PLoS ONE: rolle genetiske varianter af autofagi Gener i modtagelighed for ikke-medullær kræft i skjoldbruskkirtlen og Patienter Outcome

Abstrakte

Autophagy er en central proces i reguleringen af ​​cellernes overlevelse, celledød og proliferation og spiller en vigtig rolle i carcinogenese, herunder skjoldbruskkirtlen carcinom. Genetisk variation i Autophagy komponenter er blevet påvist at påvirke evnen til at udføre autofagi og er forbundet med sygdomsmodtagelighed, progression og resultater. I den foreliggende undersøgelse vurderede vi, om den genetiske variation i Autophagy gener bidrager til modtagelighed for at udvikle skjoldbruskkirtlen karcinom, sygdomsprogression og /eller patienten resultat. Resultaterne indikerer, at patienter, der bærer

ATG5

enkelt nukleotid-polymorfier rs2245214 har en højere sandsynlighed for at udvikle thyreoideakarcinom (OR 1,85 (95% CI 1,04-3,23), P = 0,042). I modsætning hertil kunne ingen signifikante forskelle observeres for de andre genetiske varianter undersøgt i form af thyreoideakarcinom modtagelighed. Desuden blev ingen af ​​de udvalgte genetiske varianter associeret med kliniske parametre for sygdomsprogression og resultat. Afslutningsvis genetiske variation i

ATG5

, en central aktør i autophagy proces, viser sig at være forbundet med øget modtagelighed for skjoldbruskkirtlen karcinom, hvilket indikerer en rolle for autophagy i skjoldbruskkirtlen carcinogenese.

Henvisning : Plantinga TS, van de Vosse E, Huijbers A, Netea MG, Joosten LAB, Smit JWA, et al. (2014) rolle genetiske varianter af autofagi Gener i modtagelighed for ikke-medullær kræft i skjoldbruskkirtlen og patienter Outcome. PLoS ONE 9 (4): e94086. doi: 10,1371 /journal.pone.0094086

Redaktør: David L. Boone, University of Chicago, USA

Modtaget: December 13, 2013; Accepteret: 10 marts 2014; Udgivet 16. april, 2014

Copyright: © 2014 Plantinga et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. TSP var støttes af en Veni tilskud nederlandsk organisation for Videnskabelig Forskning (NWO). MGN blev understøttet af en Vici tilskud nederlandsk organisation for Videnskabelig Forskning (NWO). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

epitelcelle afledt ikke-medullær thyreoideacancer (NMTC) er den mest almindelige endokrine malignitet med en stigende forekomst i de seneste årtier, som papillær thyreoideakarcinom (PTC) og follikulært thyreoideakarcinom (FTC) udgør langt størstedelen af tilfældene [1] – [3]. Selv om nogle tumor-initierende hændelser og modtagelighed faktorer er blevet identificeret (stråling, flere genetiske faktorer såsom genetiske rearrarangements eller mutationer i

RET

,

PTEN

APC

) [4], er patogenesen af ​​NMTC ikke fuldstændigt forstået. En bedre forståelse af de underliggende molekylære mekanismer involveret i udviklingen af ​​NMTC kunne levere diagnostiske og prognostiske værktøjer og kunne være en potentiel kilde til hidtil ukendte molekylære mål for terapi.

Forøgelse tyder på, at autofagi spiller en vigtig rolle i patofysiologi den maligne proces. Autophagy er en kompleks proces med auto-fordøjelse under forhold med cellulært stress, hypoxi eller energi deprivation. Ved aktivering, er en autophagosome dannes der opsluger cellulære komponenter såsom organeller, ribosomer og proteinaggregater, som efterfølgende nedbrydes af fusion af autophagosome med en lysosom. Disse nedbrydningsprodukter kan genanvendes til opbygning af makromolekyler og for cellulær energi metabolisme [5] – [7]. Derudover autofagi har en vigtig rolle i reguleringen af ​​celledød, celledifferentiering, induktion af standsning af cellecyklus, og modulation af inflammation [8]. Autophagy kan have både forebyggende og salgsfremmende virkninger på tumorigenese, hvilket sandsynligvis afhængig af typen af ​​autophagy initiering, tumor celletype og den fase af tumor udvikling [9], [10]. Derfor er det vigtigt at identificere de mekanismer, der regulerer autofagi i maligne transformerede celler.

