PLoS ONE: Transkriptomet Sekventering af Tumor subpopulationer afslører et spektrum af behandlingsmuligheder for planocellulært Lung Cancer

Abstrakt

Baggrund

De eneste terapeutiske muligheder, der eksisterer for planocellulært lunge karcinom (SCC) er standard stråling og kemoterapi. Kræft stamceller (CSCS) er en hypotese at redegøre for terapeutisk modstand, hvilket tyder på, at CSCS skal være specifikt målrettet. Her vi analysere transkriptom af CSC og ikke-CSC subpopulationer af RNA-seq at identificere nye potentielle terapeutiske strategier for SCC.

Metoder

Vi sorteres en SCC i CD133- og CD133 + undergrupper og derefter undersøgt både kopital analyse (CNA) og hele genomet og transkriptom sekventering. Vi analyserede Cancer Genome Atlas (TCGA) transkriptom data for 221 SCC’er at bestemme den generelle betydning af vores observationer.

Resultater

Begge subpopulationer stærkt udtrykt adskillige mRNA-isoformer, hvis protein produkter er aktive stof mål for andre cancere; 31 (25%) svarer til 18 gener undersøges aktivt som mAb mål og yderligere 4 (3%) er af terapeutisk interesse. Desuden fandt vi tegn på, at begge subpopulationer proliferatively var drevet af meget høje niveauer af c-myc og TRAIL lange isoform (TRAIL

L), og at normale apoptotiske reaktioner på høj ekspression af disse gener blev forhindret gennem høje niveauer af Mcl- 1

L og Bd-x

L og c-Flip

L-isoformer for hvilke stoffer nu er i klinisk udvikling. SCC-RNA-seq data (n = 221) fra TCGA støttede vores resultater. Vores analyse er i modstrid med CSC koncept, at de fleste celler i en kræft har mistet deres proliferative potentiale. Desuden er vores undersøgelse tyder hvordan til at målrette både CSC og ikke-CSC subpopulationer med en behandlingsstrategi.

Konklusioner

Vores undersøgelse er relevant for SCC især for det præsenterer en lang række potentielle muligheder for standard terapi, der målretter mod hele tumoren. Dermed er det viser, hvordan transkriptom sekventering giver indsigt i de molekylære fundament for kræft formerings celler, der, vigtigere, kan udnyttes til at identificere nye potentielle terapeutiske muligheder for kræft ud over, hvad der er muligt med DNA-sekventering

Henvisning.: Barrett CL, Schwab RB, Jung H, Crain B, Goff DJ, Jamieson CHM, et al. (2013) Transkriptomet Sekventering af Tumor subpopulationer afslører et spektrum af behandlingsmuligheder for planocellulært Lung Cancer. PLoS ONE 8 (3): e58714. doi: 10,1371 /journal.pone.0058714

Redaktør: Marc burg, Boston University Medical Center, USA

Modtaget: Oktober 17, 2012; Accepteret: 5 feb 2013; Udgivet: 20 mar 2013

Copyright: © 2013 Barrett et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af center for Translationel Science Award (UL1RR031980 og UL1TR000100) fra National center for Research Resources, tre tilskud (1R21CA152613-01, 1R21CA155615-01A1, CA69375) fra National Cancer Institute, fire tilskud fra California Institute for regenerativ medicin (CL1-00502, RT1-01108, TR1-01250, TR2-01789) og en bevilling fra National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme (P30 AI036214). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lungekræft udgør 28% af alle kræftdødsfald-den højeste procentdel af alle kræfttilfælde [1]. Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tegner sig for ~85-90% af lungekræft, hvoraf adenocarcinom og pladecellekræft er de mest almindelige undertyper [1]. Selvom op mod 70% af NSCLC patienter har fremskreden sygdom, der er sjældent helbredes, når diagnosticeret, nye fremskridt for delmængder af lunge adenokarcinomer, som skjuler EGFR mutationer eller EML4-ALK genfusioner fremme udviklingen af ​​målrettede behandlinger, der kan ændre denne alvorlige situation [2] . Disse genetiske ændringer forekomme primært i adenocarcinomer i patienter, der aldrig har røget, og er ualmindelige i SCC som hovedsagelig forbundet med rygning [3] – [5]. Mens FGFR1 [6] og DDR2 [7] har for nylig dukket op som potentielle terapeutiske mål for nogle SCC patienter, hæmmere har endnu ikke nået kliniske forsøg. Nylige NSCLC højt gennemløb sekventering undersøgelser primært fokuseret på at analysere DNA har vist, at nogle gener er muteret ved en tilstrækkelig høj frekvens til at være nyttige for målrettet terapi; men disse undersøgelser gør forudsige DNA ændringer, der ofte grupperet i et begrænset antal vigtige molekylære veje antyder, at målrette disse veje kan være en levedygtig terapeutisk strategi [8] – [12]. Deep transkriptom (RNA-seq) profilering af NSCLC at identificere gener med dereguleret udtryk, der er fælles mellem tumorer er endnu ikke blevet rapporteret, selv om sådanne rapporter skal forventes givet store RNA-seq datasæt fremkaldt af TCGA [13] og andre konsortier.

