PLoS ONE: nedregulering af histon H3 lysin 9 Methyltransferase G9A inducerer centrosom forstyrrelser og kromosom Ustabilitet i cancerceller

Abstrakt

Baggrund

Ændringer af histon aminoterminale haler påvirker adgang regulatoriske faktorer og komplekser til kromatin og dermed påvirke biologiske processer. Kræftceller er kendetegnet ved fremtrædende epigenetiske dysregulering, herunder histon modifikationer. Men de funktionelle roller histon methyltransferaser (HMT) i kræft er fortsat uklare.

Metodologi /vigtigste resultater

Vi studerede RNAi-baserede hæmning (knockdown, KD) på 2 forskellige H3K9 HMTs, SUV39H1 og G9A. Knockdown af de 2 HMTs i PC3 cancercellelinie inhiberes markant cellevækst og forårsagede dybtgående morfologiske ændringer med tab af telomeraseaktivitet og forkortede telomerer. SUV39H1 KD celler viste væsentlig stigning i G2 /M-fraktionen. G9A KD-celler viste øget DNA-indhold (1,7 gange i 2 uafhængige kloner) sammenlignet med FACS analyser til kontrol. Karyotype analyser viste, at dette skyldtes et øget antal kromosomer (61-102) i G9A KD celler sammenlignet med forældrenes PC3. Interessant nok fandt vi abnorm centrosom morfologi og antal i omkring 25% af G9A KD celler, mens centrosomer var morfologisk normale i kontrolceller. Microarray analyser efter KD på SUV39H1 eller G9A udviste meget få gener opreguleret blandt de 39.000 gener. De tavse tumorsuppressorgener

p16

og

RASSF1A

ikke blev aktiveret i KD celler.

Konklusioner /Betydning

Disse data tyder på, at de 2 HMTs , SUV39H1 og G9A er forpligtet til at forevige den maligne fænotype. Endvidere G9A spiller en kritisk rolle i reguleringen af ​​centrosom duplikering formentlig gennem kromatinstrukturen snarere end gennem at påvirke genekspression i cancerceller. Målretning disse histon methyltransferaser kan være af terapeutisk fordel i kræft

Henvisning:. Kondo Y, Shen L, Ahmed S, Boumber Y, Sekido Y, Haddad BR, et al. (2008) nedregulering af histon H3 lysin 9 Methyltransferase G9A inducerer centrosom forstyrrelser og kromosom Ustabilitet i kræftceller. PLoS ONE 3 (4): E2037. doi: 10,1371 /journal.pone.0002037

Redaktør: Axel Imhof, universitetet i München og Center of Integrated Protein Science, Tyskland

Modtaget: December 26, 2007; Accepteret: 10 marts 2008; Udgivet: 30 April, 2008

Copyright: © 2008 Kondo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde understøttes af tilskud CA098006 og CA100632 fra NIH (JPJI) og en bevilling fra Japan Society for fremme af Science (YK)

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kromatin forsamlingsfrihed er en kritisk proces relateret til DNA-replikation, genekspression og progression gennem cellecyklus. Specifikke modifikationer er forbundet med visse DNA-template-medierede processer [1]. Methylering af histon H3 lysin 9 (H3K9) er en af ​​de mest velundersøgte histon modifikationer. Efter den indledende identifikation af SUV39h1 foruden den meget relateret SUV39h2 som H3K9-specifik histon methyltransferase (HMT) [2], mindst tre andre HMTs, G9A, ESET /SETDB1 og EuHMTase1, er blevet anerkendt som HMTs for H3K9 i pattedyr [3] – [5]. Disse enzymer har forskellige tilhørsforhold for de un-, mono- eller dimethylerede stater og producere forskellige methylering. Studier i knockout-mus for Suv39h1, 2 og G9A afslørede, at G9A er primært ansvarlig for monomethylation (1Me) og dimethylering (2Me) af H3K9, mens Suv39h1 og Suv39h2 direkte trimethylation (3Me) i H3K9. Desuden 1Me og 2Me på H3K9 bor primært i euchromatin, mens 2Me og 3Me på H3K9 findes inden for forskellige typer af heterochromatin, fakultativ og konstitutive heterochromatin hhv. Disse resultater tyder på, at 1Me, 2Me eller 3Me på K9H3 besætte distinkte kromosom-domæner, og hver af de tre stater i H3K9 methylering spiller en unik rolle i den strukturelle og funktionelle organisering af kromosomer.

