PLoS ONE: Overekspression af LIM og SH3 Protein 1 Førende til Accelerated G2 /M faseovergang bidrager til øget tumorudvikling i Oral Cancer

Abstrakt

Baggrund

LIM og SH3 protein 1 (LASP- 1) er en specifik fokal adhæsion protein involveret i flere maligne tumorer. Men dens rolle i oral pladecellecarcinom (OSCC) er ukendt. Formålet med denne undersøgelse var at karakterisere den rolle og molekylære status /mekanisme LASP-1 i OSCC.

Metoder

Vi evaluerede

LASP-1

mRNA og protein udtryk i OSCC-afledte cellelinjer og primære OSCCs. Ved hjælp af en shRNA-system, vi analyserede effekten af ​​LASP-1 på biologi og funktion OSCC cellelinjer, HSC-3 og Ca9-22. Cellerne blev også injiceret subkutant for at evaluere tumorvækst

in vivo

. Data blev analyseret ved Fishers eksakte test eller Wilcoxon Rank Sum. Bonferroni korrektion blev brugt til flere test.

Blev påvist

Resultater

Betydelig opregulering af LASP-1 i OSCC-afledte cellelinier (n = 7,

P

0,007) og primære OSCCs (n = 50,

P

0,001) sammenlignet med normale kontroller. LASP-1 Knockdown celler betydeligt hæmmet celleproliferation sammenlignet med shMock-transfekterede celler (

P

0,025) ved at arrestere celle-cyklus progression i G2 fase. Vi observerede dramatisk reduktion i væksten af ​​shLASP-1 OSCC xenografter sammenlignet med shMock implanteret

in vivo

.

Konklusion

Vores resultater antydede, at overekspression af LASP-1 er forbundet nøje til oral tumorigenicitet og yderligere tilvejebringe nye beviser for, at LASP-1 spiller en væsentlig rolle i tumor cellevækst ved at mediere G2 /M overgang

Henvisning:. Shimizu F, Shiiba M, Ogawara K, Kimura R, Minakawa Y Baba T, et al. (2013) Overekspression af LIM og SH3 Protein 1 Førende til Accelerated G2 /M faseovergang bidrager til øget tumorudvikling i Oral Cancer. PLoS ONE 8 (12): e83187. doi: 10,1371 /journal.pone.0083187

Redaktør: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland

Modtaget: August 21, 2013; Accepteret: 11. november 2013; Udgivet: 26 december, 2013 |

Copyright: © 2013 Shimizu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse forfattere har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at ingen konkurrerende interesse eksisterer

Introduktion

betydelig beviser har foreslået, at pludselige stigninger i celleproliferation forekomme på grund af sprængning af cellecyklus-kontrolmekanisme. Tidligere undersøgelser har rapporteret en sammenhæng mellem celle-cyklus regulering og udvikling af orale planocellulære carcinomer (OSCCs) [1], [2], [3]. Trods akkumulere data, har den præcise mekanisme af den kliniske fordel ved celle-cyklus regulering i OSCCs ikke blevet belyst.

Kræft celledeling sker som følge af afbrydelsen af ​​celle-cyklus kontrolmekanismer og løbende signalering for mitose. Nylige undersøgelser har rapporteret, at dysregulering i G2 /M overgang fremmer cellulær proliferation i mange tumortyper [4], [5], [6]. Blandt de gener, korrelerede med G2 /M-fasen, Nucleic LIM og SH3 protein (LASP-1) ved G2 /M-fasen er væsentlig for onkogen aktivitet hos patienter med brystcancer [7]. LASP-1 blev identificeret oprindeligt fra et cDNA-bibliotek af metastatisk brystkræft metastaser [8]. Det er lokaliseret inden flere steder dynamisk F-actin samling såsom fokale kontakter [9], og er involveret i cytoskeletal arkitektur [10]. I humane cancerceller afledte celler, mens silencing af LASP-1 resulterede i en stærk inhibering af cellulær vækst [11], overekspression af LASP-1 fremmes signifikant tumorvækst

in vivo

[12]. Desuden overekspression af LASP-1 er blevet observeret i en række forskellige maligne tumorer såsom metastatisk brystcancer [11], ovariecancer [13], blærecancer [14], medulloblastom [15], og hepatocellulært carcinom [16].

