PLoS ONE: Målretning DNA Double Strand Break Repair Maskiner i prostatakræft

Abstrakt

Uanset de opnåelige remissioner med første linje hormonbehandling hos patienter med prostatakræft (CaP), sygdommen undslipper hormonet afhængig etape til en mere aggressiv status, hvor kemoterapi er den eneste effektive behandling, og ingen behandling er helbredende. Dette gør det meget vigtigt at identificere nye mål, som kan forbedre resultatet af behandlingen. ATM og DNA-PK er de to kinaser er ansvarlige for signalering og reparation dobbelt strengbrud (DSB). Således begge kinaser er relevante mål i CaP behandling for at forøge aktiviteten af ​​de mange DNA DSB-inducerende midler anvendt i CaP behandling såsom ioniserende stråling (IR). Kolonidannelse assay blev anvendt til at vurdere følsomheden af ​​hormonafhængig, p53 vægt- (LNCaP) og hormon uafhængige p53 mutant (PC3) CaP-cellelinier til den cytotoksiske virkning af IR og doxorubicin i nærvær eller fravær af Ku55933 og NU7441, der er lille molekyle inhibitorer af ATM og DNA-PK, hhv. Flowcytometri baserede metoder blev anvendt til at vurdere virkningen af ​​de to inhibitorer på cellecyklus, apoptose og H2AX foci-dannelse. Neutral comet assay blev anvendt til at vurdere induktion af DNA DSB’er. Ku55933 eller NU7441 alene forøget følsomhed Cap cellelinjer til DNA-ødelæggende midler, men at kombinere begge hæmmere sammen resulterede i yderligere forbedring af følsomhed. Cellecyklus profil begge cellelinier blev ændret med øget celledød, DNA DSB’er og H2AX foci-dannelse. Denne undersøgelse berettiger til yderligere evaluering af ATM og DNA-PK-hæmmere til klinisk anvendelse i Cap-patienter. Derudover kan den augmented effekt som følge af at kombinere begge hæmmere har en betydelig konsekvenser for behandling af Cap patienter, der har en defekt i en af ​​de to DSB reparation veje

Henvisning:. Shaheen FS, Znojek P, Fisher A , Webster M, Plummer R, Gaughan L, et al. (2011) Målretning DNA Double Strand Break Repair Maskiner i prostatakræft. PLoS ONE 6 (5): e20311. doi: 10,1371 /journal.pone.0020311

Redaktør: Kerstin Borgmann, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Tyskland

Modtaget: Januar 18, 2011; Accepteret: April 28, 2011; Udgivet: 23 maj, 2011

Copyright: © 2011 Shaheen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Aga Khan Foundation, www.akdn.org/AKF, CRUK, CancerResearchUK.org, MRC, www.mrc.ac.uk, og AICR, www.aicr.org.uk. . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser: En af forfatterne, Graeme C.M. Smith, er ansat af en kommerciel virksomhed, Kudos Pharmaceuticals Ltd, Cambridge Science Park, Milton Road, Cambridge, UK. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om deling af data og materialer.

Introduktion

Ifølge U.S. National Institutes of Health, alder-justeret incidensrate for prostatakræft 2003-2007 var 156,9 pr 100.000 mænd om året. Selv høje svarprocenter kan opnås ved første linie behandling med kirurgi, strålebehandling, antiandrogen eller kombinationer; den naturlige udvikling af sygdommen er mod hormonrefraktær status [1], hvor kemoterapi er den mest effektive behandling, men stadig ikke helbredende [2]. Denne modstand fremhæver betydningen af ​​at identificere nye mål, der kan øge følsomheden af ​​Cap celler og dermed svarprocenter og samlet overlevelse af patienter. Ataxia telangiectasia muteret (ATM) og DNA-afhængige proteinkinase katalytisk underenhed (DNA-PKcs) er medlemmer af de phosphatidylinositol 3-kinase relaterede kinaser (Pikk) superfamilien. Medlemmer af denne familie er karakteriseret ved deres høje molekylvægt og sekvenslighed med p110 subunit lipid kinase PI3-kinase [3]. I pattedyrceller, ATM og DNA-PK spiller en vigtig rolle i DNA dobbelt streng brud (DSB) svar, via homolog rekombination (HR) og ikke homolog ende sammenføjning (NHEJ), henholdsvis [4], [5]. Rapid phosphorylering af både ATM og DNA-PK sker som reaktion på DSB efter endogene eller exogene fornærmelser. Når den er aktiveret, ATM og DNA-PK-signal til et bredt spektrum af downstream mål, der er involveret i reparationen, cellecyklusregulering og apoptose [6]. Valget af hvilken pathway reparerer DSB er cellecyklus fase afhængig, med NHEJ er det dominerende pathway i G0 og G1, og HR dominerer i S og G2 /M-faser [7]. ATM og DNA-PK er spaltet af caspase 3 når beslutningen at aktivere apoptose sker i cellen, og denne spaltning begivenhed menes at lette apoptose ved at deaktivere DNA signalering og reparation maskiner [8], [9]. Traditionelle PI3K-inhibitor, wortmannin med generelt lav selektivitet mod forskellige klasser og /eller isoformer af PIKK har været meget anvendt til at studere ATM og DNA-PK signalveje [10]. Ku55933 blev identificeret som en potent og specifik ATP kompetitiv inhibitor af ATM (IC