Regulering af højere orden kromosom struktur påvirker mitotisk fidelity og sikrer balanceret kromosom segregation. Heterochromatin samling på centromerer letter både kinetochore dannelse og søsterkromatid samhørighed [6]. Endvidere dannelsen af ​​kromatin strukturer på telomerer tjener også til at fastholde længden af ​​telomer repeats [7]. Studier i fission gær viste, at interaktionen mellem 3MeH3K9 og Swi6 /HP1 er påkrævet for kromosom segregering i mitose [8]. I pattedyr, mitotiske kromosomer vise beriget 2MeH3K9 på centromere regioner og udtales 3MeH3K9 på pericentric heterochromatin. Knockout af Suv39h1 og Suv39h2 i mus resulterer i udbredt genomisk ustabilitet og øget forekomst af lymfomer, hvilket antyder, at 3MeH3K9 er en kritisk ændring opretholde kromosomale miljøer [2]. 2MeH3K9 har også været impliceret i DNA-methylering associeret gen silencing [9] – [11], men enzymet kontrol af denne begivenhed er ikke defineret

Kræftceller er kendetegnet ved fremtrædende epigenetiske dysregulering, herunder ændret kromatin. modifikation. Tidligere fandt vi øget niveau af G9A i humane kræftformer [12], selv om den funktionelle rolle HMTs overekspression i kræft er fortsat uklart. Her viser vi, at knockdown (KD) i G9A og SUV39H1 i kræftceller bemærkelsesværdigt hæmmede cellevækst og førte til morfologisk senescentceller med telomer abnormiteter. Vi fandt, at G9A KD men ikke SUV39H1 KD inducerer omfattende kromosom ustabilitet og centrosom forstyrrelser. Disse data tyder på, at G9A samt SUV39H1 er forpligtet til at opretholde den maligne fænotype og kunne være gyldige terapeutiske mål i human neoplasi.

Materialer og Metoder

cellelinier, kultur Betingelser og Drug Treatment

prostatacancer-cellelinie PC3, lungekræft cellelinien H1299 og brystcancer MCF7 blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). De blev dyrket i RPMI-medium (Invitrogen, Carlsbad CA), plus 10% FBS i plast vævskulturplader i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2 ved 37 ° C. Celler blev delt 12-24 timer før 5-Aza-2′-deoxycytidin (DAC, Sigma, St. Louis, MO) behandling. Celler blev derefter behandlet med enten 1 uM DAC eller PBS (kontrol) dagligt i 3 dage.

RNA Interference

Vi designede en retrovirusvektor (RNAi-Ready pSIREN-RetroQ Vector, BD Biosciences) koder en lille hårnål RNA (shRNA) rettet mod G9A og SUV39H1 i PC3 (målsekvenser af 5′-AAGATTGAGCCTCCGCTGATT-3 ‘og 5′-AATCTCAAGTGTGTGCGTATC-3’ for G9A og SUV39H1 henholdsvis). Som kontrol brugte vi shRNAs for Luciferase (Luc) syntetiseret af BD Biosciences eller shRNA vektor uden hårnål oligonukleotider.

chromatin Immunfældning (chip)

chip assays blev udført på grundlag af en ændring af tidligere offentliggjorte fremgangsmåder [13]. Kort fortalt behandles celler med 1% formaldehyd i 8 minutter for at tværbinde histoner til DNA. Cellepellets resuspenderes i lysepuffer og sonikeret 8 sek syv gange. Lysatet inkuberes med 10 pi anti-K4 dimethylerede histon H3, anti-K9 acetyleret histon H3, anti-K9 dimethylerede histon H3 (Upstate Biotechnology, Charlottesville, VA) og anti-histon H3-antistof (som en intern kontrol, Abcam, Cambridge, UK) ved 4 ° C natten over. To% af den samlede lysat anvendes til input kontrol. DNA ekstraheres ved phenol /chloroform-metoden, ethanol-præcipiteret og resuspenderet i vand. Chip produkter blev anvendt til kvantitativ PCR med oligonukleotidprimerne beskrevet i tabel S1. Til kvantificering, blev TaqMan Q-PCR’er udført i en ABI Prism 7000-instrument (Applied Biosystems, Foster City, CA) i to eksemplarer til de målgener.

immunblotting

Immunoblotting blev udført med primære antistoffer for anti-G9A (Abcam), anti-SUV39H1, anti-K9 dimethylerede histon H3, anti-K9 trimethyleret histon H3 (Upstate Biotechnology), histon H3 (Abcam) og ß-actin (Sigma).

