PLoS ONE: Riccardin D udøver sin antitumoraktivitet ved at inducere DNA Skader i PC-3 prostatacancerceller in vitro og in Vivo

Abstrakt

Vi rapporterede for nylig, at Riccardin D (RD) var i stand til at inducere apoptose af målretning Topo II. Her fandt vi, at RD induceret standsning af cellecyklus i G2 /M-fasen i PC-3-celler, og forårsagede bemærkelsesværdig DNA-skade som påvist ved induktion af γH2AX foci, mikronuclei, og DNA-fragmentering i Comet assay. Time kinetisk og dosis-afhængige undersøgelser viste, at ATM /Chk2 og ATR /Chk1 signalveje sekventielt blev aktiveret som reaktion på RD. Blokering af ATM /ATR-signalering førte til dæmpningen af ​​RD-induceret γH2AX, og den delvise genindvinding af celleproliferation. Desuden RD eksponering resulterede i inaktivering af BRCA1, undertrykkelse af HR og NHEJ reparation aktivitet, og nedregulering af de udtryk og DNA-end bindende aktiviteter Ku70 /86. I overensstemmelse med observationer, der vises microarray data, som RD udløste ændringer i gener, der er ansvarlige for celleproliferation, cellecyklus, DNA-skader og reparation, og apoptose. Administration af RD til xenotransplantat mus reducerede tumorvækst og koordineret forårsaget ændringer i ekspressionen af ​​gener involveret i DNA-skader og reparation, sammen med celle apoptose. Således dette fund identificeret en ny mekanisme, som RD påvirker DNA-reparation og fungerer som en DNA-skader agent i prostatakræft

Henvisning:. Hu Z, Kong F, Si M, Tian K, Yu LX, Young CYF et al. (2013) Riccardin D udøver sin antitumoraktivitet ved at inducere DNA Skader i PC-3 prostatacancerceller

In vitro

In Vivo

. PLoS ONE 8 (9): e74387. doi: 10,1371 /journal.pone.0074387

Redaktør: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, USA

Modtaget: 23. maj 2013; Accepteret: 31 juli 2013; Udgivet: 17 september, 2013 |

Copyright: © 2013 Hu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (30772594, 30973551, 30925038) og Natural Science Foundation of Shandong-provinsen (2009ZRB01346). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er en af ​​de mest almindelige maligne tumorer hos mænd og hormonal tilbagetrækning terapi forbliver effektiv til avanceret PCa. Men udviklingen af ​​hormon-refraktær prostatacancer (HRPC) forekommer uundgåeligt efter hormonal deprivationsbehandling [1,2]. Der er begrænsede muligheder for en vellykket forvaltning af HRPC. For nylig, docetaxel, en plante alkaloid derivat, er blevet fremstår som et aktivt middel til at forbedre livskvalitet og betingelser for overlevelse hos patienter med metastatisk HRPC [3,4]. Succesen med docetaxel har ført til mange bestræbelser der gøres for at isolere forskellige naturligt forekommende kemikalier og undersøge virkningsmekanismer af bioaktive forbindelser til udvikling af kemoforebyggende og /eller terapeutiske midler til behandling af kræft, herunder HRPC [5].

en af ​​de mest effektive kemiske reagenser, der anvendes i kræft kemoterapi er DNA skader induktorer, som kan forårsage en række DNA-læsioner via flere mekanismer. For eksempel kan camptothecin og etoposid udløse enkeltstrengede pauser (SSB’er) eller dobbeltstrengede DNA-brud (DSB’er) ved at fange topoisomerase-DNA kovalente komplekser, efterfølgende fører til celledød [6,7]. Således DNA topo I og II, især topo II, menes at være veletablerede mål i cancerterapi.