Nyere undersøgelser har vist LASP-1 sammen med en anden fokal adhæsion protein spiller en vigtig rolle i G2 /M overgang ved at inhibere cdc2 [17], [18], tyder på mulig relation til celle-cyklus i cancer. Baseret på disse observationer, vi hypotese, at LASP-1 er tæt forbundet med oral tumorgenese med accelereret G2 /M overgang.

I den aktuelle undersøgelse, fandt vi afvigende ekspression af LASP-1 og vurderet sammenhængen mellem sit udtryk og klinisk-patologiske karakteristika i OSCCs. Vi udførte også funktionel analyse til at definere de biologiske effekter af LASP-1.

Materialer og metoder

Etik Statement

Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af Etisk Komité Graduate School of Medicine, Chiba University (godkendelsesnummeret, 236) og blev udført i overensstemmelse med de etiske standarder, der er fastsat i Helsinki-erklæringen. Skriftligt informeret samtykke blev modtaget fra alle patienter.

Alle forsøgsdyr blev behandlet og plejes i overensstemmelse med retningslinjerne fra Chiba University. Forsøgsdyr blev aflivet ved cervikal dislokation. Vi gjorde alt for at lindre smerten af ​​forsøgsdyr. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg i Chiba University (Godkendelsesnummeret, 25-221).

Cell Kultur og vævsprøver

De humane OSCC cellelinjer (HSC -3, blev KON, og HO-1-N-1) købt fra human Science Research Resources Bank, Osaka, Japan. Riken BRC (Tsukuba, Japan) forudsat Sa3, HO-1-u-1, HSC-4, og Ca9-22 gennem de nationale Bio-Resource Project for Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan. Cellular identitet blev bekræftet ved kort tandem repeat profilering. Primære dyrkede humane normale orale keratinocytter (HNOKs) blev opnået fra tre raske donorer og tjente som de normale kontroller [19], [20], [21]. Alle celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (Sigma, St. Louis, MO, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Sigma) og 50 enheder /ml penicillin og streptomycin (Sigma) i en fugtig atmosfære af 5% carbondioxid /luft ved 37 ° C.

Halvtreds par primære OSCC prøver og tilsvarende normale orale epitelvæv blev opnået intraoperativt på Chiba Universitetshospital. Den institutionelle gennemgang bestyrelse Chiba University godkendt denne undersøgelse. Informeret samtykke blev opnået fra alle patienter. De operativt fjernede væv blev delt i RNA-isolering og immunhistokemi (IHC); det tidligere var frosset straks og opbevares ved -80 ° C blev sidstnævnte fikseret i 20% pufret formaldehydopløsning. Hver væv blev diagnosticeret histopatologisk ifølge World Health Organization kriterier ved Patologisk Institut, Chiba Universitetshospital. Klinisk-patologisk iscenesættelse blev bestemt i henhold til tumoren-node-metastaser klassificering af Den Internationale Union mod Kræft. Alle OSCC prøver blev bekræftet histologisk at tumoren var til stede i over 90% af prøverne.

mRNA Expression Analysis

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i overensstemmelse til producentens anvisninger. cDNA blev genereret fra 5 ug af total RNA ved hjælp af Ready-To-Go You-Prime Første-Strand Beads (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) og oligo (dT) primer (Hokkaido System Science, Sapporo, Japan). Real-time kvantitativ revers transkriptase polymerasekædereaktion (QRT-PCR) blev udført under anvendelse LightCycler® 480 PCR-system (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland) for at evaluere ekspressionsniveauet af

LASP-1

mRNA i OSCC -afledte cellelinjer og HNOKs. Primersekvenserne anvendt til QRT-PCR var:

LASP-1

, fremad, 5′-CAGCCCCAGTCTCCATACAG-3 ‘; omvendt, 5’-ATACTGATGTCGCGGCGG-3 ‘; og universel sonde # 77. Primere og prober blev designet ved hjælp af ProbeFinder qPCR Assay Design Software, findes på www.universalprobelibrary.com. De QRT-PCR-amplifikationer blev udført som følger: indledende denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, 45 amplifikationscykler ved 95 ° C i 10 sekunder, denaturering ved 55 ° C i 30 sekunder til annealing /forlængelse, og afkøling ved 40 ° C i 30 sekunder. Udskriften beløb for

LASP-1

blev beregnet ud fra de respektive standard kurver og normaliseret til

glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase

(

GAPDH

) (fremad 5 ‘ -CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-3’cell, omvendt 5’-GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3 ‘, og universel sonde # 60) udskrift opgjorte beløb i tilsvarende prøver.

Immunoblotting Analyse

cellerne blev lyseret i buffer ( 7 M urinstof, 2 M thiourinstof, 4% w /v CHAPS og 10 mM Tris [pH 7,4]) med proteinase-cocktail (Roche) og inkuberet ved 4 ° C i 30 minutter. Proteinkoncentrationen blev vurderet ved anvendelse af et Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Proteinekstrakter blev separeret ved natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese i 10% gel og overført til nitrocellulosemembraner før inkubering natten over med primære antistoffer mod LASP-1 (Applied biologiske materialer, Richmond, BC, Canada), cyclin A, cyclin B, eller phospho -cdc2 (Tyr15) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) ved 4 ° C. Membranen blev vasket med 0,1% Tween-20 i Tris-bufret saltvand, inkuberet med sekundære antistoffer, peberrodsperoxidasekonjugeret anti-kanin eller anti-mus IgG (Promega, Madison, WI, USA) i 1 time ved stuetemperatur. SuperSignal Kemiluminescerende substrat (Thermo, Waltham, MA, USA) blev anvendt for protein detektion. De immunreaktive bånd blev visualiseret på en afkølet CCD-kamera-system (ATTO, Tokyo, Japan), og CS Analyzer software version 3.0 (ATTO) blev anvendt til signalintensiteten kvantificering.

IHC

IHC blev udført på paraffinindlejrede prøver skåret i 4-um snit under anvendelse af kanin-anti-LASP-1-polyklonalt antistof (Applied Biological Materials). Den endogene peroxidase aktivitet blev blokeret af en 30 minutters inkubation i 0,3% hydrogenperoxid-opløsning i 100% methanol. Snittene blev inkuberet i 1,5% blokerende serum (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA) i phosphatbufret saltvand (PBS) i 2 timer ved stuetemperatur før omsætning natten over med anti-LASP-1-antistof (1: 1000 fortynding) ved 4 ° C i et fugtigt kammer. Før inkubation med det primære antistof blev objektglassene vasket tre gange i PBS og behandlet med Histofine Simplestain Max-PO (G) (Nichirei, Tokyo, Japan). 3,3′-diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAKO, Carpinteria, CA, USA) blev anvendt som et chromogen, og vævssnit blev modfarvet let med hematoxylin, dehydreret med ethanol, renset med xylen og monteret med Marinol (Muto Pure Chemicals, Tokyo , Japan). For at undgå ikke-specifik binding af et antistof til andre end antigen-proteiner, blev et immuniserende peptid blokerer eksperiment udført. Tredobbelt sektioner blev immunofarvet uden at reagere primære antistof som negativ kontrol for at bekræfte farvning specificitet.

For at bestemme LASP-1-ekspressionsniveauer blev objektglassene evalueret ved hjælp af en IHC pointsystemer tidligere [22], der er beskrevet, [23]. De farvning intensiteter blev scoret som en, svag; 2, moderat; og 3, stærk. IHC score blev beregnet ved at gange den procentdel af de positive tumorceller og farvningsintensitet. Tilfælde med en score på over 113,0 (+3 standardafvigelse [SD] score for normalt væv) blev defineret som LASP-1-positive. Den ± 3 SD cutoff, som statistisk set er blot 0,2% af målingen og forventes at falde uden for dette område, blev brugt, fordi det var usandsynligt, at blive påvirket af en tilfældig eksperimentel fejl produceret af prøve manipulation [24]. To uafhængige patologer, der havde noget kendskab til patienternes kliniske status gjort disse domme.

