PLoS ONE: Humant Lipocalin-Type prostaglandin D syntase-Based Drug Delivery System for dårligt vandopløselige Anti-Cancer Drug SN-38

abstrakt

Lipocalin-typen prostaglandin D syntase (L-PGDS) er et medlem af superfamilien lipocalin, som er sammensat af sekretoriske transportproteiner, og binder til en lang række af små hydrofobe molekyler. Med denne funktion har vi rapporteret muligheden for at anvende L-PGDS som en ny lægemiddelafgivelsessystem køretøj til dårligt vandopløselige lægemidler. I denne undersøgelse viser vi udviklingen af ​​et lægemiddeltilførselssystem anvendelse af L-PGDS, en, som gør direkte kliniske anvendelse af 7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin (SN-38), en dårligt vandopløselig anticancerlægemiddel . I nærvær af 2 mM L-PGDS er koncentrationen af ​​SN-38 i PBS forøget 1.130 gange i sammenligning med den i PBS. Kalorimetriske forsøg viste, at L-PGDS bundet SN-38 på molekylært forhold på 1: 3 med en dissociationskonstant på 60 uM. Resultaterne af en

in vitro

vækstinhibering assay viste, at SN-38 /L-PGDS komplekser udviste høj antitumoraktivitet mod 3 menneskelige kræftceller, dvs., Colo201, MDA-MB-231, og PC-3 med en styrke svarende til den i SN-38 anvendt alene. Intravenøs indgivelse af SN-38 /L-PGDS komplekser til mus, der bærer Colo201 tumorer viste en udtalt anti-tumor virkning. Intestinale mucositis, hvilket er en af ​​bivirkningerne af dette stof, blev ikke observeret i mus administreret SN-38 /L-PGDS komplekser. Tilsammen L-PGDS muliggør direkte brug af SN-38 med reducerede bivirkninger

Henvisning:. Nakatsuji M, Inoue H, Kohno M, Saito M, Tsuge S, Shimizu S, et al. (2015) Humant Lipocalin-Type prostaglandin D syntase-Based Drug Delivery System for dårligt vandopløselige Anti-Cancer Drug SN-38. PLoS ONE 10 (11): e0142206. doi: 10,1371 /journal.pone.0142206

Redaktør: Han-Chung Wu, Academia Sinica, TAIWAN

Modtaget: August 10, 2015; Accepteret: 19 okt 2015; Udgivet: November 3, 2015

Copyright: © 2015 Nakatsuji et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Grants 25242046 (til TI), og 21.200.076 (TI) fra Japan Society for fremme af Science (http: //www .jsps.go.jp /engelsk /)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

De fleste forbindelser, der udviser anti-tumor aktiviteter er kendt for at være vand-uopløselige og have alvorlige bivirkninger på normale væv og organer, hvilket begrænser deres effektivitet og klinisk brug af dem [1]. Nogle almindelige metoder til at forbedre opløseligheden af ​​anti-cancer medicin er kemisk modifikation af narkotika og brugen af ​​solubiliseringsmidler såsom organiske opløsningsmidler, overfladeaktive stoffer, lipider, cyclodextrin og pH modifikatorer. Men den kemiske modifikation af narkotika falder, deres styrke i mange tilfælde. Brugen af ​​solubilisatorer er begrænset på grund af deres toksicitet og tendens til at forårsage drug ustabilitet. Således lægemiddelafgivelsessystemer (DDSs) til dårligt vandopløselige anticancerlægemidler, der gør effektiv brug af forskellige typer af nanostørrelse leveringsvehikel, såsom liposomer, polymer miceller og dendrimerer, er blevet undersøgt intenst [2-5]. Disse etablerede DDSs har dog også stødt på nogle problemer forbundet med toksicitet, immunogenicitet, hæmolyse, og thrombogenicitet [6, 7]. Derfor er der et presserende behov for at udvikle en ny DDS for dårligt vandopløselige kræftlægemidler; og dermed stor indsats har været fokuseret på at forbedre styrken, forbedre sikkerheden, og øge opløseligheden af ​​disse lægemidler.