Kræftceller inden for en individuel tumor findes i forskellige fænotypiske stater, der ofte udviser funktionelle forskelle. En subpopulation af celler med selvfornyende og tumorfremkaldende kapaciteter, der almindeligvis omtales som cancer-stamceller-lignende celler (CSCS), er blevet identificeret i en række forskellige tumortyper, herunder NSCLC [14]. Montering tyder på, at CSCS er resistente over for anticancer behandlingsformer og ligger til grund for metastaser [15], [16], og dermed er den primære kræft celletype ansvarlig for tilbagefald og progression af maligne tumorer. Den umiddelbare konsekvenser er, at ved at målrette CSCS det bør være muligt at udrydde resistente og metastatisk subpopulation lægemiddel af en cancer [14]. nylige undersøgelser har imidlertid påvist, at CSC fænotypen er plast og kan rekonstitueres ved andre, ikke-CSC, tumorceller [17], [18]; således ikke bare CSCS men alle tumor subpopulationer, der er “potentiale CSCS” skal være målrettet. Transkriptom sekventering af CSC og ikke-CSC subpopulationer i NSCLC ville give indsigt i den molekylære basis underliggende deres fænotypiske ligheder og forskelle og lette identifikationen af ​​nye terapeutiske mål. Sådan analyse vil være et vigtigt og nødvendigt supplement til bulk tumor transkriptomet profilering udføres af TCGA og andre.

Observationerne, at ikke-CSCS kan således rekonstruere CSCS, og vice versa, tyder på, at de fænotypiske forskelle mellem disse delpopulationer skyldes epigenetisk snarere end genetiske forskelle. Derfor er exome og genom sekventering eksperimenter til formål at identificere somatiske mutationer forventes ikke at afsløre forskelle mellem sorterede CSC og ikke-CSC subpopulationer. På den anden side, transkriptom profilering, som er en udlæsning af epigenome (dvs. histon mærker og DNA-methylering, der regulerer ekspression), bør være en fremragende metode til profilering CSCS og ikke-CSCS at afsløre mekanistiske forskelle. Fordelen ved RNA-seq data over mikroarrays er evnen til at analysere isoform ekspressionsforskelle [19]. I kræftceller, kan alternative mRNA isoformer producere protein isoformer med dominant negativ aktivitet. Den patogene rolle kræft-specifikke isoformer er blevet grundigt demonstreret på tværs af alle aspekter af cellulær fysiologi, herunder celleadhæsion og metastase (CD44 og RON), cellevækst og tumorigenese (PKM2, MDM2, FGFR2, CRK, NUMB), cellecyklus (PYK ), angiogenese (VEGF), apoptose (GS3KB, CD95, Bcl-X, caspase-2, caspase-9), metabolisme (PK), og lægemiddelresistens (AR og MRP-1) [20] – [24]. Disse eksempler understreger fordelen ved isoform-niveau transkriptom oplysninger over hele genekspression til at få indsigt i de molekylære mekanismer bag CSC og ikke-CSC fænotypiske forskelle.