RT -PCR Analyser

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse af TRIzol (Invitrogen), og 2 pg blev revers transkriberet med MLV-revers transkriptase (Invitrogen). Primersekvenserne anvendes, er beskrevet i tabel S1. PCR-protokol til RT-PCR var 95 ° C i 4 min, efterfulgt af 35 cykler af 30 sekunder ved 95 ° C, 30 sekunder ved 55 ° C og 30 sekunder ved 72 ° C, og derefter en 5 min endelig udvidelse ved 72 ° C. TaqMan Q-PCR’er blev udført i to eksemplarer til målgenerne G9A, SUV39H1 og GAPDH hjælp sonde sætter Hs00198710_m1, Hs00162471_m1 og Hs 00266705_gl henholdsvis (Applied Biosystems).

Bisulfite Pyrosequencing Methylering Analyse

vi udførte bisulfitbehandling som tidligere [14] rapporterede. Kort fortalt 2 ug genomisk DNA blev denatureret med 2 M NaOH i 10 minutter, efterfulgt af inkubation med 3 M natriumbisulfit (pH 5,0) i 16 timer ved 50 ° C. Efter behandling blev DNA oprenset ved anvendelse af en Wizard Miniprep Column (Promega, Madison, WI), præcipiteret med ethanol og resuspenderet i 30 pi fortyndet vand. Vi anvendte en yderst kvantitativ metode til at vurdere DNA-methylering niveau baseret på Pyrosekventering teknologi [15] (Pyrosequencing AB, Uppsala, Sverige). Primer sekvenser er beskrevet i tabel S1.

SA-ß-gal Analyse

PC3 celler inficeret med retrovirus koder G9A-shRNA, SUV39H1-shRNA eller kontrol-shRNA blev undersøgt for SA-SS gal aktivitet som tidligere beskrevet [16].

RNA microarray analyse

Total RNA blev ekstraheret fra celler inficeret med enten G9A-shRNA, SUV39H1-shRNA eller kontrol-shRNA som beskrevet ovenfor. Mål for microarray hybridisering blev genereret fra RNA’et ifølge producentens instruktioner (Affymetrix, Santa Clara, CA). Det humane U133A gen chip (Affymetrix), som indeholder ~33,000 transkripter blev anvendt til genekspression profilering. Hybridisering, vask, scanning og analyse af gen-chips blev udført ifølge producentens anvisninger. Ekspressionsniveauer blev analyseret ved den statistiske algoritme i microarray analyse Suite (MAS) 5.0 software (Affymetrix) under anvendelse af standardparametre. Dataene fra kontrol-shRNA behandling og forældreorlov PC3 blev brugt som en baseline udtryk for sammenligning med enten G9A-shRNA eller SUV39H1-shRNA behandlede prøve.

Måling af Telomerase Aktivitet

Telomerase-aktivitet var analyseret ved en modificeret metode ifølge standarden telomerase repeat amplifikationsprotokol (TRAP), Trapeze telomerase Detection Kit (Millipore, Billerica, MA) i overensstemmelse med producentens instruktioner. Reaktionsprodukter blev kørt på en 15% indfødte polyacrylamid gel og farvet med ethidiumbromid.