Vi har tidligere rapporteret, at en roman DDS bruger lipocalin type prostaglandin D syntase (L-PGDS, fig 1A), et medlem af lipocalin familien protein og et ikke-toksisk og ikke-immunogent molekyle, kunne lette farmaceutiske og kliniske udvikling af dårligt vandopløselige forbindelser, såsom diazepam og 6-nitro-7-sulfamoylbenzo [f] quinoxalin -2,3-dion, til anvendelse ved enten oral eller intravenøs administration [8]. L-PGDS er en multi-funktionel protein, der fungerer som en PGD

2-producerende enzym [9], en ådselsæder af reaktive ilt arter [10], og en sekretorisk transportør protein til flere små lipofile molekyler [11]. Desuden nylig rapporterede vi, at L-PGDS fungerer som en scavenger af biliverdin, hvis nedbrydning produkter er involveret i aneurysmal subarachnoid blødning induceret vasospasme og neuronal celledød [12]. L-PGDS har en typisk lipocalin fold, der består af en otte-strenget antiparallel β-tønde, og det indre af denne cylinder danner en hydrofob hulhed [13-15], der kan binde en lang række lipofile ligander inden det [11, 16 ]

(A) Crystal struktur af human L-PGDS. (molekylmasse: 18777,7, FBF ID: 3O2Y). (B, C) Kemiske strukturer af SN-38 (relativ molekylmasse: 392,4) og CPT-11 (relativ molekylmasse: 677,2)

SN-38, 7-ethyl-10-hydroxy. -camptothecin (fig 1B), er en semi-syntetisk analog af anti-cancer alkaloid camptothecin, der er målrettet DNA topoisomerase i [17]. Men på trods af sin potente anti-tumor aktivitet, SN-38 er ikke blevet anvendt direkte i klinisk praksis på grund af dens ringe vandopløselighed [18]. Desuden lactonringen af ​​SN-38 viser reversibel pH-afhængig hydrolyse, og ved pH under 5,0, SN, 38 findes i en aktiv form med en nær lactonring i sin struktur, mens det kan omdannes til en inaktiv carboxyleret formular ved fysiologisk pH ved åbning af ringen [19]. Således er det vanskeligt at anvende SN-38 under en fysiologisk tilstand. Derimod irinotecan hydrochlorid (CPT-11, fig 1C), som er et vandopløseligt prodrug af SN-38, anvendes i kombination med fluoropyrimidin som første-line terapi for patienter med fremskreden kolorektal cancer [20]. Men den kemiske modifikation af SN-38 falder, dets anti-tumoraktivitet, hvilket fører til 1.000 gange mindre cytotoksiske aktivitet af CPT-11 sammenlignet med den for SN-38 mod forskellige cancercellelinier

in vitro

[21 , 22]. Således kan den direkte anvendelse af SN-38 som en aktiv form ved hjælp af DDS være stor fordel for kræftbehandling.

Her har vi detaljeret udvikling af en DDS under anvendelse af humant L-PGDS, en, der gjorde det muligt for direkte anvendelse af SN-38. Vi undersøgte virkningen af ​​L-PGDS på opløseligheden af ​​SN-38 og undersøgt vekselvirkningen mellem L-PGDS og SN-38 ved anvendelse af isotermiske titrering kalorimetri (ITC) og små-vinkel røntgenspredning (SAXS). Den cytotoksiske aktivitet af SN-38 /L-PGDS komplekser blev vurderet ved anvendelse af human colorektal, bryst og prostata cancercellelinjer. Deres anti-tumor aktivitet blev undersøgt i Colo201 menneskelige kolorektal tumor xenograft model. For at estimere de bivirkninger af disse komplekser, udførte vi histopatologisk analyse og målt ekspressionsniveauerne af inflammatoriske cytokiner i tyndtarmen. Endelig har vi udført anafylaksi test til bedømmelse den immunogene styrke af L-PGDS. Resultaterne, tilsammen demonstrerede human L-PGDS at være en potent drug delivery køretøj for SN-38.

Materialer og metoder

Materialer

SN-38 blev købt fra Tokyo Chemical Industry Co Ltd (Tokyo, Japan); og CPT-11, fra Yakult Honsha Co., Ltd (Tokyo, Japan).

Rensning af rekombinant human L-PGDS

C65A /C167A (ε

280 = 25.900 M

-1 cm

-1) -substitueret L-PGDS blev udtrykt som en glutathion

S

transferase fusionsprotein i

Escherichia coli

BL21 (DE3; TOYOBO, Osaka, Japan) som beskrevet tidligere [16]. Fusionsproteinet var bundet til glutathion Sepharose 4B (GE Healthcare Bio-Sciences, Little Chalfont, UK) og inkuberet natten over med 165 enheder af thrombin til at frigive L-PGDS. Det rekombinante protein blev yderligere oprenset ved gelfiltreringskromatografi med HiLoad 26/600 Superdex 75-(GE Healthcare Bio-Sciences) i 5 mM Tris-HCI-buffer (pH 8,0) og blev derefter dialyseret mod phosphatbufret saltvand (PBS).