Transfektion med shRNA Plasmid

OSCC cellelinjer, HSC-3 og Ca9-22, med højere LASP- 1-proteinekspression blev stabilt transficeret med LASP-1 shRNA (shLASP-1) eller kontrol shRNA (shMock) (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) under anvendelse af lipofectamin LTX og Plus Reagenser (Invitrogen). Transficerede celler blev udvalgt i medium indeholdende 1 mg /ml Puromycin (Invitrogen).

celleproliferation Analyser

For at bestemme effekten LASP-1 knockdown på cellulær proliferation, shLASP-1- og shMock- transficerede celler blev podet i seks-brønds plader med 1 x 10

4 celler /brønd, trypsineret og talt i tre eksemplarer hver dag i 7 dage under anvendelse af et hæmocytometer.

Cell-cycle analysis

Syv dage efter etableringen af ​​LASP-1 knockdown celler, blev celle-cyklus fordeling kontrolleret. At synkronisere celler ved G2 /M overgang, blev cellerne behandlet med 200 ng /ml nocodazol (Sigma) i 20 timer [25]. Cellerne blev pelleteret, skyllet med PBS, og probet med CycleTEST Plus DNA reagenskittet (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA), ifølge fabrikantens protokol. Efter centrifugering ved 400 x g i 5 minutter blev 250 mikroliter opløsning A (trypsin-buffer) tilsat, og blandingen blev inkuberet i 10 minutter ved stuetemperatur. To hundrede mikroliter opløsning B (trypsininhibitor og RNase i en buffer) blev derefter tilsat, og blandingen blev inkuberet i 10 minutter ved stuetemperatur. Endelig blev 200 mikroliter opløsning C (propidiumiodid farveopløsning) tilsat, og blandingen blev inkuberet i mørke i 10 minutter på is. Flowcytometrisk bestemmelse af DNA-indhold blev analyseret under anvendelse af Accuri C6 flowcytometer (Becton-Dickinson). Celle-cyklus distributioner blev kvantificeret ved hjælp af FCS Express 4 (De Novo Software, Los Angeles, CA, USA). Forsøgene blev udført i tre eksemplarer.

In vivo

tumorvækstassay

At evaluere kræft vækst

in vivo

, 2 × 10

7 shLASP-1- og shMock-transficerede celler blev uafhængigt injiceret subkutant i ryggen af ​​nøgne hunmus, BALB /c-nu, købt fra Oriental Yeast Co. (Tokyo, Japan). Alle forsøgsdyr blev behandlet og plejes i overensstemmelse med institutionelle retningslinier. De tumorer blev målt ved hjælp af skydelære hver 3 til 4 dage efter de nåede et volumen på 100 mm

3. Tumorvolumenet blev beregnet efter formlen 4π /3 × (bredde /2)

2 × (længde /2). Musene blev aflivet efter 28 dage. Tumorvæv blev fikseret i 10% formalin, og paraffinsnit (4 um) blev fremstillet til immunhistokemi af LASP-1 og hematoxylin og eosin (H 0,05 blev betragtet som signifikant. Bonferroni korrektion blev udnyttet til flere test. Dataene er udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse af middelværdien (SEM).

Resultater

Evaluering af LASP-1 ekspression i OSCC-afledte cellelinier

For at analysere udtrykket status

LASP-1

, vi udførte QRT-PCR og immunoblotting analyser ved hjælp af syv OSCC-afledte cellelinier (HSC-3, HSC-4, køn, HO-1-u-1, HO- 1-N-1, Ca9-22, og Sa3) og HNOKs.

LASP-1

mRNA var signifikant (

P

0,007) opreguleret i alle OSCC cellelinjer sammenlignet med i HNOKs (figur 1A). Figur 1B viser repræsentative resultater af immunoblotting analyser. En betydelig stigning i LASP-1-protein-ekspression blev set i alle OSCC-afledte cellelinjer sammenlignet med HNOKs. Expression analyse viste, at både transskription og oversættelse produkter af LASP-1 blev stærkt udtrykt i OSCC-afledte cellelinjer.