væsentlige dele af autophagy proces er de evolutionære højt konserverede ATG proteiner, hvoraf mere end 30 i øjeblikket er blevet identificeret i gær [11 ], [12]. Fælles germlinie genetiske varianter inden gener kodende for Autophagy komponenter blev for nylig påvist at være forbundet med human sygdom, der spænder fra inflammatorisk tarmsygdom [13] – [15] til neurodegeneration [16], infektionssygdomme [17], [18] og allergi [ ,,,0],19]. Men på trods af sin centrale rolle i kræft initiering og progression, rolle fælles kimcellelinje genetisk variation inden for autophagy for kræft modtagelighed, især NMTC, er stort set uudforsket. For nylig har vi beskrevet, at en genetisk variant i autophagy gen

ATG16L1

har en vigtig indflydelse på modtagelighed for NMTC [20]. I den foreliggende undersøgelse udvidet vi formålet med vores undersøgelse at vurdere den potentielle sammenslutning af en langt bredere vifte af genetiske varianter i autophagy gener med modtagelighed for NMTC, progression og resultat.

Materialer og metoder

Etik erklæring

undersøgelsen blev godkendt af Etisk Komité Radboud University Medical Centre, Nijmegen, Holland. Alle individer gav skriftligt informeret samtykke. Undersøgelsen er udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen.

thyreoideakarcinom patienter

Alle patienter med histologisk bekræftet ikke-medullær epitelcelle afledt NMTC som besøgte ambulatoriet ved afdelingen for Endokrinologi af Institut for Intern Medicin, Radboud University Medical Centre, Nijmegen, Holland, blev bedt om at deltage i gentest. Rekrutteringen af ​​patienterne fandt sted i perioden fra november 2009 og juni 2010. Primær behandling af patienterne bestod af total eller næsten total thyroidectomy i alle patienterne, og modificerede radikale lymfeknuder node dissektioner i patienter med bekræftede nodal metastaser. Dette blev efterfulgt af ablation med radioaktivt jod (I

131, RAI) af resterende thyreoideavæv 4-6 uger efter operationen. Hvis det er nødvendigt, blev patienterne behandlet flere gange med RAI at nå remission. Indledende kur blev defineret som ikke målbart Thyroid hormon stimuleret thyroglobulin (Tg) i fravær af anti-Tg antistoffer og ingen tegn på loco-regional sygdom eller fjernmetastaser på hele kroppen jod scanninger (WBS) og /eller hals ultralydsundersøgelse undersøgelser på seks til ni måneder efter RAI ablation. Tumor tilbagefald blev defineret som nye beviser af loco-regional sygdom eller fjernmetastaser efter vellykket primær terapi. Aktuel sygdomsstatus blev defineret som “i remission” i tilfælde af målbart Tg i fravær af anti-Tg antistoffer og ingen tegn på loco-regional sygdom eller fjernmetastaser ved sidste opfølgende besøg. Vedvarende sygdomsstatus blev defineret som påviselig Tg og /eller tegn på loco-regional sygdom eller fjernmetastaser.

Demografiske og kliniske karakteristika (tumor histologi og TNM mellemstationer), behandling (antal RAI terapi sessioner, kumulativ RAI dosis ), opfølgning tid, antallet af re-operationer og ekstern strålebehandling terapi, hvis det er relevant, blev hentet fra patientens journal (tabel 1). Den hollandske befolkning baseret Kontrolgruppen bestod af 189 raske kontrolpersoner (48% kvinder, gennemsnitsalder 61 ± 10 (SD) år), der har ingen tegn på kræft i skjoldbruskkirtlen eller andre maligniteter.