Her er vi rapporterer anvendelsen af ​​genomics teknologier til en SCC xenograft der blev sorteret i CSC og ikke-CSC subpopulationer baseret på CD133 markør (figur 1). CD133 (PROM1; Prominin-1) er en 5-transmembrant glycoprotein, anses for at være en markør for subpopulationen af ​​CSCS i begge undertyper af NSCLC [15], [25] – [27]. I NSCLC den CD133 + subpopulationen har vist sig at have højere tumorigent potentiale i SCID-mus, til at udtrykke højere niveauer af stemness gener og være mere modstandsdygtige over for konventionel kemoterapi end CD133- subpopulation [15]. Vigtigere, således at SCC xenograft ville være mere repræsentativ for den primære tumor, det var direkte podet som hakket primær tumor i NSG mus og blev aldrig dyrket

in vitro

. Whole-genom DNA-analyse afslørede, at kromosomerne fra CD133 + og CD133- subpopulationer var stærkt forstyrret på en meget lignende måde; dog som forventet tumoren ikke harbor klinisk handlingsrettede mutationer. Analyse af mRNA splejsning isoform udtryk profiler af CD133 + og CD133- subpopulationer resulterede i identifikationen af ​​SCC som en potentiel ny indikation for mange lægemidler, i øjeblikket under udvikling og foreslå en række yderligere nye lovende mål. Endelig analyse af The Cancer Genome Atlas (TCGA) offentligt tilgængelige transkriptom RNA-seq data for 221 SCC’er [28] støtter den generelle betydning af vores transkriptom fund for denne sygdom. Helt vores undersøgelse viser evnen til transkriptomet sekventering af sorterede cancer cellesubpopulationer at informere klinisk udvikling på måder, der ikke er mulige med DNA-sekventering.

Vi sorteres de humane tumorceller af en planocellulært lungecancer xenograft i CD133 + og CD133- subpopulationer. Vi derefter udført CNA analyse under anvendelse genotypebestemmelse arrays på mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) samt både CD133 + og CD133- subpopulationer. Vi sammenlignede genomerne af den CD133 + populationen og PBMC prøve at identificere somatiske mutationer. Endelig har vi udført hele transkriptom sekventering (RNA-seq) af CD133 + og CD133- delpopulationer at evaluere deres mRNA isoform udtryk forskelle og ligheder.

Metoder

Xenografting

En UCSD Menneskelige Research Protections Program Institutional Review Board (IRB) godkendte denne undersøgelse forud for eventuelle studiemæssige aktiviteter. Alle dyr eksperimentelle procedurer efterkommet Guide for pleje og brug af forsøgsdyr (Institute for Laboratory Animal Research, 1996) og blev godkendt af Global Research and Development Institutional Animal Care og brug Udvalg Pfizer. En 75-årig mand med en 30-pack-årige historie af rygning og en i øvrigt fundet lungeknude forudsat skriftlig dokumenteret informeret samtykke i henhold til denne IRB godkendt protokol før operation. Resektion afslørede en T1 moderat differentieret pladecellekarcinom. En del af hans resekterede frisk tumor blev taget for xenografting i NSG (nøjagtig stamme navn NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SzJ) mus (The Jackson Laboratory). Efterfølgende passager blev foretaget i CB17.Cg-PrkdcscidLystbg /CRL mus fra Charles River. Hakket frisk tumor blev blandet med Matrigel (BD Biosciences) og indsat subkutant. Musene blev observeret indtil palpable tumorer voksede og disse blev høstet til seriel implantation og studere. På to år følge op på emnet forblev uden kliniske eller røntgenologiske tegn på tilbagefald.

Isolering af RNA og DNA

Lysater fra CD133- /EpCAM + og CD133 + /EpCAM + sorteret prøver blev behandlet for RNA og DNA-ekstraktion ved anvendelse af Qiagen All Prep Mini Kit (Valencia, CA). Prøver blev bearbejdet i overensstemmelse med producentens anbefalinger. Ikke mere end fire bind blev læsset på en enkelt RNeasy Mini Spin kolonne. Total RNA-prøver blev evalueret for renhed og koncentration ved hjælp af Agilent 2100 Bioanalyzer på GeneChip Microarray Core.