50 13 nmol /l) i forhold til inhibering af andre medlemmer af PIKK familien. Ku55933 øget følsomhed brystcancerceller til IR, ændret deres cellecyklus profil, og inhiberede phosphorylering af et panel af ATM-mål. A-T-celler viste ikke disse virkninger, når de behandles med Ku55933 [11]. NU7441 blev identificeret som en potent og specifik ATP kompetitiv inhibitor af DNA-PK (IC

50 14 nmol /l) med 100-gange selektivitet for DNA-PK i forhold til andre medlemmer af PI3KK familien. NU7441 øget følsomhed tyktarmskræft celler til IR og topoisomerase II-hæmmere, og ændret deres cellecyklus profil. DNA-PK deficiente V3-celler viste ikke disse virkninger, når de behandles med NU7441 [12]. Denne undersøgelse blev designet som en præklinisk vurdering af både ATM og DNA-PK-inhibitorer til at undersøge, om disse inhibitorer kan forbedre effekten af ​​DNA DSB inducerende midler for CaP behandling.

Materialer og metoder

Kemi

Alle rutinemæssige kemikalier var køb fra Sigma, medmindre andet er angivet. NU7441 blev syntetiseret ved den nordlige Institute for Cancer Research, Newcastle University (Newcastle upon Tyne, UK) i samarbejde med kudos Pharmaceuticals (Cambridge, UK). KU-55.933 var en slags gave fra KUDOS Pharmaceuticals. Begge inhibitorer blev opløst i DMSO ved en koncentration af stamopløsning på 2000 × den endelige koncentration, der kræves til eksperimentet. Doxorubicin blev opløst i vand ved en koncentration af stamopløsning på 1000 × den endelige koncentration, der kræves til eksperimentet. Alle forbindelser blev opbevaret i portioner ved -20 ° C.

Cellekultur

LNCaP hormon følsom (p53 vildtype) og PC3 hormon ufølsomme (p53 null) CaP-cellelinier blev indkøbt fra ATCC og dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% (v /v) FCS. Begge cellelinier blev rutinemæssigt screenet for mycoplasma.

Kolonidannelse assay

Celler blev podet i plader med 6 brønde ved forskellige tætheder. Efter at vedhæfte, blev celler inkuberet med Ku55933 (10 uM) alene eller i kombination med NU7441 (1 uM) i 1 time før enten bestråling (0-2 Gy) eller doxorubicin behandling (0-75 nM). 24 timer senere blev brøndene forsigtigt vasket to gange med varm PBS før tilsætning af frisk medium og returneres til inkubatoren i 7-10 dage for PC3-celler og 12-14 dage for LNCaP-celler til at danne kolonier. Kolonier blev fikseret med Carnoy fiksativ, tørret, farvet med 0,4% krystalviolet og talt manuelt. Reduktionen overlevelsesfaktor blev beregnet som den overlevende fraktion af celler i fravær af inhibitorerne divideret med overlevende andel af celler i nærvær af inhibitorer for en given dosis eller koncentration af cytotoksisk middel.