Genotypebestemmelse

Veneblod blev trukket fra det kubiske vene af alle deltagere i 10 ml EDTA-rør (Monoject). DNA blev isoleret fra helblod ved anvendelse af isolation kit Puregene (Gentra Sytems, MN, USA), ifølge fabrikantens protokol. Kodning ikke-synonyme single nucleotide (SNP’er) og et par SNP’er i utranslaterede regioner af de analyserede gener blev udvalgt på grundlag af tidligere offentliggjorte foreninger med humane sygdomme og /eller kendte funktionelle virkninger på proteinfunktion eller genekspression. I alt 10 SNPs i

ATG2B

,

ATG5

,

ATG10

,

IRGM

,

LAMP1

,

LAMP3

WIPI1

blev genotype (tabel 2) med brug af en masse-spektrometri genotypning platform. Alle SNP’er er i Hardy-Weinberg ligevægt i både patient- og kontrolgrupper. Kvalitetskontrol blev udført ved at duplikere prøver i og på tværs plader, og ved inkorporering af positive og negative kontrolprøver.

Statistisk analyse

Forskellen i genotypefrekvenser mellem patienter og kontrol gruppe blev analyseret i en dominerende, gen dosering og recessive model ved hjælp af logistisk regression. Effekten af ​​genotyperne på epitel afledt NMTC modtagelighed blev estimeret ved at beregne odds ratio (OR) og deres konfidensintervaller 95% (95% CI) med de samme statistiske metoder. Vi udførte også χ

2 analyse, og hvis det er relevant logistisk regression, at afgøre, om tumor størrelse, kumulativ RAI dosis antal RAI behandlinger, sygdomsstatus efter thyroidektomi plus radio-ablation (hvis relevant) og den aktuelle status sygdom var forbundet med genotypen af ​​de analyserede autofagi gener. Følgende parametre blev analyseret: 1) tumor størrelse på tidspunktet for diagnosen blev klassificeret i henhold til 6

th udgave af UICC TNM klassifikationen [21]; 2) antallet af RAI behandlinger (herunder RAI ablation) som 0-1 behandlinger (fx ingen RAI ablation eller udelukkende ablation af rester af thyreoidea efter (nær) total thyroidektomi) eller ≥ 2 behandlinger; 3) den kumulative RAI dosering som 0-3.7 GBq (0-100 MCI), 3.8-7.4 GBq (101-200 MCI) eller 7,4 GBq ( 200 MCI); 4) sygdomsstatus efter ablation som remission eller vedvarende og 5) den aktuelle status sygdom som remission, vedvarende eller tilbagevendende (efter tidligere dokumenteret remission).

For at teste for forskelle mellem de tre forskellige genotype grupper (homozygot vilde -type (gammel), heterozygot, homozygot variant (afledt)) i den gennemsnitlige alder ved diagnose, køn distribution eller tumor histologi (potentielle confoundere) blev envejs ANOVA og Pearson χ

2-analyse anvendes, når det er relevant. Alle statistiske analyser blev udført med SPSS softwarepakken (version 20.0). Samlet set statistiske tests var to-sidet og en p-værdi under 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Genetisk modtagelighed analyse

Fra alle patienter med NMTC der besøgte ambulatoriet af Radboud University Medical Centre, Nijmegen, Holland fra november 2009 og juni 2010 139 patienter (104 kvinder; gennemsnitsalder 38,9 ± 12,8 (SD) år på tidspunktet for blodprøveudtagning) enige om at deltage i undersøgelsen. De kliniske og demografiske karakteristika for de NMTC patienter er opsummeret i tabel fandtes 1. Ingen statistisk signifikante forskelle mellem patienter med forskellig autofagi genetisk variant genotyper i forhold til den gennemsnitlige alder ved diagnose, køn eller tumor histologi (data ikke vist).