(A) Kvantificering af

LASP-1

mRNA-ekspression i OSCC-afledte celle linjer ved QRT-PCR-analyse. mRNA ekspressionsniveauer normaliseres til GAPDH. Signifikant opregulering af

LASP-1

mRNA ses i syv OSCC-afledte cellelinier sammenlignes med den i HNOKs. Data er udtrykt som middel ± SEM for tredobbelte resultater (*

P

0,007; Mann-Whitney U test med Bonferroni korrektion). (B) Immunblotting analyse af LASP-1 protein i OSCC-afledte cellelinier og HNOKs. LASP-1-protein-ekspression er opreguleret i OSCC-afledte cellelinier sammenlignet med den i HNOKs. Densitometriske LASP-1-protein data er normaliseret til GAPDH protein niveauer. Værdierne er udtrykt som en procentdel af de HNOKs.

Evaluering af LASP-1 ekspression i Primary OSCCs

For at finde ud af udtryk status LASP-1 i primære OSCCs og dens relationer til klinisk-patologiske karakteristika, undersøgte vi LASP-1 protein-ekspression i primære OSCCs og parret normale orale væv fra 50 patienter ved hjælp af IHC pointsystem. Stærk LASP-1-immunreaktivitet blev påvist i cytoplasmaet af OSCCs, mens de normale væv viste negativ immunfarvning (figur 2B, C). De LASP-1 IHC scoringer varierede fra 43 til 265 i OSCCs (median, 178) og 2,5 til 97 i normale orale væv (median, 35). IHC scoringer i de primære OSCCs var signifikant (

P

0,05) højere end i de normale orale væv (figur 2A)

(A) Status for LASP-1 protein-ekspression i. primære OSCCs (n = 50) og normale modparter baseret på et IHC pointsystem. IHC score er beregnet som følger: IHC score = 1 × (antal svagt farvede celler i felten) + 2 x (antal moderat farvede celler i felten) + 3 × (antal intenst farvede celler på området). De LASP-1 IHC scorer for normale orale væv og OSCCs interval fra 2,5 til 97 (median, 35) og 43 til 265 (median, 178), henholdsvis. LASP-1 protein ekspressionsniveauerne i OSCCs er betydeligt højere end hos normale orale væv (*

P

0,001; Mann-Whitney U-test). (B, C) Repræsentant IHC resultater af LASP-1 i normale orale væv og primære OSCCs. Original forstørrelse, × 100. Scale barer, 5 um. LASP-1 er stærkt overudtrykt i OSCCs sammenlignet med normale orale væv.

Tabel 1 viser sammenhænge mellem klinisk-patologiske karakteristika for de patienter med OSCC og status for LASP-1 protein-ekspression ved hjælp af IHC scoring system. Blandt de kliniske klassifikationer blev LASP-1-positive OSCCs korreleret signifikant (

P =

0,02) med tumorstørrelse. Desuden er en signifikant (

P =

0,04) forskel blev fundet i LASP-1-ekspression niveauer mellem T1 /T2 gruppen og T3 /T4 gruppe, hvilket indikerer LASP-1-ekspression er højere i fremskredne stadier sammenlignet med tidlige stadier. Ingen signifikante relationer blev fundet i alder, køn, N-regional lymfeknude, histopatologisk type, og tumor.

Etablering af LASP-1 Knockdown Celler

For at undersøge mulige funktion af LASP-1 i OSCCs, de OSCC-afledte cellelinier, HSC-3 og Ca9-22, blev transficeret med LASP-1 shRNA og kontrollen shRNA (shMock). Ekspressionsniveauerne af

LASP-1

mRNA og protein i shLASP-1-transficerede celler viste signifikant (

P

0,025) fald i forhold til shMock-transfekterede celler (figur 3A, B .)

(A) Angivelse af

LASP-1

mRNA i shMock- og shLASP-1-transficerede celler (HSC-3- og Ca9-22-afledte transfektanter; 2 kloner hver) .