RNA-sekventering

Total RNA fra både CD133- /EpCAM + og CD133 + /EpCAM + tumor subpopulationer ( ~230 ng hver) blev anvendt til at danne hele transkriptom biblioteker for sekventering på den faste platform følgende producentens anbefaling (Life Technologies, Carlsbad CA, USA). De RNA-prøver blev fragmenteret ved RNAse III og koncentreret under anvendelse RiboMinus koncentration Module (Invitrogen, Carlsbad CA, USA). RNA fragmenter blev ligeret til solid adapter blandinger og revers transkription udført. Oprensede cDNA’er blev størrelse valgt (150-250 bp) ved anvendelse af MinElute PCR-oprensningskittet (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA), og derefter amplificeret 15 cykler under anvendelse af fast 3′- og SOLID 5 ‘primere. Amplified cDNA blev oprenset ved anvendelse PureLink PCR Micro kit (Invitrogen, Carlsbad CA, USA), QC’ed af Bioanalyzer 2100 DNA 1000 kit (Agilent, Santa Clara, CA, USA), og kvantificeret ved anvendelse qubit’en 2,0 Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad CA, USA). De hele transkriptom biblioteker blev anvendt til fremstilling af faste template perler efter de faste Template Bead Forberedelse Guide og sekventeret ved hjælp af 50 × 25 parret ende protokol, for hver prøve generere mere end 500 M læste par pr prøve.

Computational analyse af RNA-seq data

Transkriptomet sekventering af CD133 + og CD133- subpopulationer produceret 529 M og 531 M 50 × 25 LÆS par hhv. Vi først justeret hele transkriptom parret ende læser til rRNA og tRNA gener under anvendelse udgave 0.6.4 f af afaste + BWA [29] og beholdt kun de par, hvor hverken læsning blev rettet ind, hvilket resulterer i datasæt bestående 77 M og 79 M læse par. Vi derefter justeret hvert sæt af tilbageholdt læste par med afaste + BWA til en brugerdefineret ikke-redundant database over mRNA isoformer konstrueret med programmet “cuffcompare” fra den version 0.9.3 af Manchetknapper softwarepakke (79) og alle isoform modeller i RefSeq [30], UCSC kendte gener [31], og Ensembl [32] databaser. Vi næste konverteret læse tilpasningen koordinater i mRNA isoformer database til hg19 genomiske koordinater ved hjælp af en brugerdefineret script. Ud fra disse alignments vi beregnede udtryk og differentieret udtryk statistik med “manchetknapper” og “cuffdiff” programmer Manchetknapper hhv. Når du bruger begge programmer brugte vi øvre kvartil normalisering og hg19 menneskelige genom henvisning sekvens for partiskhed korrektion. Vi beregnede, at 13,612 gener og 43,120 gen isoformer havde nogle ikke-nul niveau af ekspression i mindst et af de to subpopulationer. Figur S1 i Information S1 viser et histogram af disse præ-filtrerede isoform udtryk værdier i begge celle subpopulationer. Et flertal af disse tilfælde skyldtes læse kortlægning støj eller til “utæt” genekspression, som er af ukendt fysiologiske betydning [33], så vi anvendte minimale udtryk og læse kriterierne dækning ( 1 FPKM og 60% dækning) for at opnå en indledende isoform udtryk anslår i de to subpopulationer. Vi observerede, 3.844 gener med 7,558 mRNA-isoformer opfyldte disse minimale kriterier. At være meget sikker i vores udtryk og differentieret udtryk resultater, vi anvendte strenge filtrering til de oprindelige isoform udtryk skøn; vi begrænset vores analyse til mRNA-isoformer, der blev udtrykt ved et niveau på mindst 30 FPKM i en af ​​subpopulationer, og som var omfattet over mindst 60% af deres længde ved sekventering læser. Derudover, for en isoform at blive kaldt differentielt udtrykte, dets differentielle ekspression havde kaldt signifikante ved en FDR på 0,01 og at have ændret mindst fire gange mellem de to subpopulationer. Anvendelsen af ​​disse kriterier gav 572 gener havde mindst én isoform der var signifikant forskelligt udtrykt. Som et endeligt resultat, vi beregnet 671 af de 43,120 isoformer (1,6%) at være signifikant forskelligt udtrykte. Tabel S1 i Information S1 viser, hvordan disse tal ændre sig til forskellige FPKM og fold ændre kriterierne.