Statistisk analyse af autofagi genetiske varianter for NMTC modtagelighed afslørede en statistisk signifikant Assocation med

ATG5

rs2245214 enkelt nukleotid polymorfisme. Analyse ved at anvende en dominerende model viste en øget risiko for CG /GG genotype for diagnosticering af NMTC forhold til CC-genotypen (OR = 1,85, P = 0,042), mens der ikke statistisk signifikans blev nået med enten en recessiv model eller et gen dosering model (data ikke vist). For de andre autofagi genetiske varianter undersøgt, ingen statistisk signifikante forskelle blev observeret vedrørende modtagelighed for at udvikle NMTC med nogen af ​​de testede associationsmodeller, dvs. recessive, gendosis og dominerende modeller (tabel 3 og data ikke vist).

genotype – fænotype foreninger

Inden for NMTC patient kohorte, sammenhænge mellem genotype og tumorstørrelse (T fase), antal i

131 behandlinger, kumulative i

131 dosis, sygdomsstatus efter ablation og aktuelle status sygdom blev vurderet ved hjælp af Pearson χ

2 analyse. På

ATG5

rs2245214 enkelt-nukleotid polymorfisme resultaterne er afbildet i tabel 4. Der var ingen statistisk signifikante forskelle mellem patienterne i de forskellige genotypegrupperne med hensyn til TNM mellemstationer, antal RAI behandlinger, kumulative RAI dosis og aktuelle sygdomsstatus (tabel 4). Desuden blev der ikke foreninger observeret for nogen af ​​de andre undersøgte autofagi genetiske varianter med disse kliniske parametre (data ikke vist).

Diskussion

Den foreliggende undersøgelse blev udført for at undersøge, om fælles genetiske varianter i humane autofagi gener er forbundet med NMTC modtagelighed, sværhedsgrad og /eller klinisk resultat. Vi fandt, at en af ​​de udvalgte genetiske varianter,

ATG5

rs2245214 enkelt nukleotid polymorfisme, er signifikant associeret med NMTC modtagelighed, men ikke med NMTC alvor eller resultat. Endvidere blev ingen af ​​de andre udvalgte Autophagy SNPs associeret med enten modtagelighed for NMTC, sygdommens alvorlighed eller klinisk resultat.

Alle de undersøgte proteiner er involveret i autophagy maskiner, nogle i den tidlige fase af autophagosome dannelse (ATG2B, ATG5, ATG10, IRGM og WIPI1), de andre i den sene fase af autophagosome-lysosom fusion (LAMP1 og LAMP3) [22], [23]. I processen med autophagosome dannelse, er ATG5 rekrutteret til at deltage i et stort protein kompleks sammen med ATG12 og ATG16L1 at samle det dobbelte membran omgiver autophagic last [24], [25]. Autophagy er aktiv ved basale niveauer i alle celletyper, hvor det menes at spille en husholdning rolle i genbrug intracellulære komponenter.

Med hensyn til carcinogenese, rolle autophagy er kompleks og afhænger af typen af ​​cancer og den fase af sygdommen. Fejl i autophagy kan mediere carcinogenese gennem ophobning af protein aggregater og beskadigede organeller. På den anden side, i apoptotiske-kompetente celler autofagi er cytobeskyttende, da disse celler er afhængige af autofagi at dække deres øgede energiforbrug [9]. Trods den vigtige rolle autophagy for patogenesen af ​​cancer, er overraskende lidt kendt om den genetiske variation i Autophagy gener og dens indflydelse på carcinogenese. I den foreliggende undersøgelse vurderede vi virkningerne af en bred vifte af genetiske varianter i Autophagy gener for modtagelighed for og behandlingsresultater af differentieret epitelcelle afledt NMTC.

Den foreliggende genetiske association undersøgelse viste, at G-allel

ATG5

rs2245214 SNP er forbundet med øget modtagelighed for at udvikle NMTC. I modsætning hertil dette

ATG5

SNP var ikke associeret med NMTC sværhedsgrad og resultatet, som reflekteres af TNM mellemstationer, kumulative RAI dosis og sygdom vedholdenhed. Det faktum, at de genetiske varianter i de andre udvalgte autofagi gener ikke er forbundet med NMTC modtagelighed og sværhedsgrad i vores kohorte af NMTC patienter kunne indikere, at enten disse proteiner har ingen fremtrædende rolle i NMTC carcinogenese eller konsekvenserne af de genetiske varianter for funktionen af de respektive proteiner er relativt begrænset. Dog bør udføres replikation undersøgelser i andre NMTC kohorter til fast demonstrere manglende sammenslutning af disse genetiske varianter med NMTC modtagelighed og sværhedsgrad.