Flowcytometri baserede metode for cellecyklus

Celler blev podet i plader med 6 brønde. 24 timer senere blev celler behandlet med 1 pM NU7441 og /eller 10 uM Ku55933 før IR eller doxorubicin behandling. 48 timer senere blev celler opsamlet i FACS-rør (Becton Dickinson, Oxford UK) opretholdelse vækstmediet inden de farvet med propidiumiodid (PI). Prøverne blev analyseret direkte på en FACScan (Becton Dickinson)., Blev fluorescensintensiteten i arbitrære enheder plottet i histogrammer, og cellecyklus faser blev bestemt ved anvendelse WINMDI-version 2.8 (The Scrrips Research Institute, USA)

flowcytometri metode til aktiv caspase 3

Celler blev podet i plader med 6 brønde og behandlet med hæmmere og /eller DNA-ødelæggende middel som tidligere beskrevet og opsamlet i FACS-rør opretholdelse vækstmediet. Celler blev farvet med FITC konjugeret aktiv caspase 3-antistof i overensstemmelse med producentens instruktioner (Becton Dickinson, Oxford UK) og analyseret direkte på en FACScan. Fluorescens intensitet i arbitrære enheder blev plottet i dot plots, og gennemsnitlige fluorescensintensitet blev beregnet ved hjælp WINMDI version2.8.

Flowcytometri metode til γ-H2AX foci dannelse

Celler blev podet i 6 brønd plader, der er behandlet med hæmmere og /eller DNA-ødelæggende middel som tidligere beskrevet og opsamlet i FACS rør. Celler blev farvet ved anvendelse FITC konjugeret γH2AX antistof som tidligere [13] beskrevne. Prøver blev analyseret direkte på en FACScan. Fluorescensintensitet i arbitrære enheder blev afbildet i histogrammer, og den gennemsnitlige fluorescensintensitet blev beregnet under anvendelse WINMDI version2.8.

Western blotting

Hele celleekstrakter blev fremstillet 6 timer efter 1 uM doxorubicin og 1 t efter 10 Gy IR i nærvær og fravær af inhibitorerne. Ækvivalente mængder af cellelysat blev påsat 4,5, 6, 12 og 15% geler sammen et protein markør SeeBlue® Pre-Stained Standard (Invitrogen, USA). Geler blev elektroforeret og proteiner blev overført til Hybond-C-membran. ECL-systemet (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) blev anvendt til at detektere antistof konjugeret proteiner ifølge producentens instruktioner og visualiseret ved udsættelse for røntgenfilm (Kodak, Herts, UK). Anti-DNA-PK, anti ATM, anti-DNA-PK

Ser2056 og anti-DNA-PK

Thr2906 blev købt fra (Abcam, Cambridge UK). Anti ATM

Ser1981, anti H2AX

Ser139 og anti p53

Ser15 blev købt fra (Gene Tex, USA), (Upstate, UK) og (Cell signalering, UK), hhv.

Neutral komet assay

PC3 blev underkastet den neutrale comet assay ifølge producentens instruktioner (Trevigen, Inc., Gaithersburg, MD, USA). To vigtige ændringer blev anvendt, blev cellerne lyseret i 1 time og elektroforesebehandlet i 30 minutter ved 30 V. Comets blev visualiseret ved fluorescens Leica DMR mikroskop og analyseret ved anvendelse Komet 5,5 (kinetisk billeddannelse Ltd, Nottingham, UK).

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev anvendt ved hjælp prisme software Version4 (GraphPad Prism, San Diego, USA).

Resultater

Ku55933 og NU7441 hæmme ATM og DNA-PK-kinase aktivitet i henholdsvis IR og doxorubicin behandlet CaP celler

ATM-afhængige ATM

Ser1981, p53

Ser15, H2AX

Ser139 og DNA-PK

Thr2609 fosforylering blev induceret 1 time efter 10 gy og 6 timer efter 1 uM doxorubicin og blev inhiberet af Ku55933. IR-induceret DNA-PK

Ser2056 fosforylering (rapporteret som DNA-PK-autophosphorylering site) blev hæmmet af NU7441 (som forventet) og overraskende doxorubicin induceret DNA-PK

Ser2056 fosforylering blev også hæmmet af Ku55933. NU7441 ikke hæmme ATM

Ser1981, p53

Ser15, H2AX

Ser139 og DNA-PK

Thr2609 fosforylering (figur 1).