LASP-1

mRNA ekspression i shLASP-1 er signifikant (*

P

0,025; Mann-Whitney U test med Bonferroni korrektion) lavere end i shMock-transfekterede celler . (B) Immunblotting analyse af LASP-1 protein i shMock- og shLASP-1-transficerede celler (HSC-3- og Ca9-22-afledte transfektanter, 2 kloner hver). Den LASP-1 protein i shLASP-1 transfekterede celler er opbrugt markant sammenlignet med de shMock-transficerede celler.

Reduceret Cellular Vækst i LASP-1 Knockdown Celler

For at undersøge indvirkning LASP-1 på cellulær proliferativ evne, overvåges vi den cellulære vækst i shLASP-1-transficerede celler i syv på hinanden følgende dage. Både HSC-3 og Ca9-22 shLASP-1-transficerede celler havde en signifikant (

P

0,025). Nedgang i cellulær vækst sammenlignet med de shMock-transfekterede celler (Figur 4)

for at bestemme virkningen af ​​shLASP-1 på cellulær proliferation, shLASP-1- og shMock-transficerede celler blev podet i seks-brønds plader ved en densitet på 1 x 10

4 levedygtige celler /brønd. Den shLASP-1 transficeret HSC-3 og Ca9-22 celler har en signifikant (*

P

0,025; Mann-Whitney U test med Bonferroni korrektion) nedgang i cellulær vækst sammenlignet med de shMock-transfekterede celler.

Knockdown af LASP-1 inducerer G2 Phase Ophobning

for at undersøge den mekanisme, hvormed nedreguleret LASP-1 er relateret til celle-cyklus progression, så undersøgte vi den celle- cyklus fordelinger af shLASP-1-transficerede celler under anvendelse af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Andelen af ​​celler i G2 fase i shLASP-1-transficerede celler var signifikant (

P

0,025) højere end i shMock-transficerede celler (figur 5A). Lignende resultater opnåedes i tre uafhængige forsøg (figur S1, S2), hvilket antyder, at nedregulering af LASP-1 inhiberede cellulær proliferation, som inducerede G2-standsning.

(A) Flowcytometrisk bestemmelse af DNA-indhold blev analyseret ved hjælp af Accuri C6 Flow Cytometer. shLASP-1-transficerede HSC-3 og Ca9-22 celler viser signifikant (*

P

0,025; Mann-Whitney U test med Bonferroni korrektion) G2 fase ophobning i modsætning til de shMock-transfekterede celler. (B) Immunoblotting analyse viser nedregulering af cyklin A og cyklin B og opregulering af phospho-cdc2 i Knockdown celler.

For at identificere den mekanisme, hvormed nedreguleret LASP-1 blokke G2 /M overgang vurderede vi proteinet ekspressionsniveauet for cyclin A, cyclin B, eller phospho-cdc2 (Tyr15). De protein udtryk for cyklin A og cyclin B blev nedreguleret mens phospho-cdc2 (Tyr 15) var opreguleret (figur 5B), hvilket indikerer anholdelsen af ​​G2 /M-fasen i shLASP-1 transfekterede celler.

LASP-1 Fremmes Tumor vækst

in vivo

for at definere effekten af ​​LASP-1 på vækst kræft

in vivo

, shLASP-1- og shMock- transficerede celler af HSC-3 og Ca9-22 cellelinjer blev injiceret subkutant i ryggen af ​​nøgne hunmus, henholdsvis (3 mus i hver gruppe). I overensstemmelse med vores

in vitro

resultater, den gennemsnitlige tumor volumen shLASP-1 celler var signifikant (

P

0,05) mindre i forhold til de shMock-transfekterede celler. H 0,05; Mann-Whitney U test) inhiberede sammenlignet med shMock-injicerede mus. Immunhistokemi viste klart nedsat immunofarvning for LASP-1 i shLASP-1-afledte tumorer end shMock injicerede mus. H & E-farvning bekræftede tilstedeværelsen af ​​tumorceller. Original forstørrelse, × 200.

Diskussion

I den aktuelle undersøgelse, fandt vi en høj forekomst af forhøjet LASP-1-ekspression i patienter med OSCC og en signifikant sammenhæng med den primære tumor størrelse (tabel 1). Desuden knockdown af LASP-1 i OSCC-afledte cellelinier resulterede i en dramatisk effekt på væksthæmning

in vitro

in vivo

via anholdelsen af ​​G2 /M-fasen. De aktuelle data tilvejebringes en hidtil ukendt indsigt i den rolle, afvigende LASP-1 fungerer som et onkogent proces i denne sygdom.