Immunofluorescens Cytogenetiske

G9A-shRNA, SUV39H1-shRNA eller kontrol-shRNA behandlet PC3 celler blev dyrket på Falcon kultur slides (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ). Anti-CENP-A monoklonalt antistof (Abcam), anti-K9 dimethylerede histon H3 og anti-K9 trimethyleret histon H3 polyklonale antistoffer (Upstate Biotechnology) blev anvendt som primære antistoffer. Centrosomer blev detekteret med en γ-tubulin polyklonalt antistof (Sigma) under anvendelse af en standardprotokol [17]. Det primære antistof blev påvist med Alexa Fluor 488-konjugat gede-anti-muse-antistof (Invitrogen), Alexa Fluor 546-konjugat gede-anti-kanin-antistof (Invitrogen) eller fluorescein-konjugeret gede-anti-kanin-antistof (Sigma), og cellerne blev modfarvet med 4 ‘, til 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), og indlejret i anti-fade-opløsning (200 mM DABCO, 90% vol /vol glycerol, 20 mM TRIS-HCI, pH 8) reducere foto-blegning. Scoring af celler og digitale billede erhvervelse blev udført ved hjælp af en 63 × mål monteret på en Leica DMRBE mikroskop (Leica, Wetzlar, Tyskland) udstyret med optiske filtre til DAPI og FITC (Chroma Technologies, Brattleboro, VT) og en afkølet charge coupled device ( CCD) kamera (Photometrics, Tucson, AZ). Den IPLab softwarepakke (Scanalytics Inc, Fairfax, VA) blev anvendt til erhvervelse og behandling image. For hver af de 3 cellepræparater (kontrol, G9A-shRNA eller SUV39H1-shRNA behandlede celler) blev 100 kerner scoret af to uafhængige observatører.

telomerlængde Analyse

G9A-shRNA, SUV39H1 -shRNA eller kontrol-shRNA-behandlede PC3 celler blev evalueret for telomer afkortning hjælp af Telo-FISH metode til at visualisere telomerer i interfase cellepopulationer, som tidligere [18] beskrevet. Kort fortalt blev FISH-analyse udført ved anvendelse af et kommercielt tilgængeligt Cy3-konjugeret peptidnukleinsyre (PNA) telomere probe pr fabrikantens (DAKO Corporation, Carpinteria, CA) instruktioner. Uafhængig analyse blev udført ved to blindede observatører bruger Leica DMRBE mikroskop udstyret med et Cy3 og 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) filtre. Mere end 100 interfase kerner blev visuelt vurderet, og digitale billeder blev opnået ved hjælp af en afkølet CCD (Charge Coupled Device) kamera.

Resultater

For at vurdere betydningen af ​​SUV39H1 og G9A i kræft, først vi etableret kloner af PC3, hvor en af ​​disse 2 HMTs blev stabilt nedreguleret af shRNA. Vi brugte PC3, da endogen SUV39H1 og G9A var stærkt til udtryk i denne celle. I disse knockdown (KD) kloner blev ekspression af de 2 HMTs reduceret med 80-90% (fig. 1A og 1B). KD celler for G9A (G9A-KD) viste reduktion af den samlede 2MeH3K9 og 3MeH3K9. KD celler for SUV39H1 (SUV-KD) reducerede samlede 3MeH3K9 men ingen bemærkelsesværdig ændring på 2MeH3K9 (fig. 1B). 2MeH3K9 var bredt påvist i kerner af kontrol celler, herunder EU- og heterochromatic region (fig. 1C). Imidlertid viste det G9A-KD cellekerne selektivt svækket bred euchromatic farvning af 2MeH3K9 og indeholdt kun slørede prikker, som var overlappende med pericentric region (tæt farvet med DAPI) og centromerregionen (farvet med CENP-A). 3MeH3K9 blev fundet på pericentric region og centromerregionen i kontrol celler. SUV-KD celler viste formindsket 3MeH3K9, men ikke helt, på heterochromatic brændpunkter og ændrede ikke signifikant de 2MeH3K9 stater (Fig. 1C). G9A-KD påvirkede ikke signifikant 3MeH3K9 mønstre af pericentric region og centromerregionen. Disse resultater var i overensstemmelse med de tidligere G9a- mangelfulde ES celle undersøgelser [19], [20]. Interessant, viste det sig, at G9A-KD påvirkede H3K9me3 status euchromatic region.