Afhængigt af typen af ​​DNA-læsioner, specifikke cellecykluskontrolpunkter og cellulære kaskader aktiveres med DNA- ødelæggende midler. Som almindeligt accepteret, ataksi telangiectasia muteret (ATM) og ataksi telangiectasia og Rad3 beslægtet (ATR) signalveje spiller vigtige roller i respons på DNA beskadigelse. ATM reagerer primært DSBs, og indleder fosforylering af downstream mål som Chk2, BRCA1 og NBS1 proteiner på stedet af DNA-skader [8]. Disse faktorer virker sammen til at inducere G1, S og G2 cellecyklus anholdelser, DNA-reparation, og /eller aktivering af celledødsveje [9]. Mens ATR aktiveres som reaktion på replikation stress, udløser aktiveringen af ​​Chk1, hvilket igen fører til phosphorylering af Cdc25 og forhindrer aktiveringen af ​​CDK1 /cyclin B og mitotisk post [10]. Ved DSBs, processen med DSBs ende sammenføjning involverer talrige proteiner og enzymer gennem ikke-homolog ende sammenføjning (NHEJ) og homologe rekombination (HR) reparationsmekanismer [11,12]. For eksempel Ku70 /86 heterodimer er kritisk i NHEJ, da det binder til de brudte DNA-ender og rekrutterer reparation-relaterede proteiner, herunder DNA-afhængig proteinkinase, XRCC4 og DNA-ligase IV [13]. Det er blevet påvist, at DNA-skader er impliceret at fremkalde både ATM og ATR signalering [14]. Aktivering af disse to veje med mulige fejl i cellecyklus checkpoints og DNA-reparation reaktion kan være relevant at bestemme styrken og effekten af ​​DNA-skader inducere.

Vi har for nylig rapporteret, at Riccardin D (RD), en makrocyklisk bisbibenzyl forbindelsen fra den kinesiske liverwort plante

Dumortiera haaret

[15], var i stand til at inducere apoptose af humane leukæmiceller ved at målrette topo II [16]. I denne undersøgelse fandt vi, at RD behandling førte til induktion af DNA-skader og hæmning af respons produkter er involveret i DNA-reparation.

Materialer og metoder

Cell kultur og behandlinger

Menneskelig LNCaP, PC-3 og DU145 celler (American Type Culture Collection (ATCC)) blev dyrket i RPMI 1640-medium (HyClone) suppleret med 10% føtalt bovint serum (HyClone). Cellerne blev dyrket i 5% CO

2 ved 37 ° C, indtil man kommer ca. 50-70% konfluens og derefter behandlet med kemikalier. RD var isoleret og oprenset i vores laboratorier som tidligere [15] beskrevne. RD og etoposid (VP-16) blev fremstillet i dimethylsulfoxid (DMSO) og opbevaret som små portioner ved -20 ° C.

immunblotting

Efter behandling som indikeret, blev cellelysater fremstillet under anvendelse RIPA buffer. Proteiner (80 ug) blev separeret ved SDS-PAGE og overført elektroforetisk på polyvinylidenfluorid membraner (Millipore). Membranerne blev probet natten over ved 4 ° C med de passende primære antistoffer: glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH), cyclin E, poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), Bcl-2, Bax og nucleolin (Santa Cruz) , Ku70 og Ku86 (Active modif), Cdc25B (BD Biosciences), cyklin A (Anbo Biotechnology), cyclin B1 (Novus Biologicals), Cdc25C, Ser

1981-phosphoryleret-ATM, Tyr

15-phosphoryleret-Cdc2 , Ser

428-phosphoryleret-ATR, Ser

296-phosphoryleret-Chk1, Thr

68-phosphoryleret-Chk2, Ser

1524-phosphoryleret-BRCA1, Ser

139-phosphoryleret histon H2AX (γH2AX), PP2AA, PP2AB, og PP2AC (Cell Signaling), PPP4C (Bethyl, Montgomery, TX, USA), IgG-TRITC (Abcam) efterfulgt af blokering med 5% fedtfri tørmælk. Ved fjernelse af primære antistoffer blev membranerne vasket med TBST og inkuberet med IgG-peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundære antistoffer, derefter visualiseret ved forøget kemiluminescens påvisningssystem (Millipore).

Cellevækst og cellelevedygtighed assay

celler blev podet med 4000 celler /brønd i mikroplader (Roche), og udsættes for RD eller vehikel. Cell vækstkurver blev opnået ved Real-Time Cell Analyzer SP Instrument (Roche). Cell Index (CI) værdier blev normaliseret i forhold til CI værdi af den tid punkt, hvor kemikaliet tilsat. For cellelevedygtighed analyse blev PC-3-celler forbehandlet med 10 mmol /l koffein i 1 time, og udsættes for RD eller vehikel i 24 timer. Celleproliferation blev derefter undersøgt af 3- (4, 5- dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT, Sigma) kolorimetrisk assay.

Cell cyklus og apoptose-assay

efter behandling med RD i 24 timer blev celler kapacitetsomkostninger og behandlet med propidiumiodid (PI) (Sigma) i 30-minutter i mørke. Celle cyklus blev analyseret ved en FACS (Becton Dickinson, USA). Apoptose blev undersøgt under anvendelse af et Annexin V-FITC /PI Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences) ved flowcytometri. Salg

mikronukleusanalysen

Celler blev podet i plader med 6 brønde og behandlet med RD, DMSO eller VP-16 (10 pmol /l) i 24 timer. Efter fiksering og permeabilisering blev celler farvet med DAPI (Sigma). Mikrokerner i celler blev scoret under et fase- fl uorescence mikroskop (Nikon). Mindst 1000 celler pr prøve blev scoret til analyse.