Opløselighed målinger

En overskydende mængde af SN-38 blev tilsat til PBS-buffer (pH 7,4). SN-38 /PBS suspensionen blev præinkuberet ved 37 ° C i 30 minutter, og derefter blandet med en L-PGDS opløsning. Denne opløsning blev derefter omrørt ved 37 ° C i 6 timer og derefter koncentreret ved anvendelse af et Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (Millipore Corporation, Bedford, MA). Absorptionsspektret af filtratet blev opnået ved anvendelse af en 1,0 cm-lysbanen kvartskuvette og DU800 spektrometer (Beckman Coulter, Pasadena, CA). Koncentrationerne af SN-38 blev bestemt spektroskopisk baseret på den molære absorptionskoefficient ε

380 i DMSO for SN-38 = 20.985 M

-1 cm

-1.

Isotermisk titrering kalorimetri (ITC) målinger

Kalorimetriske eksperimenter blev udført med en MicroCal VP-ITC instrument (GE Healthcare Bio-Sciences), med prøven i PBS-buffer (pH 7,4) indeholdende 5% DMSO (vol /vol) ved 37 ° C. L-PGDS (840 uM) i injektionssprøjten blev revers-titreret i 50 mM SN-38 i cellen. Titreringsforsøg bestod af 50 injektioner anbragt med 300-sec intervaller. Injektionsvolumenet var 2 eller 5 pi for hver injektion, og cellen blev kontinuert omrørt ved 286 rpm. Den tilsvarende varme fortynding af L-PGDS titreret i bufferen blev brugt til at korrigere dataene. De termodynamiske parametre blev evalueret ved hjælp af en række uafhængige bindingssteder model leveret af MicroCal Origin 7.0 software.

Small-angle X-ray spredning (SAXS) målinger

SN-38 /L-PGDS komplekser i PBS-puffer blev ført gennem et filter for at fjerne de uopløselige forbindelser. Koncentrationen af ​​hvert prøveprotein blev tilpasses SAXS eksperimenter (3,0 mg /ml til 12,0 mg /ml). SAXS data blev indsamlet på stråle line BL40B2 på Spring-8 (den synkrotronstrålingsfacilitet, Hyogo, Japan), og alle eksperimentelle procedurer var de samme som tidligere [23] beskrevet. To-dimensionelt optaget spreder mønstre blev konverteret til endimensionale profiler ved cirkulær gennemsnit. Bidrag til spredning intensiteter fra opløsningsmidlet blev elimineret fra de rå data ved at fratrække intensiteten kurven opnået for bufferopløsning. For at beregne den inertiradius for hvert protein blev spredningen profil analyseret af Guinier s tilnærmelse som beskrevet i litteraturen og i vores tidligere rapport [23]. På hvert trin, blev den interpartikulært interferens og effekten af ​​sammenlægning i prøven omhyggeligt fjernet.

Cell kultur

Menneskelig coloncancercellelinie Colo201 blev købt fra Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japan); og human cellelinje brystcancer MDA-MB-231, fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Human prostatacancer-cellelinie PC-3 blev venligst stillet til rådighed af Prof. R. Yamaji (Osaka Prefecture University, Osaka, Japan). Colo201 og PC-3-celler blev dyrket i RPMI 1640 (Wako, Osaka, Japan) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% Antibiotika-antimycotisk (Life Technologies, Carlsbad, CA), hvorimod MDA-MB-231-celler var dyrket i D-MEM (Wako) indeholdende 10% FBS.

In vitro

vækstinhibering assay

virkningerne af SN-38 /L-PGDS komplekser, sn 38, og CPT-11 på tumorcellevækst blev undersøgt ved at udføre WST-8 assay (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan). Colonadenocarcinom-afledte Colo201, brystadenocarcinom-afledte MDA-MB-231, og prostataadenokarcinom-afledte PC-3-celler blev anvendt i dette assay. Disse celler blev podet i 96-brønds plader ved densiteter på 5 × 10