Real-time PCR (A) og Western blotting (B) viser, at shRNA interferens effektivt nedregulerer G9A eller SUV39H1 udtryk. Fejlsøjler i real-time PCR indikerer standardafvigelse for ekspression i mere end 3 uafhængigt isolerede kloner. Vedrørende H3 modifikationer, den G9A-KD (2 uafhængige kloner) celler viser indskrænkning af 2MeH3K9. Derimod SUV-KD reducerede samlede 3MeH3K9 men ingen bemærkelsesværdig ændring på 2MeH3K9. C, H3-K9 methylering blev analyseret ved immunfluorescens med 2MeH3K9 (rød, venstre) eller 3MeH3K9 (rød, højre) specifikke antistoffer i kontrol celler (Ctrl), G9A-KD-celler eller SUV-KD-celler. 2MeH3K9 var bredt påvist i kontrol kerner. Den G9A-KD kerne afslørede svage prikker af 2MeH3K9 overlappende med DAPI-tætte (blå) loci og CENP-A farvning (grøn). som repræsenterer den pericentric region og centromerregionen hhv. SUV-KD reducerede 3MeH3K9 på heterochromatic brændpunkter og ikke i væsentlig grad ændre euchromatic farvning af 2MeH3K9 stater. Cellestørrelse er i forhold til den 10-um bar. D, G9A-KD og SUV-KD resultat i stærk vækst hæmning. Celler blev udpladet ved samme densitet og talt dagligt af trypanblå eksklusion. Udfyldte cirkler, udfyldte trekanter og fyldte firkanter angiver væksten af ​​kontrollen, SUV-KD og G9A-KD-celler, hhv. Fejlsøjler på grafen angiver standardafvigelsen fra tredobbelte eksperimenter. E, Nedregulering af to histon methyltransferaser resultere i en bemærkelsesværdig morfologisk ændring, som farves positivt for SA-beta-gal, hvilket indikerer induktion af senescens. Cellestørrelse er relativ til 50 um bar.

Både SUV-KD og G9A-KD udviste markant inhiberede cellevækst og dybtgående morfologiske ændringer, forstørret og fladtrykte former. (Fig. 1D og 1E). Senescens forbundet ß-galactosidase-analyse (SA-ß-gal-analyse) viste, at dette morfologisk ændring var i overensstemmelse med induktion af cellulær ældning.

Induktion af cellulær begyndende alderdom som respons på stimuli afhænger primært af p53 eller p16-pRB pathways [21]. Da p16 er bragt til tavshed af DNA methylering i PC3 og dens p53 status er nul, vi næste undersøgt p16 reaktivering i G9A-KD og SUV-KD-celler. I modsætning til behandling med DNA methyltransferase inhibitor 5-aza-2′-deoxycytidin (DAC), fandt vi p16 aktivering i hverken G9A-KD eller de SUV-KD-celler i overensstemmelse med en effekt på epigenetisk status af promotorregionen ( fig. 2). Vi undersøgte også en anden tumorsuppressorgen,

RASSF1A

, som er et mål for DNA methylering i PC3, og fandt, at der ikke var nogen effekt på gen-reaktivering i enten G9A-KD eller SUV-KD-celler. Da DNA methylering, en afgørende epigenetisk mekanisme til at lukke munden på tumorsuppressorgener i human neoplasi, er blevet mekanisk forbundet med histon 2MeH3K9 methylering [9] – [11]., Kan disse data forklares med kompensation fra andre HMTs

A, RNA-ekspression af hvert gen blev undersøgt ved RT-PCR. I modsætning til 5-aza-2′-deoxycytidin (DAC) behandling, hverken G9A-KD eller SUV-KD genaktiverer p16 og RASSF1A ekspression. p21 og GAPDH anvendes til aktive gen kontrol. B, blev DNA methylering ændringer på p16 og RASSF1A promotorer analyseret af pyrosekventering kvantitativ metode. I overensstemmelse med udtrykket status for begge gener, DNA methylering faldet med DAC behandling, hvorimod der ikke observeret nogen ændringer i enten G9A-KD eller SUV-KD-celler. Fejlsøjler på grafen angiver standardafvigelsen fra tredobbelte eksperimenter. C, er Histon modifikationer undersøgt af Chip angivet nedenfor kolonnerne. K4Me, K9Ac, K9Me og Ab (-) angiver K4 dimethylering, K9 acetylering, K9 dimethylering og ingen antistof kontrol hhv. Y-aksen repræsenterer forholdet mellem hver IP til en kerne histon H3 immunfældning. Sorte bjælker, hvide barer og grå søjler indikerer Chippen fra mock kontrol, G9A-KD og SUV-KD celler. p21 blev brugt som et aktivt gen kontrol, hvor aktive histon mærker, K4Me og K9Ac, er høje. Fejl barer på grafen angiver standardafvigelsen fra tredobbeltforsøg.