Der blev fundet en signifikant opregulering af LASP-1 i alle OSCC-afledte celler blev undersøgt på protein niveauer (figur 1B), hvilket indikerer, at LASP-1-ekspression er nødvendig for oral carcinogenese. På den anden side er de mRNA-ekspression stater afhang cellerne (figur 1A). En mulig forklaring på denne forskel er, at LASP-1 proteiner forskelligt påvirkes af post-translationel ubiquitinering og proteolyse i hver tumorcellelinjer. I denne sammenhæng uoverensstemmelser mellem

LASP-1

mRNA ekspression niveauer og protein niveauer er blevet rapporteret i blærekræft cellelinjer [14].

FACS-analyse viste, at LASP-1 er specielt aktiv i G2 /M-fasen i OSCC celler (figur 5A). G2 /M checkpoint er nødvendig for cellen at reparere DNA-skader før mitotisk post. Når DNA er beskadiget, cdc2, en vigtig regulator af celle progression, inaktiveres gennem stigende phosphorylering rester af Tyr 15, hvilket får cellerne til at standse i G2 fase [26]. Cyclin A og cyclin B er andre vigtige regulatorer af celle-cyklus progression. Cyclin A forbinder med cdk2 og cdc2 og er påkrævet ved indledningen af ​​S-fasen og G2 /M overgang [27], [28]. I mellemtiden, cyklin B forbinder med cdc2 og regulerer mitotisk indrejse og udrejse [29]. Ekspressionsniveauer af cyclin A og cyclin B er ofte opreguleret i en række tumorer [30], [31]. Udtømning af cyklin A og cyclin B fører til celle-cyklus anholdelse i G2 [32], [33]. Under G2 fasen er cyklin B /cdc2 kompleks inaktiveret ved fosforylering på Try15 og Thr14 af cdc2 af Wee 1 og Myt 1 kinaser [34], [35]. Ved begyndelsen af ​​mitose, Cdc25C phosphatase aktiverer cdc2 ved at fjerne phosphater på Thr 14 og Try 15 [36], [37] og forhindrer cyclin B1 /Cdc2 kompleks fra inaktiveres igen [38].

Baseret på disse observationer, vi næste bestemmes ekspressionen status for de beslægtede gener nævnt tidligere. Som forventet, mens cyklin A og B var signifikant nedreguleret, vi har registreret opregulering af phoshpo-cdc2 i LASP-1 Knockdown celler. Dette var i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der implicitte LASP-1 er ansvarlig for cellulær proliferation grundet celle-cellecyklusstandsnings på G2 fase hos patienter med bryst- og ovariecancer [11], [13].

Det kan konkluderes, vores data viste, at LASP-1 kan være associeret med tumorudvikling ved at fremme cellecyklusfremadskriden i G2 fase. Det er bemærkelsesværdigt, at vores

in vivo Salg data viste dramatiske inhibering af tumorvækst ved LASP-1 nedregulering, hvilket antyder, at dette molekyle kan være en nyttig biomarkør for spredning og en mulig terapeutisk mål for udvikling af anti-cancer-lægemidler i human OSCCs fordi de fleste af vores patienter med en OSCC har overudtrykt LASP-1 protein (tabel 1).

Støtte oplysninger

figur S1.

FACS-analyse af shMock- og shLASP-1-transficerede HSC-3-celler. Den procentdel af G2 /M-fasen i shLASP-1-transficerede HSC-3 celler var højere end i shMock-transfekterede celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0083187.s001

(TIF)

Figur S2.

FACS analyse af shMock- og shLASP-1-transficerede Ca9-22 celler. Den procentdel af G2 /M-fasen i shLASP-1-transficerede Ca9-22 celler var højere end i shMock-transfekterede celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0083187.s002

(TIF)

tak

Vi takker Ms Lynda C. Charters til redigering dette manuskript.