Genetisk variation i

ATG5

har tidligere været forbundet med systemisk lupus erythematosus (samme SNP) [26], [27], astma [19] og neurodegenerativ sygdom [28], hvilket indikerer den vigtige rolle, ATG5 i menneskers sundhed og sygdom. Men konsekvenserne af disse genetiske varianter af

ATG5

for proteinets funktion er stadig ukendt og garanterer yderligere undersøgelser, der bør også omfatte tidligere rapporteret ikke-autophagic funktioner ATG5 [29], [30].

Vores tidligere rapport af den genetiske sammenslutning af

ATG16L1

T300A polymorfi (rs2241880) med NMTC modtagelighed og sværhedsgrad [20] er nu udvidet med den påviste sammenslutning af

ATG5

rs2245214 polymorfi med NMTC modtagelighed i nærværende undersøgelse, der bekræfter rolle autophagy i NMTC patogenese. Notatet ingen additive virkninger af de to SNPs i

ATG5

ATG16L1

blev observeret, hvilket indikerer, at de to SNPs handle selvstændigt. Interessant, er både rolle autophagy i NMTC og det terapeutiske potentiale for at målrette autofagi til NMTC behandling bekræftes af andre undersøgelser [10], [31] -. [33]

Flere undersøgelser har vist den vigtige rolle, autophagy i NMTC patogenese, der repræsenterer en af ​​de mest fremtrædende nedstrøms veje i ofte afvigende reguleret RAS /RAF /MEK /ERK og PI3K /Akt /mTOR veje i NMTC, hvilket fører til inaktivering af autophagy maskiner [34], [35]. I overensstemmelse med disse undersøgelser, reaktivering af autophagy ved hæmning af mTOR kinase resulterer i resensitization af NMTC til kemo- og strålebehandling [33]. I modsætning hertil har også modsatrettede effekter af signalering gennem disse onkogener blevet beskrevet som aktiverer basale autophagy, med angivelse af de komplekse og kontekstafhængige virkninger af disse veje på autofagi [36] – [38]. Genetiske varianter af autophagy gener, der fører til enten mindre eller mere funktionel autophagy maskiner efterfølgende kan resultere i afskaffet terapi følsomhed og øget carcinogenese, hvilket giver en potentiel mekanisme bag de observerede genetiske foreninger. Yderligere undersøgelser er berettiget til at dissekere rolle autophagy i enten fremme eller hæmme carcinogenese og terapi følsomhed i forbindelse med NMTC undertyper at identificere de mest effektive målrettede behandlinger.

Et vigtigt punkt, der skal overvejes, er, at korrektion for multiple test i denne undersøgelse. Det skal tages i betragtning, at der ved anvendelsen korrektion for multiple test, er statistisk signifikans for

ATG5

rs2245214 SNP association med NMTC modtagelighed tabt. En anden begrænsning, der skal tages i betragtning, er de manglende datapunkter for den kliniske vurdering af TNM stageing, der er faldet den statistiske styrke til at demonstrere væsentlige forskelle. De opnåede i nærværende undersøgelse fund skal derfor bekræftes i større prospektive kohorter for at drage sikre konklusioner vedrørende den endelige rolle genetiske polymorfier beskrevet her. På trods af dette, er det ikke desto mindre vigtigt at bemærke, at den tidligere sammenhæng mellem

ATG16L1

og NMTC giver indirekte støtte til resultaterne af den foreliggende undersøgelse.

Som konklusion, vi har identificeret den

ATG5

rs2245214 genetisk variant som en genetisk modtagelighed faktor i skjoldbruskkirtlen carcinogenese. Disse resultater understreger det terapeutiske potentiale af modulation af ATG5 og ATG16L1, sandsynligvis som en del af autophagy maskiner, som en ny strategi behandling for NMTC patienter.