret til DMFS, mens primær tumor SUVmax, alder, T status og tumor TNM stadie ikke var. Multivariat analyse viste, at ingen af ​​disse faktorer var relateret til DMFS.

Diskussion

Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse for at have vurderet den kliniske anvendelighed af FDG-PET for at give prognostisk information om patienter med kun planocellulært larynx carcinoma. Selv om flere undersøgelser har vist, at metabolisk aktivitet tydeligt på FDG-PET har prognostisk betydning for patienter med en række forskellige hoved- og halscancer undertyper (dvs. nasopharynx, oropharynx, hypopharynx, strubehoved, mundhule) [3], [4], de forskellige primær tumor byrde kan variere, hvilket påvirker FDG optagelse, behandling respons og overlevelse, som alle kan forårsage potentielle bias.

i vores serie, nodal SUVmax snarere end den primære tumor, var signifikant associeret med PFS og NPFS. En tilsvarende tendens er også blevet rapporteret i tre tidligere undersøgelser [5] – [7]. Demirci et al. [5] viste, at et knudepunkt SUV over 4,45 udgjorde en større risiko for tilbagefald i 64 patienter med forskellige hoved og hals kræft, herunder de af næsesvælget (n = 29), larynx (n = 16), oropharynx (n = 13), eller hypopharynx (n = 6) behandles ved strålebehandling eller operation. Inokuchi et al. [6] rapporterede, at et knudepunkt SUV på over 6,0 udgjorde en større risiko for dårligt resultat (i form af DFS, NPFS, og DMFS) i 178 patienter med forskellige hoved og hals kræft herunder mundhulen (n = 61), nasopharynx (n = 38), oropharynx (n = 34), hypopharynx (n = 27), larynx (n = 13), eller nasal sinus (n = 5) behandlet under anvendelse chemoradiation. De viste også, at blandt patienter med en større nodal SUVmax ( 6,0), de, som gennemgik planlagt halsdissektion havde længere NPFS end i observationen eneste gruppe. Kubicek et al. [7] viste, at et knudepunkt SUV over 10,0 udgjorde en større øget risiko for fjernt fiasko i 212 patienter med forskellige hoved og hals kræft herunder oropharynx (n = 89), larynx (n = 54), mundhulen (n = 29), spytkirtel (n = 13), nasal sinus (n = 9), hypopharynx (n = 3), eller ukendt primær (n = 5) styres ved hjælp af forskellige typer af behandling. Vi foreslår, at høj FDG optagelse i hals noder er korreleret med dårligt resultat, og at sådanne patienter bør modtage mere aggressiv behandling kombinationer.

Den prognostiske værdi af primær tumor SUVmax hos patienter med hoved-halscancer er stadig kontroversiel, og mange rapporter har indikeret, at det har positive [8] eller negative [9] foreninger med resultatet. Allal et al. [8] viste, at en primær tumor SUV på over 4,76 udgjorde en større risiko for dårligt resultat i 120 patienter med forskellige hoved og hals kræft herunder oropharynx (n = 46), mundhulen (n = 32), larynx (n = 26), hypopharynx (n = 13), eller ukendt primær (n = 3), der forvaltes af strålebehandling eller kirurgi. Tang et al. [9] viste, at primær tumor SUV ikke var signifikant associeret med overlevelse i 83 patienter med forskellige hoved og hals kræft herunder oropharynx (n = 45), nasopharynx (n = 22), hypopharynx (n = 8), oral cavity (n = 4), larynx (n = 4), eller ukendt primær (n = 2), der forvaltes af strålebehandling.

som det er tilfældet for alle nye biomarkører, der er også potentielle begrænsninger og bekymringer vedrørende den udbredte anvendeligheden af ​​SUV. For eksempel er det blevet påvist, at SUV varierer med hensyn til tiden efter injektion af FDG [10]. Den nøjagtige plasmaglukose værdi kan også påvirke SUV, selv i fravær af frank hyperglykæmi /diabetes [11]. Kroppen habitus af patienten (uafhængigt af hans /hendes faktiske vægt) kan også påvirke SUV, fordi fedtvæv viser relativt lav FDG optagelse. Endelig er der en række tekniske forhold, der kan påvirke SUV, som er blevet gennemgået i en omfattende redaktionelle ved Keyes [12]. Disse faktorer omfatter inddrivelse koefficient (forholdet mellem den målte aktivitet af en ROI i forhold til sin sande aktivitet) og delvis volumen gennemsnitsberegning, som er påvirket af individuelle nuancer af hardware og software af PET-scanner, størrelse og geometri af læsionen og respiratorisk bevægelse [13].

selv om praktisk at måle og udbredt, SUVmax har en ulempe. Det er en enkelt pixel værdi, der repræsenterer den mest intense FDG-optagelse i tumoren og kan ikke repræsentere total optagelse for hele tumormasse, samt være sårbare over for statistisk støj, som kan forklare de aktuelle resultater. For nylig er volumenbaserede metaboliske parametre målt ved FDG-PET opstået som nye prognostiske faktorer. Metabolisk tumorvolumen (MTV) er defineret som mængden af ​​FDG-aktivitet i tumoren, og total læsion glycolyse (TLG) som det summerede SUV i tumoren. Desværre, i vores serie, vi var ude af stand til at måle MTV og TLG på grund af tekniske begrænsninger i PET maskine. Dette er en af ​​flere begrænsninger for vores nuværende undersøgelse.

Der var andre begrænsninger. Først var det en retrospektiv undersøgelse udføres på en enkelt institution med et relativt lille antal patienter, især i kirurgi gruppe. For det andet blev FDG-PET udføres ikke i første omgang for hver patient med larynx cancer, som kun udvalgte patienter blev henvist til PET-scanning. Brugen af ​​FDG-PET kun udvalgte patienter kunne have indført bias og påvirket resultaterne, som derfor ikke være generaliseres til alle fag. Tredje, den volumetriske analyser, f.eks MTV og TLG ikke blev iværksat på grund af PET teknologisk problem. Endelig kunne vi ikke analysere den samlede overlevelse, fordi der var kun tre sygdomsrelaterede dødsfald blandt undersøgelsespopulationen.

Konklusioner

larynxcancer patienter, der viser høj FDG optagelse i hals knuder bør overvejes ved øget risiko for dårligt resultat og kan drage fordel af mere aggressiv multimodalitet behandlingskombinationer. Disse resultater mangler at blive bekræftet i et større prospektivt og mere homogen undersøgelse.

Tak

Vi vil gerne takke Takashi Okunaga RT, Hajime Aoki RT og Kazuhiro Kubo RT (Radiologi Division, Kobe University Hospital , Kobe, Japan) og for deres fremragende teknisk bistand og generøs støtte.