3 celler /brønd til 8 × 10

3 celler /brønd. Efter en 24-h dyrkning, blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af SN-38 /L-PGDS komplekser, SN-38 eller CPT-11 i 48 timer, og derefter blev WST-8-opløsning blev tilsat dyrkningsmediet. Derefter blev cellerne inkuberet i 3 timer ved 37 ° C. Absorbansen af ​​produceret formazan fra WST-8 blev målt ved 450 nm ved anvendelse af en mikropladelæser, Model 680 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Animal undersøgelse Salg

Alle mus anvendes i denne undersøgelse blev indkøbt fra Japan SLC Inc. (Shizuoka, Japan). Musene blev opstaldet på en 12-h /12-timers lys-mørke tidsplan med mad og vand til rådighed

ad libitum

for 1 uge til at kunne gendanne fra stress af transport. Alle dyr eksperimentelle procedurer blev godkendt af Osaka Prefecture University Animal Care og brug Udvalg (Permit nummer: 21-135). Alle operationer blev udført under isofluran anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

In vivo

væksthæmning assay

Fem uger gamle BALB /c nøgen mus blev injiceret subkutant i højre flanke med 5 × 10

6 Colo201 celler. Når tumorvolumenet havde nået 150 mm

3, disse mus blev tilfældigt inddelt i 6 testgrupper. SN-38 /L-PGDS komplekser i en dosis på 1,0, 2,0 eller 2,8 mg /kg /d, CPT-11 i en dosis på 4,0 eller 20 mg /kg /d, eller PBS alene blev administreret intravenøst ​​hver anden dag i 2 uger. Længden (a) og bredde (b) af tumoren og legemsvægten blev målt hver dag, og tumorvolumen blev beregnet som 1/2 (a × b

2). Salg

Patologiske undersøgelser på tyndtarmens slimhinde

PBS eller SN-38 /L-PGDS komplekser i en dosis på 2,8 mg /kg /d blev administreret intravenøst ​​til 5 uger gamle ddY-mus i samme dosis tidsplan som dem, der anvendes i væksten inhiberingsassay

in vivo

. På dag 15 efter den første indgivelse blev musene aflivet; og deres tyndtarme blev derefter isoleret. Prøverne blev fikseret i 10% formalin, dehydreret, og indlejret i paraffin, hvorefter afsnit af 5-um tykkelse blev fremstillet og farvet med hematoxylin-eosin.

Real-time RT-PCR-analyse

Totalt RNA blev ekstraheret fra tyndtarmen ved hjælp RNAiso Plus (Takara, Shiga, Japan) ifølge fabrikantens protokol. RNA’et blev revers-transkriberet med reagenserne ifølge en PrimeScript RT reagenskit (Takara). Real-time PCR-analyse blev udført ved hjælp af THUNDERBIRD

® qPCR Mix (TOYOBO), og forstærkning blev overvåget med en termisk cykliseringsapparat Dice

® Real Time System II (Takara). Primere anvendt til denne analyse er anført i S1 tabel.

anafylaksi test

Seks uger gamle ddY-mus blev sensibiliseret med enten kyllingeovalbumin (OVA, Sigma, Tokyo, Japan) eller L -PGDS. OVA (2 mg /ml) eller L-PGDS (2 mg /ml) blev suspenderet i en ækvivalent mængde på 13 mg /ml aluminiumhydroxid (Sigma) som en adjuvans, og suspensionen (100 pi) blev administreret subkutant i hver mus . Efter 14 dage blev enten OVA eller L-PGDS (1 mg /ml) intravenøst ​​og legemstemperaturen blev derefter overvåget ved anvendelse af en thermofocus ikke-kontakt infrarødt termometer, THERMOFOCUS (TECNIMED srl, Varese, Italien).

Statistisk analyse

data blev analyseret ved hjælp af Students

t

prøve, når grupperne viste ens varianser (F test) eller med Welch prøve, når de viste ulige varianser (F test). Resultaterne blev betragtet som signifikante på signifikansniveauet 5% (

P

0,05). Alle statistiske tests var tosidet.