Neutral komet assay

Celler blev behandlet med kemikalier, som angivet ovenfor. DNA DSBs blev påvist ved hjælp af Trevigen Comet, Assay Single Cell Gel Elektroforese Assay (Trevigen). Comet haler blev afbildet med en fase-fluorescens mikroskop (Nikon) og kvantificeret ved Casp software. Et minimum af 100 celler blev scoret per behandling

Immuno fl uorescence farvning af γH2AX og p-BRCA1

celler dyrket på dækglas blev fikseret med iskold methanol /acetone. (1: 1) og inkuberet med 3% BSA i PBS med 0,1% Triton X-100. Efter inkubation med primære antistoffer og skylning med PBS blev celler immunfarvet med sekundære antistoffer og modfarvet med DAPI. Fluorescensbilleder blev taget med et konfokal mikroskopi (CarlZeiss).

Microarray og real-time PCR-analyse

Totalt RNA blev ekstraheret fra celler, der blev udsat for kemikalier under anvendelse af et RNAiso plus kit (Takara Bio ). Microarray analyse blev udført på Genetimes Technology, Inc. (Kina) på Affymetrix HG-U133 plus 2 chip, og de oprindelige data blev forelagt GEO (Serie GSE37812). Til kvantitativ PCR (qPCR) assays, blev cDNA syntetiseret ved anvendelse ReverTra Ace qPCR RT Kit (Toyobo). qPCR blev udført med SYBR Green reaktion mester mix på en Real-time PCR System (Eppendorf International). Transkriptionelle niveauer af ønskede gener blev normaliseret til det niveau af GAPDH. Ændringer i genekspression blev beregnet ved anvendelse ΔΔC

t metode. Sekvenserne af primerne er vist i tabel 1.

Forward primer (5 ‘- 3’)

reverse primer (5′- 3′)

Cdc25BGGCTGAGGAACCTAAAGCCCTCGATCTCATCGTGACACAGTCdc25CAGGAACCCCAAAATGTTGCCTGCAGAAGTGGTAAGCTGAGTGcyclin ETCCAAGAGTTTGCTTACGTCACGCCAGGAGATGATTGTTACAGGcyclin AGATGGTAGTTTTGAGTCACCACACACGAGGATAGCTCTCATACTGTcyclin B1ATAAGGCGAAGATCAACATGGCTTTGTTACCAATGTCCCCAAGAGcdc2ACACAAAACTACAGGTCAAGTGGGGAATCCTGCATAAGCACATCCRPA1CTCGGGAATGGGTTCTACTGTCACTTGGACTGGTAAGGAGTGARPA2TGGTAGCCTTTAAGATCATGCCCCTGGATTGCTGATAGGTGCTCRPA3TGATGGAACCCCTTGATGAAGACATGTTGCACAATCCCTAAAGGAXRCC5GACGTGGGCTTTACCATGAGTTCAGTGCCATCTGTACCAAACXRCC6AGTCATATTACAAAACCGAGGGCCCTTGGAGGCATCAACCAAAAAMSH6AGCTTAAAGGATCACGCCATCAAGCACACAATAGGCTTTGCCGAPDHTGGTCACCAGGGCTGCTTAGCTTCCCGTTCTCAGCCTTTable 1. Q-PCR frem og bak primere.

CSV Hent CSV

Co-immunoprecipitation

Prøver af proteiner (1,2 mg) fra kontrol og RD-behandlede celler blev klaret med protein A /G Plus -Agarose (Santa Cruz) i nærvær af ikke-specifikt IgG (Santa Cruz), derefter inkuberet med primære antistoffer og 20 pi agaroseperler med konstant omrøring natten over ved 4 ° C. Perlerne blev vasket og opvarmet ved 75 ° C i 5 minutter i loading buffer før immunoblotting assays.

Analyse af DNA-ende-bindende aktivitet af Ku70 /Ku86

Nuclear ekstrakter fra kontrol eller RD -behandlede celler blev fremstillet og udsat for sporing af DNA end-bindende aktivitet af Ku70 og Ku86 anvendelse af en Ku70 /Ku86-DNA Repair kit ifølge producentens instruktioner (Active Motif).