Resultater

Isolering af CSC og ikke-CSC subpopulationer

Vi isolerede humane CSCS ( CD133 + /EpCAM +) og ikke-CSCS (CD133- /EpCAM +) fra en planocellulært lungecancer xenograft anvendelse af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) og henholdsvis indsamlet i alt 9,19 × 10

4 (3,4%) og 2,18 × 10

6 (96,6%) levende celler, der svarer til de to subpopulationer (figur 2). For at vurdere kvaliteten af ​​vores slags, vi målte ekspressionsniveauer af CD133 isoformer (figur S2 i Information S1) i hele transkriptom data (beskrevet nedenfor) og observeret moderat udtryk for tre isoformer i CD133 + delpopulation og ingen påviselig niveau af udtryk i CD133 – delpopulation. Vi udførte en anden FACS for samme xenotransplantat isoleret fra et andet dyr og opnå et tilsvarende antal og andel af CD133 + og CD133- celler (Figur S3 i Information S1). Vores resultater viser, at vi er i stand til at sortere til rene CD133 + og CD133- subpopulationer og at CD133 + subpopulationen udgør en mindre del af cancercellerne i pladecelle lungetumor, hvilket er konsistent med tidligere publicerede undersøgelser [15], [26] .

(A) Levende celler viste forskellige populationer af enten mus CD45 /MHC i eller human EpCAM udtryk. (B) Isolering af humane CD133 + celler (rød) fra humane CD133- celler (grøn) og muse-positive celler (blå). (C) Reanalyse af cellepopulationer i panel B viser, at C133 + celler (rød) er 3,4% af EpCAM + befolkning.

Den mutations landskab af planocellulært lunge tumor subpopulationer

Vi udførte Copy Number Ændring (CNA) analyse af microarray (se resultater og metoder i Information S1) af kimcellelinje, CD133 + og CD133- DNA og fandt, at omkring halvdelen af ​​hele genomet i både CD133- og CD133 + subpopulationer var involveret i store CNA’er (Figur S4 i Information S1). Overlap analyse viste potentialet eksistens CNAs specifik for hver delpopulation, men ved manuel inspektion af alle CNAs og under hensyntagen til nøjagtigheden af ​​mikroarrays [34], kunne vi ikke trygt identificere forskelle. konkluderede vi, at kromosomerne i CD133 + og CD133- subpopulationer blev stærkt ændret i en stort set ikke kan skelnes måde. Derudover analyserede vi hele genomet sekvensdata af CD133 + subpopulationen og matchende germlinie DNA og konkluderede, at tumoren undersøgt indeholdt ingen klinisk handlingsrettede mutationer (tabel S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10 , S11, S12 i Information S2 og fig S8 i Information S1).