Resultater

Forbedring af opløseligheden af ​​SN-38 ved L-PGDS

For at undersøge effekten af ​​L-PGDS på opløseligheden af SN-38, målte vi koncentrationen af ​​SN-38 i PBS med eller uden L-PGDS. SN-38 kunne opløses i PBS kun op til 1,5 uM uden L-PGDS. Men når 2 mM L-PGDS sattes til PBS, opløseligheden af ​​SN-38 øges op til 1.700 uM, hvilket var 1.130-fold sammenlignet med den i PBS. Desuden har vi udført ITC og SAXS målinger for at undersøge den nærmere bindende form for SN-38 til L-PGDS. I ITC målinger ved titrering L-PGDS til SN-38, vi har registreret exoterme reaktioner, der er angivet gunstige entalpi ændringer efter binding (Fig 2A, øverste panel). Efter medtagelse af hvert topareal, det integrerede varme opnået for binding til SN-38 blev plottet mod det molære forhold ([L-PGDS] /[SN-38]) (Fig 2A, nedre panel). Bindingen isoterm blev tilpasset ved anvendelse af en-sæt uafhængige bindingssteder model, og resultaterne viste, at L-PGDS dannet et 1: 3-kompleks med SN-38 med en dissociationskonstant (

K

d ) værdi af SN-38 for L-PGDS på 60 ± 4,0 uM. Værdierne af enthalpi forandring og entropi sigt for binding SN-38 til L-PGDS var -17 ± 0,13 og -8,5 ± 0,22 kJ /mol, hhv. Disse resultater viste, at interaktionen mellem L-PGDS og SN-38 var enthalpi-drevet. Dernæst i SAXS målingerne, spredningsintensiteten kurver af L-PGDS og SN-38 /L-PGDS komplekser viste, at L-PGDS og SN-38 /L-PGDS komplekser var monodisperse uden at vise nogen aggregering op til proteinkoncentration på 640 pM (fig 2B). Disse kurver var ens, men naturligvis kun anderledes i den lille vinkel region (en gensidig vektor (

S

) 0,02 Å

-1, figur 2b, indsat). Værdierne af inertiradius af L-PGDS og SN-38 /L-PGDS komplekset blev beregnet til at være 18,1 ± 0,09 og 16,5 ± 0,20 Å hhv. Disse resultater viste, at strukturen af ​​L-PGDS krympede når proteinet bundet SN-38.

(A) Kalorimetrisk titrering af SN-38 med L-PGDS. L-PGDS i injektionssprøjten blev omvendt titreret til SN-38 i cellen. Den øvre panel viser ændringen i varme over tid som L-PGDS blev titreret ind i SN-38. Det nedre panel viser normaliserede ændringen i varmekapacitet efter subtraktion referencedata for L-PGDS injektioner i PBS. Den ene-sæt uafhængige bindingssteder model blev anvendt til at passe de bindende isotermer. (B) SAXS profiler af L-PGDS (rød linje) og SN-38 /L-PGDS kompleks (blå linje). Disse profiler blev opnået ved at ekstrapolere alle data ved forskellige koncentrationer (12, 9,0, 6,0, og 3,0 mg /ml) i fusionen nul. Logaritmen til spredningsintensitet er vist som en funktion af den reciprokke vektor (

S

). Det indsatte viser logaritmen til spredning intensitet i den lille

S

region.

In vitro

væksthæmning assay

For at undersøge den inhibitoriske virkning af SN-38 /L-PGDS kompleks på cellevækst

in vitro

målte vi antitumoraktiviteten af ​​SN-38 /L-PGDS komplekser mod 3 humane cancercellelinier, Colo201, MDA-MB-231 og PC-3, ved at udføre WST-8-assays. SN-38 /L-PGDS komplekser, SN-38, og CPT-11 blev separat opløst i PBS og fortyndet med dyrkningsmedium til de passende koncentrationer. Alle prøver reducerede cellelevedygtigheden af ​​alle 3 cancercellelinier i en koncentrationsafhængig måde (figur 3). Den beregnede IC

50 værdier er opsummeret i tabel 1. IC

50 værdier af SN-38 /L-PGDS komplekser på væksten af ​​Colo201, MDA-MB-231 og PC-3-celler var 35 ± 6,5, 900 ± 190 og 10 ± 1,5 nM, hvilket viser, at komplekset var mest potente mod PC-3-celler. I modsætning hertil de af CPT-11 på væksten af ​​Colo201, MDA-MB-231, PC-3-celler var 26 ± 4,1, 35 ± 5,2, og 9,8 ± 0,75 uM. Således er de inhiberende virkninger af disse SN-38 /L-PGDS-komplekser på cellevæksten var 39- til 980-fold mere potent end CPT-11. Derudover IC

50 værdier af SN-38 til inhibering af væksten af ​​Colo201 og PC-3-celler var 15 ± 0,66 og 18 ± 2,4 nM, svarer til dem i SN-38 /L-PGDS kompleks. Således SN-38 udviste høj cytotoksisk aktivitet, når det var muligt at solubiliseres i vand. I tilfælde af MDA-MB-231-celler, SN-38 ved 1 uM, maksimal koncentration i PBS, nedsatte cellelevedygtighed kun til ca. 80%, og dermed IC

50 værdi af SN-38 kunne ikke være opnået (fig 3B). Disse resultater viste, at den /L-PGDS kompleks SN-38 havde en lægemiddel styrke svarende til den for SN-38 alene.