Hele LNCaP celleekstrakter blev udarbejdet en time efter 10 Gy og 6 timer efter en uM doxorubicin ± 10 pM Ku55933 eller en uM NU7441. Ekstrakterne blev analyseret ved western blotting og probet med de angivne antistoffer. Dataene er en repræsentant for tre uafhængige forsøg.

Ku55933 og NU7441 er minimalt cytotoksiske til Cap celler

For at bestemme den iboende cytotoksicitet Ku55933 og NU7441 i forhold til kemo og strålingssensibilisering blev cellerne eksponeret for stigende koncentrationer af Ku55933 eller NU7441 med minimalt cytotoksiske koncentration på IR (1 Gy) eller doxorubicin (10 nM). Både Ku55933 (10 uM) og NU7441 (1 uM) forårsagede minimal eller ingen cytotoksicitet i LNCaP (figur 2A B) og PC3 (figur 2C B). Eller PC3 (C 0,001). LNCaP (E F) eller PC3 (G H) -celler blev podet i forskellige tætheder og venstre at vedhæfte før 1 times inkubering med Ku55933 (10 uM) eller NU7441 (1 uM) før behandling med varierende IR doser eller doxorubicin koncentration for 24 timer (

P

0,001). Alle resultater er gennemsnittet af tre uafhængige forsøg ± SEM.

Ku55933 og NU7441 reducerede CaP cellelinjer cellulære overlevelse som reaktion på IR eller doxorubicin

Efter at have demonstreret en koncentrationsafhængig kemo og radiosensibilisering i begge cellelinier, derefter undersøgte vi, at reaktionen på en fast koncentration af hver inhibitor med forøgede koncentrationer af doxorubicin eller IR dosis. Der var en dosisafhængig formindskelse i celleoverlevelse som respons på IR. PC3 celler udviste resistens over for IR sammenlignet med LNCaP kombinere NU7441 eller Ku55933 med IR reducerede celleoverlevelse for LNCaP (figur 2E) og i det væsentlige for PC3 (figur 2G) signifikant. Tilsvarende doxorubicin reducerede celleoverlevelse i begge cellelinier, Videregående kemo-sensibilisering resulterede fra kombinere NU7441 eller Ku55933 i LNCaP (figur 2F) og PC3 (Figur 2H). Ved at kombinere begge hæmmere markant øget kemo-strålingssensibilisering og NU7441 kombination var mere effektiv til at inducere chemosensitisation i LNCaP mens Ku55933 kombination havde mere effekt til at inducere strålingssensibilisering i PC3 tyder en avanceret rolle for ATM i hormon refraktær model.

Ku55933 og NU7441 ændret cellecyklus og øget deres apoptose i respons på DNA skader i Cap-cellelinjer

Vi næste afgøres, om den øgede følsomhed Cap cellelinjer er ledsaget af øget apoptose eller ændringer i cellecyklus profil. IR forårsagede minimale /ingen stigning i LNCaP (figur 3A) sammenlignet med en dosis-afhængig stigning i G2 akkumulering i PC3 (figur 3B). Derudover kan kombinationen af ​​begge inhibitorer havde en additiv virkning på G2 akkumulering ved lav dosis (2 Gy), men ikke i høje doser (10 Gy). Doxorubicin-behandling forårsagede celler til at akkumulere i G2 /M især ved høje doser. Generelt kombinere enten hæmmer med en lav dosis doxorubicin (20 nM) øget G2 /M akkumulering selvom NU7441 havde kun beskeden virkning i LNCaP-celler (figur 3C). Henviser enkelt inhibitor kombination ved høj dosis doxorubicin (200 nM) resulterede i en slående stigning i subG1 i LNCaP (figur 3C) sammenlignet med en interessant stigning i G1 i PC3-celler (figur 3D). En additiv virkning blev observeret, når man kombinerer begge inhibitorer

LNCaP (A dette kunne være en del relateret til det faktum, at IR primært inducerer højere niveau af enkelte strengbrud.