Evaluering af mRNA isoformer af gener, der koder celleoverfladeproteiner

Dereguleret ekspression af mRNA-isoformer kan resultere i dannelsen af ​​kræft- associerede celleoverfladeproteiner, der er potentielle antigene mål for terapeutiske monoklonale antistoffer. For at identificere sådanne mål, målt vi udtryk for 1.191 mRNA isoformer af 426 CD Molecule [35], 354 GPCR [36], og 212 ionkanal [36] gener (992 total gener). Vi begrænset vores analyse til isoformer, der var i det mindste moderat udtryk (30 FPKM) og dækket over mindst 60% af deres længde ved sekventering læser i et eller begge CD133 + og CD133- subpopulationer, hvilket giver en evaluering sæt af 124 isoformer der repræsenterer 80 gener (10,4% af de 1.191 isoformer og 8,0% af de 992 gener) (Figur 3; Tal S5A, S5B i Information S1). Af de 124 højt udtrykte isoformer, 43 (i 25 gener) har mindst fire ganges ekspressionsforskelle (FDR 0,01), med 24 viste reduceret og 19 viser forøget ekspression i CD133 + celler i forhold til CD133- celler (figur 3). Interessant, 31 (25%) af de 124 højt udtrykte isoformer svarer til 18 gener øjeblikket undersøges aktivt som lægemiddelmål for talrige cancere (specifikt ABCG2 [37], ADAM10 [38], ALCAM [39], [40], BSG [ ,,,0],41], CD151 [42], CD44 [43], CD47 [44], [45], CD9 [46] – [50], CEACAM5 [51], [52], CEACAM6 [52], CXCR4 [53], EPCAM [54], ERBB2 [55], ICAM1 [56], IGF1R [57], NRP1 [58], NT5E [59], TRPM7 [60]. af note, ABCG2 isoform (16X højere udtryk i CD133 + subpopulationen) og CXCR4 isoformen (4X højere udtryk i CD133 + subpopulationen) er tidligere blevet identificeret som biomarkører for lungekræft tumor initierende celler skånet af cisplatin behandling [15]. Ud over disse 18 gener under aktiv efterforskning som lægemiddel rettet mod to andre højt udtrykte gener -CD97 [61], og IFITM1 [62] -er blevet foreslået, men ikke aktivt forfulgt som terapeutiske antistof mål for primære eller metastatiske tumorer. Vi mener, at andre højt udtrykte celle-overflade gener vist i figur 3 også kan være potentielle lægemiddelkandidater. For eksempel er en isoform af DDR1, en homolog af DDR2 der er et lovende mål for SCC [7], er overudtrykt i CD133 + celler. ICAM4, som har en påvist rolle i carcinogenese og er placeret i 19p13.2 modtagelighed locus for flere cancertyper [63], [64], er også stærkt udtrykt. Da disse 22 celleoverflade gener af terapeutisk interesse koder for proteiner involveret i celle-celle interaktioner, celleadhæsion, migration og kemoresistens, deres udtryk ligheder og forskelle, her illustrerer, hvordan isoform-level analyser kan give et nyt niveau af information til både forståelse fysiologi og for målretning, specifikke tumor subpopulationer.

vist er ekspressionsniveauerne af 1.191 isoformer af 426 CD Molecule, 354 GPCR og 212 ionkanal-gener. Grå cirkler svarer til isoformer, der ikke opfylder vores mindste udtryk kriterier niveau og blå cirkler på isoformer, der gjorde, men var ikke signifikant forskelligt udtrykt. Farvede trekanter angiver betydeligt differentielt udtrykte isoformer; grønne ned peger trekanter viser dalende udtryk og røde up-peger trekanter tyder på øget ekspression i CD133 + celler. De diagonale grå linjer er fold ændre Clines. Isoformer diskuteres i teksten er navngivet. Bemærk, at CD133 /PROM1 ikke opfylder vores udtryk kriterium, der ligger til grund stringens i vores data filtrering; men er vist til sammenligning. Her bruger vi HGNC-godkendte gen symboler [96] og UCSC isoform betegnelser [31].

For at vurdere, i hvilken grad høj ekspression af de terapeutisk attraktive celleoverfladeproteiner beskrevet ovenfor for den undersøgte tumor er et almindeligt fænomen i SCC vi undersøgte TCGA transkriptom data for 221 skællede celle lungekræft [28], [65]. Vigtigt er TCGA sekventering udført på bulk-tumor, så forventes subpopulationen sammensætning at være helt anderledes end de CD133 + og CD133- subpopulationer af pladecellecarcinomet i vores undersøgelse. Den offentligt tilgængelige TCGA udtryk data analyseres ved exon-, splejsning junction-, og gen-niveau. Da der ikke er etableret måde at udlede isoform-niveau udtryk fra exon og splice junction udtryk, valgte vi at sammenligne vores isoform niveau ekspression anslår med TCGA gen ekspression skøn. Baseret på det faktum, at vores analyse med fokus på isoformer med høj ekspression, vi ræsonnerede, at hvis vores resultater er generelle SCC så ville vi observere høj ekspression af de tilsvarende hele gener på tværs et flertal af de 221 tumorprøver. Som vist i figur 4A, 4C, er de fleste af de 22 celleoverflade gener af terapeutisk interesse håndfast udtryk på tværs af alle 221 prøver med 12 placering i top 10% (median udtryk 31 RPKM) af de mest udtrykte gener. Interessant, ABCG2 og ICAM4, der har de to laveste ekspressionsniveauer for de 22 gener, blev overvejende udtrykt i CD133 + subpopulationen. Denne situation afspejler den for CD133 /PROM1 (figur 3), så vi spekulere, at den tilsyneladende lave tumor-dækkende ekspression af ABCG2 og ICAM4 er fordi de robust udtrykkes kun i CD133 + celler, som udgør en mindre del af tumorcellerne. Samlet set indikerer disse resultater, at vores resultater er generelle for SCC og så kunne påvirke den kliniske udvikling, fordi de identificerer denne sygdom som en potentiel ny indikation for mange lægemidler, der er under udvikling og foreslå en række yderligere nye lovende mål.