Dataene er udtrykt som middelværdi ± SE. (

n

= 6).

In vivo

væksthæmning assay

Vi evaluerede anti-tumor aktivitet SN-38 /L-PGDS komplekser i mus, der bærer Colo201 tumorer. Fig 4A viser virkningen af ​​intravenøse administrationer af SN-38 /L-PGDS komplekser på tumoren i BALB /c nøgne mus der bærer tumoren i deres højre flanke. PBS-administrerede gruppe viste en gradvis stigning i tumor volumen, nåede 572 ± 62,8 mm

3 på dag 15 efter den første administration af PBS. I CPT-11-administreret gruppe (4,0 mg /kg /d), tumor steg hurtigt i en dag-afhængig måde og nåede 555 ± 31,3 mm

3 på dag 15 efter den første administration af CPT-11, viser ingen antitumoraktivitet. Dette mønster af dagen-afhængig stigning var den samme som for de PBS-behandlede mus, der anvendes som kontrol. I modsætning hertil selvom tumorvækst i mus behandlet med en høj dosis af CPT-11 (20 mg /kg /d) var næsten den samme som observeret i PBS-behandlede mus på dag 6 efter første administration, væksten bagefter var inhiberet. Tumorvolumenet var signifikant forskellig fra den for PBS-indgivne gruppe efter dag 11 og nåede 231 ± 36,5 mm

3, hvilket er 40,4% af det i PBS-indgivne gruppe på dag 15 efter den første administration. På den anden side, selv om tumorvækst i mus behandlet med SN-38 /L-PGDS komplekser i en dosis på 1,0 mg /kg /d var også næsten den samme som observeret i PBS eller CPT-11-behandlede mus ved dag 4 efter første administration, væksten bagefter var hæmmet. Tumorvolumenet var signifikant forskellig fra den for PBS-indgivne gruppe efter dag 11 og nåede 301 ± 37,9 mm

3, hvilket er 52,6% af det i PBS-indgivne gruppe på dag 15 efter den første administration. Desuden i musene behandlet med SN-38 /L-PGDS komplekser i en dosis på 2,0 mg /kg /d (hvilket er en ækvimolær dosis af CPT-11 i en dosis på 4,0 mg /kg /d) eller ved 2,8 mg /kg /d blev tumorregression observeret efter dag 4. efter dag 8, tumor volumen af ​​musene behandlet med SN-38 /L-PGDS komplekser i en dosis på 2,0 mg /kg /d eller 2,8 mg /kg /d var signifikant lavere end den, der ses i PBS-administrerede gruppe, nåede 249 ± 19,9 og 212 ± 36,9 mm

3, henholdsvis, hvilket var 43,5 og 37,1%, henholdsvis af, at der i PBS-administrerede gruppe på dag 15 efter den første administration. Således viste /L-PGDS kompleks SN-38 signifikant og dosisafhængig antitumorvirkning. I SN-38-indgivet gruppe (0,0029 mg /kg /d, og dens maksimale koncentration i PBS), dog tumorvolumen øget i en dag-afhængig måde med tumorvækst svarende til den i PBS-eller CPT-11 administreret gruppe (4,0 mg /kg /d) og nåede 536 ± 79,6 mm

3 på dag 15 efter første administration (data ikke vist). Disse resultater viste, at SN-38 /PBS løsning haft nogen væsentlig anti-tumor aktivitet

in vivo

. Endvidere for at vurdere bivirkningerne af den /L-PGDS kompleks SN-38, indspillede vi legemsvægt musene dagligt under behandlingen (fig 4B). I PBS-administreret gruppe blev kroppen vægtændring ikke observeret. I CPT-11-administreret gruppe (20 mg /kg /d), dog blev vægttab observeret, og ikke komme til normalt niveau på day15 efter den første administration. På den anden side, i SN-38 /L-PGDS komplekser-administrerede grupper, den betydelige vægttab blev ikke observeret inden for 15 dage efter administrationen. Disse resultater tilsammen tyder på, at intravenøs administration af SN-38 /L-PGDS komplekser med en lav dosis viste højere anti-tumor aktivitet end CPT-11.