DNA endesammenslutning assay

for at bestemme virkningerne af RD på DSBs reparation, udviklede vi en celle-fri DNA ende-sammenføjning assay som beskrevet af Shao C, et al. [17]. Plasmidet pUC19 blev spaltet med HincII, hvilket resulterer i et stumpendet lineært molekyle. Det lineariserede DNA blev inkuberet med kerneekstrakt (2 pg) i 50 mmol /L Tris-HCI (pH 7,6), 10 mmol /l MgCl

2, 1 mmol /L dithiothreitol, 1 mmol /l ATP og 25% (vægt /v) polyethylenglycol 8000 ved 14 ° C i 6 timer eller 24 timer. Kerneekstrakt af Raji-celler indkøbt fra Active Motif tjente som en positiv kontrol. NHEJ blev bestemt ved PCR-amplifikation af krydset af genforenet ender med M13 primere. PCR-produkter af ampicillin blev udført som en intern kontrol. Alle forsøg blev gentaget tre gange.

NHEJ og HR reparation assay

evne DNA-reparation i celler behandlet med RD blev evalueret med HR og NHEJ journalister, bedes venligst leveret af Dr. Gorbunova ( Biologisk Institut, University of Rochester) [25,26]. Reporter kassette til påvisning NHEJ eller HR blev fordøjet med I-Scel at inducere DSB’er. Det lineariserede reporter kassette ifølge NHEJ eller HR og DsRed blev co-transficeret ind PC-3-celler efter behandling med RD eller vehikel i 24 timer. Celler blev analyseret på FACScalibur maskine (Becton Dickinson, USA) under anvendelse af en grøn-versus-rødt fluorescerende plot. Data blev analyseret med Cell Quest software (BD Biosciences).

Vurdering af anti-tumor effekt af RD

in vivo

For at evaluere

in vivo

effekt af RD på PCa, 6 uger gammel mand BALB /c-nu mus (Vital River Laboratories, Beijing, Kina) blev anvendt. Mus akklimatisere i 1 uge efter ankomst. Tumorxenografter blev oprettet ved at injicere 5 × 10

6 PC-3 celler i de rigtige flankerne af mus. Når tumorer var påviselige blev musene randomiseret i behandlings- og kontrolgrupper. Indledende dosering blev givet på tidspunktet for parret matching (dag 1). RD (30 mg /kg) eller placebo (ækvivalente mængder opløsningsmiddel) blev givet hver anden dag ved i.p. indsprøjtning. Mus blev overvåget dagligt følgende behandlinger, og tumorerne blev målt hver anden dag ved at bestemme to vinkelrette dimensioner [længde (L) og bredde (W)] under anvendelse af en skydelære og ved anvendelse af formlen V = L × W

2/2. Efter 20 dages behandling blev alle mus aflivet ved værelser med ether anæstesi og deres tumorer resektion for tumormassen måling. Tumorvæv blev fikseret i 4% paraformaldehyd og anvendt til TUNEL analyse (Calbiochem), immunoblotting og immunofluorescens. Alle eksperimenter dyr blev godkendt af den etiske komité Shandong University School of Medicine (Permit nummer: 2.010.038) og udført i overensstemmelse hermed

Statistisk analyse

Data præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse. af mindst tre uafhængige forsøg. Den statistiske signifikans af den gennemsnitlige forskel mellem kontrolgruppen og behandlede grupper blev bestemt ved en parret t-test, hvor

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

RD inducerer cellecyklusstop og apoptose i PC-3-celler

Siden RD har vist sig at inducere apoptose i leukæmiceller og lunge kræftceller [16,18], indledte vi vores undersøgelse for at afgøre, om RD også udøvet cytotoksisk virkning på PCA celler ved løbende at overvåge celleproliferation. Som vist i figur 1A, eksponering af PC-3-celler til RD forårsagede markant suppression af celleproliferation på en dosis- og tidsafhængig måde.

A

, Celleproliferation som reaktion på RD blev overvåget af celle index (CI) værdier ved hjælp xCELLigence System.

B

, Efter eksponering af PC-3-celler til Rd for 24 timer, celle cyklus blev analyseret ved fl ow cytometri.

C

, Immunblotanalyse af cellecyklus regulatorer i celler behandlet med RD.

D

, mRNA-niveauer af G2 /M fase-relaterede cyklus regulatorer i RD-behandlede celler blev bestemt ved real-time PCR. Expression ændringer i disse gener efter RD behandling (10μmol /L) var også inkluderet.

E

, Procentdel af apoptotiske celler blev analyseret ved fl ow cytometri.