A) celleoverfladen og B) apoptose-relaterede hele genekspression estimater fra 221 lung pladecellecarcinom prøver. C) Fordelingen af ​​ekspressionsniveauerne estimeret for 20.533 gener per prøve, gennemsnit på tværs af alle 221 prøver. Den stiplede vandrette linje angiver den top 5% af gener, når sorteret efter udtryk.

Evaluering af mRNA isoformer af gener involveret i apoptose

I betragtning af omfanget af genomiske ændringer observeret i CNA analyse af det undersøgte SCC og de mange kendte celledød mekanismer, der reagerer på DNA-beskadigelse, vi mistanke om, at kræftcellerne skal har ændret ekspression af apoptose-relaterede gener for at overleve under så højt mutationel belastning. For at få indblik i overlevelse kapaciteten på CD133 + og CD133- subpopulationer, vi udførte en fokuseret udtryk analyse på et sæt af 106 apoptose-relaterede gener (Tabel S2 i Information S2), der tilsammen havde 434 mRNA isoformer. Som ovenfor begrænset vi vores analyse til isoformer, der blev udtrykt på niveau med mindst 30 FPKM og der var omfattet over mindst 60% af deres længde ved sekventering læser på en af ​​subpopulationer eller begge. Tredive af de 106 gener (28%) og 37 af de 434 isoformer (9%) opfyldte disse kriterier (figur 5; figur S6 i Information S1). Interessant kun 9 isoformer i 6 gener blev signifikant differentielt udtrykt med mindst fire-fold forskel mellem de to subpopulationer (FDR 0,01). Bemærkelsesværdige er den høje udtryk for en L-Myc isoform (MYCL1, uc001cer) og en XIAP isoform (XIAP, ucoo4etx) i begge subpopulationer, med fire gange opregulering i CD133 + og CD133- subpopulationer, hhv. L-Myc er en globalt virkende transkriptionsfaktor og af alle proteinerne i Myc familien (N-myc, c-Myc, og L-Myc) det har den stærkeste og mest specifik aktivitet i forbindelse med fremme human iPSC generation-formentlig gennem sin evne til at undertrykke differentierings-associerede gener [66]. XIAP er en velkendt suppressor af apoptose i tillæg til andre fysiologiske roller i forbindelse med dens E3 ubiquitin-ligaseaktivitet [67]. Også bemærkelsesværdigt er de få isoformer (dvs. BCLAF1 og BFAR isoformer) med 16x differential udtryk. BCLAF1, som har en isoform højt udtrykt kun i CD133- subpopulationen, spiller kritiske roller i mange processer [68], herunder lunge udvikling [69]. BFAR, en E3 ubiquitin ligase, der sandsynligvis medierer krydstale mellem de indre og ydre apoptotiske veje [70], har én isoform udelukkende udtrykt i CD133 + og en anden udelukkende i CD133-. Disse resultater antyder, at selv samlet de CD133 + og CD133- subpopulationer ligeledes udtrykke apoptose-relaterede gener, kan ekspressionsforskelle af isoformer af centrale apoptose gener delvis bidrager til selvfornyelse og overlevelse forskelle mellem disse cancer celletyper.

vist er ekspressionsniveauerne af 434 isoformer af 106 apoptose-relaterede gener. Grå cirkler svarer til isoformer, der ikke opfylder vores mindste udtryk kriterier niveau og blå cirkler på isoformer, der gjorde, men var ikke signifikant forskelligt udtrykt. Farvede trekanter angiver betydeligt differentielt udtrykte isoformer; grønne ned peger trekanter viser dalende udtryk og røde up-peger trekanter tyder på øget ekspression i CD133 + celler. De diagonale grå linjer er fold ændre Clines. Isoformer diskuteres i teksten er navngivet. Isoformer diskuteres i teksten er navngivet. Her bruger vi HGNC-godkendte gen symboler [96] og UCSC isoform betegnelser [31].