(A) Tumor mængder PBS, CPT-11-, og SN-38 /L-PGDS kompleks administreret grupper. Colo201 celler blev inokuleret subkutant i den højre flanke af mus. PBS, CPT-11 i en dosis på 4,0 eller 20 mg /kg /d, eller SN-38 /L-PGDS-komplekser i en dosis på 1,0, 2,0 eller 2,8 mg /kg /d blev indgivet intravenøst ​​en gang hver anden dag til 2 uger. *

P

0,05, **

P

0,01 sammenlignet med PBS. (B) Ændring i kropsvægt af mus efter hver behandling. *

P

0,05, **

P

0,01 sammenlignet med PBS. Fejlsøjlerne af SN-38 /L-PGDS kompleks-indgivne gruppe i en dosis på 2,8 mg /kg /d er udtrykt som middelværdi ± SE for 4 uafhængige eksperimenter; og dem af de andre, som middelværdien ± SE for 6 uafhængige eksperimenter.

Evaluering af intestinal toksicitet SN-38 /L-PGDS kompleks

Det er velkendt, at en af ​​de store kliniske bivirkninger af CPT-11 er alvorlig diarré [24, 25]. Adskillige rapporter har vist, at indgivelsen af ​​CPT-11 inducerer intestinale mucositis karakteriseret ved tab af krypt arkitektur og produktionen af ​​inflammatoriske cytokiner [26, 27]. Således har vi undersøgt ved histopatologisk analyse og måling af ekspressionsniveauerne af forskellige inflammatoriske cytokiner i tyndtarmen, om disse bivirkninger af CPT-11 blev manifesteret ved den /L-PGDS kompleks SN-38 (fig 5). Musene intravenøst ​​indgivet SN-38 /L-PGDS komplekser i en dosis på 2,8 mg /kg /d ved anvendelse af den samme dosis skema som anvendt til dyrkning inhiberingsassay viste ingen diarré. De histologiske observationer af tarmslimhinden demonstrerede bevarelsen af ​​villi og crypt arkitektur, som var magen til den, der ses i PBS-indgivet gruppe (Fig 5A), hvilket viser, at /L-PGDS kompleks SN-38 ikke inducerede tarm læsioner. Desuden ekspressionsniveauerne af interleukin-6 (IL-6) og interleukin-1β (IL-1β) i tarmene af musene administreret SN-38 /L-PGDS komplekser var uændret sammenlignet med dem for musene administreret PBS ( 1,3-og 1,0-fold, henholdsvis, fig 5B). På den anden side, i tarmene af mus administreret lipopolysaccharid, som en positiv kontrol, blev observeret opregulering af IL-6 og IL-1β (data ikke vist). Således disse resultater viste, at administration af den /L-PGDS kompleks SN-38 ikke viste nogen bivirkninger såsom intestinale mucositis.

(A) Histologi af ileal mucosa. Indsatte viser villi arkitektur. Scale bar repræsenterer 100 um. Det venstre panel viser ileal slimhinde af musene administreret SN-38 /L-PGDS komplekser; og den rigtige, der af musene administreret PBS. Den ileal slimhinde i begge grupper var næsten den samme. (B) Ekspressionsniveauer af inflammatoriske cytokiner i ileal slimhinde. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD (

n

= 3).

Evaluering af immunogene styrke af human L-PGDS

Endelig har vi vurderet, at uanset om human L-PGDS var immunogent eller ikke for mus (Fig 6). Kropstemperaturen af ​​OVA-sensibiliserede mus efter intravenøs administration af OVA hurtigt faldt. Dette fald i legemstemperatur ikke komme sig i op til 60 min efter indgivelsen. På den anden side, har kropstemperaturen af ​​humane L-PGDS-sensibiliserede mus efter intravenøs administration af humant L-PGDS ikke falde. Disse resultater viste, at L-PGDS ikke forårsagede nogen anafylaksi reaktioner i disse mus.

Ændring i kropstemperatur af mus. Mus blev sensibiliseret med OVA eller L-PGDS og derefter udfordret med OVA (○) eller L-PGDS (●). Kropstemperaturen blev målt i 60 min. Dataene er udtrykt som gennemsnit ± SE af 6 uafhængige forsøg.