F

,

en

, analyse af mikrokerner formationer i PC-3 celler behandlet med RD.

B

, hyppigheden af ​​PC-3-celler, der indeholder mikrokerner behandlet med RD eller VP-16 i 24 timer. barer, SD. *, P 0,05, signifikant forskel fra ubehandlede gruppe.

Efter 24 behandling med RD, blev cellecyklus signifikant anholdt i G2 /M fase med stigende koncentrationer. Derfor RD behandling resulterede i fald dosisafhængige i angivelsen af ​​cyklin E, A, og B, som er de molekylære markører korreleret med G2 /M-fasen. Familien af ​​Cdc25 phosphataser og nedstrømsmål Cdc2 spiller en vigtig rolle i S og G2-M progression. Vi observerede også fald i udtrykkene for Cdc25B, Cdc25C, og fosfor-Cdc2

Tyr15 (inaktiv form) på en dosis-afhængig måde i behandlede celler (figur 1C). qPCR assays viste, at ekspressionen af ​​Cdc2 på transkriptet niveau blev markant reduceret i RD-behandlede celler (figur 1D), hvilket antyder, at RD undertrykte ekspressionen af ​​Cdc2 på mRNA-niveauet, hvilket igen førte til en reduceret phosphor-Cdc2. I mellemtiden, ændringer i mRNA-ekspression af cyclin E, A, B, Cdc25B, og Cdc25C ved RD (figur 1D) svarede til bemærkningerne i figur 1C, angiver, at mønsteret af cellulære responser var konsistent med RD-inducerede forstyrrelse af cellecyklus i PC-3-celler. Udover interferens med cellecyklusprogression, RD kunne mærkbart inducere apoptose i en dosisafhængig måde (figur 1E).

Microarray analyse viste, at gener relateret til beskadigede-DNA-binding, DNA-reparation, cellecyklus og apoptose blev ændret betydeligt i RD-behandlede celler sammenlignet med kontrollen som opsummeret i tabel S1. Af de gener, observerede vi, at cyclin E, A, B, Cdc2, Cdc25B, og Cdc25C blev nedreguleret dramatisk i RD-behandlede celler, i overensstemmelse med resultaterne i Figur 1D.

RD udløser DNA-skader i PCA-celler

Vi derefter bestemmes, om udsættelse for RD ved koncentrationer, der var tilstrækkeligt til at inducere cellecyklus og apoptose resulterede i DNA-skade, fordi RD kunne inhibere Topo II i leukæmiceller [16]. Som forventet micronukleusdannelse var tydelig i celler behandlet med 5 umol /L RD i 24 timer og udviste en dosisafhængig forøgelse (panel a i figur 1F), svarende til VP-16, en veldokumenteret DNA-skader middel. Antallet af mikronukleus i celler udsat for RD blev sammenfattet i panel B i figur 1F. Derfor er disse resultater foreslog, at RD inducerede DNA-skader, var forbundet med fremme af cellecyklusstop og apoptose i PC-3 celler.

For at bekræfte evne RD i udløsning DNA-skader i PCA celler, vi undersøgte ændringerne af DNA damage markører ved Western blotting. Som vist i figur 2A, RD forårsaget betydelige stigninger i phosphorylering af histon H2AX

Ser139 (γH2AX), en velkendt DNA beskadigelse respons indikator, ved 2h og opretholdt frem til 24 timer efter behandling i både androgen-afhængige (LNCaP) og androgen-uafhængige PCa (PC-3 og DU 145) celler. Med hensyn til DNA-skader respons proteiner blev udtryk for fosfor-BRCA1 ved RD udtalt på tidlige tidspunkter og faldt ned i celler efter forlænget behandlinger (figur 2A), tyder på, at RD inducerede DNA-skader respons i PCA celler.

En

, Immunblotanalyse af ekspressionsniveauer af p-BRCA1 og γH2AX i LNCaP, PC-3 og DU145 celler udsat for RD hhv.

B

,

en

, Neutral komet assay blev udført for at bestemme DNA-fragment i RD-behandlede celler.

b

, Fordeling af gennemsnitlig komet længde (100 celler pr prøve) blev beregnet ved kassen og knurhår plot. Medianer er angivet med kryds; interkvartile område (25-75%; IQRs) er angivet med åbne kasser. De whiskers er 1,5 gange IQR distribution.

Desuden blev neutral komet assay udført for at teste, om RD kan fremkalde DSB’er i PCA celler. Resultater i figur 2B viste, at DNA-hale øjeblikke i respons på RD var påviselige i celler så tidligt som 2 timer behandling, og blev mere udtalt med langvarig behandling. Således data viste, at RD forårsagede DSBs betydeligt i PCA celler.