Diskussion

Ku55933 og NU7441 er potente hæmmere af ATM og DNA-PK, hhv. Hver inhibitor afskaffede autophosphorylering af sin egen protein mål i begge CaP cellelinier efter IR. Data med doxorubicin behandling var ens mellem de to cellelinjer men phosphorylering af DNA-PK

Ser2056 synes ikke at være hæmmet af NU7441. Især blev phosphorylering af de nedstrøms mål H2AX

Ser139 og p53

Ser15 som hovedsageligt reguleret af ATM afskaffet når begge hæmmere blev kombineret. Endvidere er en ny fosforylering begivenhed rapporteret her som phosphorylering af Ser2056 af DNA-PKcs, menes at være en sand autophosphoryleringen site for DNA-PK [14], blev reduceret efter Ku55933 behandling (ikke NU7441) som svar på doxorubicin men ikke IR behandling tyder dette sted også kunne målrettes via ATM, afhængigt af DNA-skader inducerende middel. En relevant kontrol ville være at nedbryder indfødte ATM og erstatte den med en kinase-død ATM.

Ved at kombinere enten hæmmer med IR eller doxorubicin resulterede i en massiv og betydelig stigning i følsomheden af ​​LNCaP og PC3 celler til den cytotoksiske virkningen af ​​både IR- og doxorubicin. Derudover kombinerer de to inhibitorer sammen med DNA ødelæggende midler resulterede i yderligere forbedring i cytotoksiciteten sammenlignet med enkelt inhibitor kombination. Dette stemmer overens med rapporteret litteratur, hvor målrettet ATM og DNA-PK ved hjælp siRNA metode afslørede øget følsomhed over for IR og kemoterapi i forskellige CaP cellelinjer [15]. Den øgede følsomhed som følge af kombinationen af ​​begge hæmmere kunne have en betydelig konsekvenser for behandlingen af ​​CaP patienter med en defekt i HR eller NHEJ veje såsom BRCA mutation luftfartsselskaber [16]. Patienter med defekt i én reparationsvej potentielt kunne behandles med inhibitoren på den anden pathway og drage fordel af maksimal udfald behandling med minimale bivirkninger.

heri er en væsentlig egenskab ved PC3 cellecyklus, manglende p53-funktion, ført til en forøget akkumulering i G2 /M-fasen af ​​cellens cyklus i nærværelse af ATM, DNA-PK eller begge inhibitorer især når de kombineres med IR behandling. Men inhibere enten ATM eller DNA-PK eller begge i kombination med højdosis doxorubicin behandling øgede G1-fasen akkumulering, hvilket antyder aktivering af G1 checkpoint af andre veje, såsom p38MAPK /MK2 [17]. I nærvær af funktionelt p53 (LNCaP-celler), celler akkumuleret i G2 /M-fase, hvor ATM blev inhiberet, mens de akkumuleret i G1 når DNA-PK blev inhiberet. Dette kunne forklare de overlevelsesdata siden ophobning i G2 ville give mere NHEJ medieret DNA-reparation. Disse data understøtter tidligere rapporter tyder på, at virkningen af ​​DNA-PK på p53 bidrager til apoptose proces snarere end at cellecyklus kontrol. Det er interessant, at ATM-inhibering fører til G2 akkumulation, som kan forklares ved virkningen af ​​kinase aktiv ATR i fravær af aktiv ATM kinase [18]. Interessant kombinere enten hæmmer eller den dobbelte inhibitor kombination med høj dosis doxorubicin (overdreven DNA-skader) resulterede i en dramatisk stigning i subG1 befolkning, en angivelse af apoptose. Dette antyder, at tilstedeværelsen af ​​p53 kan udløse celledød, når skaden i DNA er for materiel, der skal repareres. Vores data er i overensstemmelse med en rolle for ATM og DNA-PK i cellecyklusregulering via deres virkning på forskellige proteiner [19].

I denne undersøgelse blev virkningen af ​​inhibering ATM eller DNA-PK på celledød af CaP cellelinier afslørede, at uafhængigt af p53 status eller hormonet afhængighed, denne hæmning øget programmeret celledød fremkaldt af lave doser af enten doxorubicin eller IR. Tilstedeværelsen af ​​p53 (LNCaP-celler) i høj grad øget apoptotiske population med høj dosis doxorubicin. Henviser, i fravær af p53 (PC3-celler) var der enten ingen eller en lille stigning i celledød med høj dosis doxorubicin som er konsistent med den observerede stigning i cellecyklusstop. Den mere udtalte apoptose i PC3 sammenlignet med LNCaP ved lave doser af DNA-skade kunne forklares ved den kortere behandlingsperiode (48 h) for LNCaP sammenlignet med (96 h) for PC3 celler.