Diskussion

I denne undersøgelse viste vi muligheden for at anvende menneskelig L-PGDS som en ny drug delivery køretøj for SN-38, en dårligt vandopløselig anticancerlægemiddel. Opløselighedsegenskaber målinger viste, at koncentrationen af ​​SN-38 var signifikant forbedret i nærvær af L-PGDS. Desuden er resultaterne af

in vitro

vækstinhibering assay viste, at /L-PGDS kompleks SN-38 viste en potent anti-tumor aktivitet, og at den komplekse formulering ikke påvirkede lægemidlet styrke af SN-38 . Desuden er resultaterne fra

in vivo Salg eksperimenter viste, at intravenøs administration af SN-38 /L-PGDS komplekser resulterede i en udtalt antitumoraktivitet uden de typiske bivirkninger af SN-38 som intestinal mucositis. Disse resultater viste, at komplekset formulering under anvendelse af human L-PGDS nu gør det muligt at anvende SN-38 til behandling af cancer.

SN-38 har et virkningsfuldt anti-cancer-aktivitet mod forskellige cancercellelinier, såsom colorektal, lunge, pancreas, og æggestokkræft celle [21, 22], men det har ikke været anvendt klinisk på grund af dets dårlige opløselighed i vand og farmaceutisk acceptable opløsningsmidler, såsom ethanol. Selvom CPT-11, et vandopløseligt prodrug af SN-38, alternativt anvendes til behandling af colorektal cancer, den metaboliske omdannelse sats er under 10% og afhænger af den genetiske variation i form af carboxylesterase aktivitet [28, 29]. Derfor er det nødvendigt at administration af en høj dosis CPT-11 til opnåelse af den forventede terapeutiske virkning (Fig 4A) [30]. Imidlertid multipel dosering med en stor mængde af CPT-11 er begrænset på grund af de alvorlige bivirkninger. Den dosisbegrænsende toksicitet CPT-11 administration er velkendt at resultere i de intestinale mucositis karakteriseret ved alvorlig diarré [24, 25]. I den foreliggende undersøgelse viste vi, at intravenøs indgivelse af SN-38 /L-PGDS komplekser med en lav dosis viste en udtalt anti-tumor aktivitet sammenlignet med den af ​​CPT-11 (Fig 4A). Desuden afslørede histologisk analyse, at tarmslimhinden af ​​mus behandlet med SN-38 /L-PGDS komplekser i en dosis på 2,8 mg /kg /d ikke viste afkortet villi eller tab af krypt arkitektur (Fig 5A), som er en af ​​de tegn på intestinal mucositis. Endvidere mRNA-niveauer af inflammatoriske cytokiner såsom IL-6 og IL-1β i tarmene af mus administreret SN-38 /L-PGDS komplekser lignede dem af mus injiceret med PBS (Fig 5B). Således har vi demonstreret, at den direkte anvendelse af SN-38 som et kompleks med L-PGDS viste en antitumoraktivitet uden at fremkalde uønskede bivirkninger, såsom intestinale mucositis.

Hidtil forskellige tilgange til at solubilisere sn 38 er blevet rapporteret, ved fx at bruge makromolekylære prodrugs og nanomedicin formuleringer såsom liposomer og polymere miceller [18]. Men disse metoder involverer multiple og komplicerede reaktioner; og der kræves anvendelse af toksiske organiske opløsningsmidler. For eksempel er EZN-2208, et vandopløseligt makromolekylært prodrug af SN-38, produceret af komplicerede trin, herunder overnight reaktioner [31]. En chlorin-core stjerneformet blokcopolymer micelle, som er en nanostørrelse fotosensibiliserende middel, der kan indkapsle SN-38, blev fremstillet ved anvendelse af en lyofilisering-hydrering metoden [32]. Men denne frysetørring proces er tidskrævende; og endvidere denne fremgangsmåde kræver anvendelse af organisk opløsningsmiddel, såsom dimethylsulfoxid. Således toksiciteten af ​​resterende organiske opløsningsmidler bør give anledning til bekymring. I vores tilfælde imidlertid formuleringen af ​​SN-38 /L-PGDS komplekser kunne opnås ved en simpel reaktion, dvs. kun blande en SN-38 suspensionen med L-PGDS løsning uden organisk opløsningsmiddel. Endvidere har vi også påvist, at den faste orale formulering af dårligt vandopløselige lægemiddel /L-PGDS komplekset kan simpelthen opnås ved at anvende en spraytørring teknik [33]. Derfor lægemiddelformuleringen anvendelse af L-PGDS har en stor fordel med hensyn til forberedelse og sikkerhed.