RD påvirker ATM /ATR-afhængige Chk1 /Chk2 veje i PC-3 celler

For at afgøre, om ATM /ATR-Chk1 /2 signalveje, som er veldefinerede som aktiveres efter DNA beskadigelse, er involveret i RD-induceret DNA-skader reaktion, vi først undersøgt ændringer i faktorer, der vides at være vigtige for mediering ATM /ATR veje. Kinetiske undersøgelser viste forhøjede phosphorylering af ATM og Chk2 (Thr

68) blev induceret ved RD så tidligt som 30 min, men dette phosphorylering niveau faldt markant bagefter. Henviser blev observeret aktivering af ATR /Chk1 på 2h behandling og fortsatte indtil 24 timer som vist ved akkumulering af fosfor-ATR og fosfor-Chk1 (Ser

296) som respons på RD (figur 3A). Det skal bemærkes, at ATR /Chk1 blev signifikant aktiveret af RD på 2h behandling, hvor aktivering af ATM /Chk2 blev forringet. Shifting aktivering af ATM til ATR foreslået, at også kan forekomme andre typer af DNA-læsioner, herunder replikering interferens og pladskrævende læsioner foruden DSB’er. Negativ regulering af Cdc25 familiemedlemmer, nedstrøms for Chk1 /Chk2, er en vigtig mekanisme bag blokering mitotisk post efter DNA beskadigelse [19]. Som forventet nedreguleret Cdc25B /C og en udtalt induktion af mitotisk Cdc25C ved 4h, som varede efter behandling blev observeret i RD-behandlede celler sammenlignet med de ubehandlede celler (figur 3A). En stigning i spaltningen af ​​PARP blev også observeret (figur 3A).

A

, ændringer af DNA-skader proteiner i RD-behandlede celler blev analyseret ved western blotting.

B

, Efter behandling med kemikalier til 4h eller 12h, protein niveauer af DNA-skader proteiner blev påvist ved western blotting.

C

, Immuno fl uorescence farvning af γH2AX foci og p-BRCA1 foci i PC-3 celler.

D

,

en

, Neutral komet assay af PC-3 celler behandlet med RD for 4h og 12h.

b

blev Comet længde analyseret ved knurhår plot metoden (100 celler pr prøve) boksen og.

E

, Sammenslutninger af γH2AX, PP2AC, og PPP4C blev bestemt ved co-immunpræcipitationseksperimenter hjælp anti-γH2AX, anti-PP2AC, anti-PPP4C eller normal IgG.

F

, PC-3-celler blev forbehandlet med 10 mmol /l koffein i 1 time og eksponeret til RD i 4 timer og 12 timer,

en

, cellelevedygtighed målt ved MTT assay; barer, SD. *,

#, P 0,05, signifikant forskel fra kontrollen.

b

, ændringer i γH2AX blev detekteret ved western blotting.

DNA beskadigelse udløser en signaleringskaskade, som fører til dannelsen af ​​en reparation kompleks ved pauserne. Vi vurderede næste ændringer af protein BRCA1, en kritisk molekyle i den indledende rekruttering af andre reparation proteiner /enzymer på pauserne [20]. Aktivering af BRCA1 (phosphorylering ved Ser

1524) ved RD blev noteret op til 4h og faldt efter behandling, hvilket korrelerede godt med aktiveringen mønster af Chk2, hvilket tyder Chk2 kan faktisk phosphorylere BRCA1 som reaktion på beskadigelse (figur 3A). Baseret på ovenstående observationer, fandt vi, at er der sket store ændringer i 4h og 12T behandlinger, som begge kunne være kritiske tidspunkter for RD-induceret DNA skade responset. Yderligere undersøgelser (figur 3B) viste, at mønstret af responset involverer γH2AX, fosfor-Chk1 /2 og fosfor-BRCA1 ved 4h og 12h var i overensstemmelse med observationerne i figur 3A. Disse resultater blev yderligere understøttet af observationen i figur 3C. Som en kontrol, VP-16 var i stand til at opretholde forhøjede phosphor-Chk1 /2, fosfor-BRCA1 og γH2AX niveauer efter længere eksponering sammenlignet med dem i RD behandlinger (figur 3B og 3C), hvilket antyder, at forskellige mekanismer bidrog til svarene af RD og VP-16 behandlinger. I overensstemmelse med ændringer i DNA beskadigelse respons proteiner, udtalt komet haler blev vist til stede i celler udsat for RD (panel a og b i figur 3D). Notatet forhøjet γH2AX der kan phosphoryleres af ATM /ATR kinaser [21,22] var tydelig på 4h og vedvarende op til 48 timer efter RD behandling, hvor den aktiverede-ATM /ATR af RD blev ophævet (figur 3A). Vi analyserede også ændringer i proteinphosphatase 2A (PP2A) og proteinphosphatase 4 (PP4), som er impliceret i dephosphorylere γH2AX [23,24]. Efter 24 timers behandling, forårsagede RD øget PP2AC (katalytiske underenhed af PP2A), og PPP4C (katalytiske underenhed af PP4) (figur 3E), hvilket indikerer, at H2AX forblev phosphoryleret i nærvær af forhøjede PP2AC og PPP4C. Co-immunopræcipitationsforsøg Resultaterne viste, at γH2AX var markant mærkbar med progressivt nedsat PP2AC eller PPP4C i komplekser immunpræcipiteret af anti-γH2AX, anti-PP2AC eller anti-PPP4C antistoffer (figur 3E), hvilket tyder på, at værdiforringede sammenslutninger af γH2AX /PP2AC /PPP4C ved RD kan , i det mindste delvist bidrager til de væsentlige ophobning af γH2AX.