Vi observerede, at primær induktion af H2AX foci blev væsentligt reduceret ved at kombinere den ene eller begge hæmmere med DNA skadelige stoffer. På senere tidspunkter blev H2AX foci dannelse stadig hæmmet i ATM inhibitor kombination arme, mens den steg i DNA-PK inhibitor arme. Dette indebærer, at DNA-PK hæmning øger DNA DSBs, der er fremhævet med øget antal H2AX foci dannet ved skaden site. Imidlertid faldt H2AX foci-dannelse i ATM inhibitor arme er ikke en konsekvens af mindre DSB’er der frembringes som vi demonstreret øget DNA DSBs hjælp af neutrale comet assay. Dette stemmer overens med de data tyder på, at ATM er den største kinase, der inducerer H2AX foci, og at DNA-PK kan phosphorylere H2AX kun i fravær af ATM, men ikke i nærværelse af kemisk inhiberede ATM [20]. Disse data er i overensstemmelse med en rapport ved hjælp af andre metoder til H2AX detektion [21], hvor den oprindelige H2AX foci dannelse (30 min efter IR) blev afskaffet, når man kombinerer ATM og /eller DNA-PK-inhibitorer. En anden rapport modsiger med vores data [22], hvor de demonstrerede DNA-PK spiller dominerende rolle i H2AX foci dannelse i fravær af ATM-funktion; men denne rapport anvendte cellelinier, der mangler enten ATM eller DNA-PK, hvilket ikke er tilfældet i vores cellelinjer. Derudover inhiberer både ATM og DNA-PK ikke resulterede i øget H2AX signal på alle tidspunkter. Dette antyder, at ATR (den tredje kinase impliceret i H2AX phosphorylering) ikke er i stand til at udføre denne phosphorylering funktion i nærvær af ATM og DNA-PK, selv når begge er hæmmet. En interessant fremgangsmåde ville være at undersøge effekten på RAD51 foci dannelse, når disse kinaser hæmmes.

Den centrale rolle ATM og DNA-PK i reparation DNA DSB i pattedyrceller viser, at banker ned funktion enten eller begge proteiner bør øge antallet af DNA DSB’er efter et inducerende behandling. Brug af den neutrale comet assay vi viste, at inhibering af ATM og /eller DNA-PK resulterede i øget antal DNA DSB’er følgende IR eller doxorubicin behandling. En additiv virkning blev observeret i behandlingsarme hvor begge kinaser blev inhiberet. Det er interessant, at de komet haler er næsten ens i de enkelte inhibitor arme, selv om det ville forventes, at DNA-PK inhibitor skulle forårsage mere øges i DSBs som NHEJ er den vigtigste vej til reparation af DNA DSB’er. Dette kan være fordi vi gennemførte kometen assay på 24, hvilket er mere fysiologisk meningsfuld for cellerne, men ikke nødvendigvis afspejler reparation kinetik. De fleste DSBs repareres hurtigt ved NHEJ og derefter langsommere kinetik ved HR for resterende frank DSBs og DSBs følge gået i stå replikationsgaffel. ATM indvirkninger på HR derfor KU55933 vil aftage denne langsomme fase yderligere og dermed et større antal pauser på 24 timer i forhold til, når HR ikke hæmmes (kontrol og DNA-PK inhibitor arme).

Sammenfattende dette undersøgelsesrapporter en ny behandling af prostatakræft ved at målrette DNA DSBs reparation maskiner. Vi viser, at målrette DSB reparation giver en forbedret kemo- og radio-følsomhed i hormon følsomme og ufølsomme CaP cellelinjer forbundet med øget programmeret celledød. Yderligere evaluering af de specifikke inhibitorer skal gennemføres i dyremodeller, herunder vurdering af plasma tilgængelighed, toksicitet og effekt inden vi går videre mod et klinisk forsøg.