Vi fokuserede næste på de mest højt udtrykte apoptose-relaterede gener i både CD133 + og CD133- delpopulationer at få indsigt i overlevelsesmekanismer fælles mellem disse kræft celletyper. Dette fokuseret analyse viste c-myc (MYC, uc003ysi), og de lange isoformer af TRAIL /TNFSF10 (TNFSF10, uc003fid), Mcl-1 (MCL1, uc010pch), og Bcl-x (BCL2L1, uc002wwl) for at være blandt de mest højt udtrykte apoptose-relaterede gener (figur 5). Vi bekræftet ved RT-qPCR den høje ekspression af c-Myc, Mcl-1

L og Bcl-x

L i både CD133 + og CD133- subpopulationer (figur S7 i Information S1). Det er velkendt, at høje c-myc-ekspression potent inducerer den iboende (mitochondria-medieret) celledød pathway; dog samtidig høj ekspression af Mcl-1

L og Bcl-x

L kan sekvestrere de mitochondriale ydre membranproteiner Bak og Bax [71], [72], og derved blokere de apoptotiske konsekvenser af c-Myc. Sådan en rolle for Mcl-1

L og Bd-x

L er for nylig blevet påvist i 14 c-myc-drevne ikke-skællede celle lungekræft humane cellelinjer [73], i musemodeller af adenocarcinom lungekræft [74], og i andre sammenhænge malignitet [75]. Vore data implicerer Mcl-1

L og Bcl-x

L i at blokere de apoptotiske virkninger af c-Myc i både CSC og den ikke-CSC subpopulation af den undersøgte pladecellecarcinom. Vi bemærker, at mens de lange isoformer af Mcl-1 og Bcl-x har vist pro-overlevelsesfunktioner, de korte isoformer af disse gener, som ikke blev udtrykt, er pro-apoptotiske [76]. Høj ekspression af den lange isoform af TRAIL (TRAIL

L) i begge subpopulationer er væsentlig, idet denne cytokin er under undersøgelse som et anti-cancermiddel [77], fordi den selektivt kan dræbe tumorceller via receptor-medieret apoptose. Men langvarig udsættelse for høje niveauer af TRAIL

L kan resultere i TRAIL

L modstand, hvorefter TRAIL

L bliver en stærk inducer af spredning og metastaser [78]. Tidligere undersøgelser har vist både Mcl-1

L, og Bd-x

L at være ansvarlig for erhvervet TRAIL

L modstand i ikke-pladecellekræft lungekræft-cellelinjer [79] og i andre cancer cellelinjer [ ,,,0],80] – [83]. Notatet anden vigtig faktor for TRAIL modstand, c-Flip

L (CFLAR, uc002uxb) -den lange isoform af Flip /CFLAR der er en katalytisk inaktiv homolog af caspase-8-er også stærkt til udtryk i begge subpopulationer af vores studerede SCC (figur 5) [79], [84] – [87]. De korte isoformer af både TRAIL og c-Flip har også modsatrettede pro-apoptotiske roller i forhold til de lange isoformer [79], [88]. Helt vores isoform-niveau genekspression analyse viser, at i det undersøgte SCC både CD133 + og CD133- subpopulationer blev drevet af meget høje niveauer af c-myc og TRAIL

L og at den normale apoptotisk reaktion på den høje ekspression af disse gener blev forebygges gennem meget høje niveauer af Mcl-1

L og Bd-x

L og c-Flip

L.

Igen brugte vi TCGA transkriptom data for 221 skællede celle lungekræft til bestemme det generelle i vores apoptosegenet isoform analyseresultater. Som ovenfor til ABCG2 og ICAM4, tilskriver vi den tilsyneladende lave tumor-dækkende ekspression af L-Myc (MYCL1) (figur 4B, 4C) til den mulighed, at i SCC er det robust kun udtrykkes i CD133 + celler, som udgør en mindre del af tumorcellerne.