Derudover koffein, en inhibitor af ATM /ATR signalering, næsten fuldstændigt ophævet evne RD at fremme H2AX phosphorylering under behandlingen, som blev ledsaget med den vendepunkt i RD-induceret celledød (figur 3F). Sammen data viste klart, at ATM /ATR-medierede kaskade pathways spillet en afgørende rolle i afhængighed af RD-induceret DNA-skader, der fører til fremme af celler til at indtaste letal mitose.

RD inhiberer NHEJ og HR i PC-3 celler

for at bestemme virkningerne af RD på DSBs reparation, udviklede vi en celle-fri DNA ende-sammenføjning assay til at vurdere relative bidrag NHEJ i DNA ende-sammenføjning [17]. Lineariserede plasmid pUC19 DNA ved enzym HincII blev inkuberet med proteinekstrakter nukleare og endesammenslutning aktivitet blev afspejlet ved fremkomsten af ​​lineære dimerer og multimerer som blev amplificeret ved PCR med M13 primere flankerer ende-forbundet motorvej (figur 4A, 4B). Efter behandling med RD i 6 timer eller 24 timer, blev NHEJ aktivitet af kerneekstrakt markant undertrykt som indikeret ved forekomsten af ​​en stærk monomer band og tilsvarende faldt multimer produkter, mens dimer trimer og tetramer bands var tydelige i kontrolgruppen (figur 4B ). Som en positiv kontrol blev NHEJ aktivitet også svækket af RD under inkubation af DNA substrat med Raji cellekerner ekstrakt (Active Motif) under samme betingelser (figur 4B). Desuden inkubation af lineært DNA med blokerende antistoffer rettet mod Ku70 og Ku86 i kerneproteiner førte til nedsat multimer bands, svarende til observationen i RD behandling (figur 4B), som godtgør, at Ku heterodimer Ku70 /Ku86 er to af de vigtige proteiner i RD-medierede DSBs reparation.

En

, Skematisk diagram af princippet om DNA End-sammenføjning analysen.

B

, Efter at være blevet behandlet med RD, eller med blokerende antistoffer Ku 70/86, relative evne NHEJ blev bestemt.

C

,

en

, Skematisk diagram af princippet om NHEJ analyser.

b

, Skematisk diagram på princippet om HR-analyser.

D

, Antallet af GFP

+ og DsRed

+ celler blev bestemt ved flowcytometri, og typiske FACS spor er vist til venstre. Forholdet mellem GFP

+ til DsRed

+ celler blev anvendt som et mål for reparation effektivitet.

Vi gik endnu et skridt til at vurdere virkningerne af RD på NHEJ og HR ved hjælp af

in vivo

analyser som beskrevet af Dr. Gorbunova [25,26]. Til påvisning af NHEJ aktivitet, vil reporteren GFP produceres når NHEJ er aktiv til at reparere DSB’er induceret af enzym fordøjelse (figur 4C, a). Til påvisning af HR kan vellykkede gen konverteringsbegivenheder rekonstituere aktivt GFP-genet ved at reparere enzym-producerede DSBs (figur 4C, b). Efter at være blevet behandlet med RD i 24 timer, blev PC-3-celler co-transficeret med enzym I-Scel-fordøjet reporter kassette ifølge NHEJ eller HR, og DsRed plasmid for at normalisere transfektionseffektiviteten. Reparation af I-Scel-inducerede pauser vil resultere i fremkomsten af ​​GFP

+ -celler [26]. Efter transfektion blev cellerne analyseret ved flowcytometri, og forholdet mellem GFP

+ og DsRed

+ -celler blev anvendt som et mål for HR eller NHEJ effektivitet. Som vist i figur 4D, GFP signal faldt betydeligt i enten NHEJ eller HR reparationssystemer i celler behandlet med RD, hvilket indikerer, at DSBs reparation var hæmmet i afhængighed RD. Sammen demonstreret, de data, som RD var i stand til at hæmme NHEJ og HR, og undertrykt DSBs reparation i PC-3 celler.

RD nedregulerer DNA reparation proteiner i PC-3 celler

På baggrund af observationer ovenfor, vi yderligere præciseret rolle Ku70 /Ku86 reaktion på RD-induceret DNA-skader. Efter inkubation af celler med RD i forskellige tidsperioder, Ku86 steget og toppede på 4h, faldt derefter hurtigt op til 48 timer, mens Ku70 forblev uændret indtil 12h og faldt efter at (figur 5A). DNA-ende-bindende aktivitet af Ku70 /Ku86 viste, at sammenlignet med de ubehandlede celler, de bindende aktiviteter både Ku70 /Ku86 i behandlede celler blev støt forbedrede op til 4h og faldt derefter i resten af ​​perioden eksponering (figur 5B), i overensstemmelse med resultaterne i figur 5A. Derudover bekræftede vi den dosisafhængige inhiberende virkning af RD på ekspressionen og bindende aktivitet af Ku70 /Ku86 i 4 h og 12T behandlinger (figur 5C, 5D). Desuden qPCR assays viste, at DNA-reparation forbundet

RPA1-3

,

XRCC5

,

XRCC6

, og

MSH6

blev nedreguleret ved RD (figur 5E ). Tilsammen disse observationer indikerede, at RD forringet DNA-reparation som respons på DNA-skade.

A

og

C

, Analyse af udtrykkene for Ku70 og Ku86 i nukleare proteiner ved western blot-assay.

B

og

D

, Analyse af DNA-ende-bindende aktivitet Ku70 eller Ku86 i PC-3 celler udsat for RD. *, P 0,05, signifikant forskel fra kontrollen.

E

, Heatmap for mRNA niveauer af DNA-reparation gener i RD-behandlede celler, som blev bestemt ved real-time RT-PCR. Rød: overekspression, grøn: under-udtryk, sort: uændret udtryk, grå: ingen påvisning

RD udløser apoptose forbundet med induktion af DNA-skader i PC-3 xenograft

for at afgøre, om RD kunne fremkalde tumor celle apoptose via induktion af DNA-skader

in vivo

, som observeret i dyrkede celler, human PC-3 xenotransplantater blev udviklet i mandlige nøgne mus. Administration af RD har ingen signifikant virkning på hverken indledende eller endelige kropsvægt i tumorbærende mus sammenlignet med placebogruppen (figur 6A). Efter 20d behandlinger, tumorer opstået fra kontroldyr resulterede i drab på to dyr i forsøgsperioden, hvorimod tumorer fra RD-behandlede mus havde en signifikant mindre størrelse (figur 6B), hvilket indikerer betydelig tumorvækst inhibering med RD. Reduktion af tumormasse i RD behandlet-mus blev også observeret (figur 6C). Ændringer af molekylære markører i forbindelse med DNA-skader i behandlede mus viste, at RD forårsagede DNA-skade responset via ATM /ATR-medieret signalering som det fremgår af en betydelig ophobning af γH2AX, ophævelsen af ​​fosfor-BRCA1 og Ku70 /Ku86 overflod (figur 6D og 6E ), i overensstemmelse med resultaterne i dyrkede celler. I mellemtiden RD-medierede ændringer i udtrykkene for PP2A familiemedlemmer var magen til de bemærkninger, der er vist i dyrkede celler. Derudover sammenlignet med placebo-kontrol, ophævelsen af ​​Bcl-2, akkumulering af Bax, og spaltning af PARP var tydelige i RD-behandlede mus (Figur 6d). TUNEL assay støttede også observationerne, at apoptotiske celler blev udtalte i RD-behandlede mus (figur 6F a og b). Dataene viste, at RD udløste DNA-skader og forringede reparation proteiner, hvilket fører til apoptotisk celledød, hvilket bidrog til dets antitumor effekt

A

-.

C

, Effekt af RD på tumorvækst og legemsvægt hos nøgne mus.