For at undersøge target gener af H3K9 methylering afhængig lyddæmpning ved enten G9A eller SUV39H1, vi analyserede gener opreguleret efter hæmning af G9A eller SUV39H1 hjælp oligonukleotid mikroanalyse. I analysen af ​​de array-data, først vi valgte gener med signalintensiteter på 50 eller mindre i enten forældre- eller kontrol shRNA-behandlede PC3 (dvs. tavse gener). Så vi søgte efter gener med signalintensiteter steget mere end 2 gange efter KD enten G9A eller SUV39H1. Efter fjernelse af selvstændige inkonsekvent prober blandt det samme gen, kunne vi identificere kun 4 og 6 gener (3-gener er almindelige) i G9A-KD og SUV-KD-celler, hhv. Vi undersøgte de 7 gener ved RT-PCR og fandt, at kun 2 gener,

Klotho

vækst differentiering faktor 8 Hotel (

GDF8

), blev virkelig bragt til tavshed i kontrolgruppen celler og opreguleret i både G9A-KD og SUV-KD-celler (data ikke vist). Således er meget få gener opreguleret efter hæmning af de 2 HMTs i PC3. Selv G9A og SUV39H1 generelt er involveret i gendæmpning, fandt vi, at 12 og 2 gener (2-gener var almindelige) blev nedreguleret i G9A-KD og SUV-KD-celler (tabel S2). Nedregulering af de få gener kan skyldes de sekundære virkninger af G9A-KD og SUV-KD.

Trods minimale virkninger på genekspression, blev observeret markant inhiberede cellevækst i både G9A-KD og SUV-KD celler. Vi undersøgte disse celler ved FACS analyser til bestemmelse af involverede mekanisme. Vi fandt, at G9A-KD-celler viste øget DNA-indhold (1,7 gange i 2 uafhængige kloner) og SUV-KD-celler påvist betydelige stigninger i G2 /M-fraktion (fra 29% til 40%) sammenlignet med kontrolgruppen (fig. 3A). I overensstemmelse med disse data, karyotype analyser (fig. 3B) viste et øget antal kromosomer i G9A-KD-celler sammenlignet med SUV-KD-celler og den parentale PC3 cellelinjen (fig. 3B). Antal af kromosomet blev talt i mere end 8 kerne af hver KD celle (fig. 3B). G9A-KD celler viste signifikant øget kromosom numre (gennemsnit 119 kromosomer,

P

0,01) end SUV-KD-celler (63 kromosomer) og kontrol-celler (65 kromosomer). Dette var tilfældet uanset cellelinien, der anvendes. Både stabile G9A-KD kloner af brystcancer MCF7 og lungekræft cellelinien H1299 viste også et forøget antal kromosomer sammenlignet med kontrolceller (MCF7-kontrol vs MCF7-G9A-KD, 60 kromosomer vs 98 kromosomer; H1299- kontrol vs H1299-G9A-KD, 72 kromosomer vs 104 kromosomer;. Figur S1)

A, FACS analyser viser DNA-indholdet øges 1,5-2 gange i de G9A-KD celler sammenlignet med mock kontrol i to uafhængigt isolerede kloner (G9A-C1 og C2). SUV-KD-celler udviser en høj mængde af G2M celler sammenlignet med mock kontrol. B, viste karyotype analyser 61, 102 og 61 kromosomer i kontrolgruppen PC3, den G9A-KD og SUV-KD cellelinjer, hhv. Kromosom nummer er bemærkelsesværdigt forøget i G9A-KD-celler. Antal af kromosomet blev talt i mere end 8 kerne af hver KD celle. G9A-KD celler viste signifikant øget kromosom antal end de SUV-KD celler og kontrol celler. Y-aksen angiver antallet af kromosom. Fejlsøjler indikerer standardafvigelse. *,

P

0,01. C, Kerner blev farvet med DAPI. Centrosomer blev påvist under anvendelse af et antistof mod γ-tubulin. I kontrolcellerne og SUV-KD-celler, er 1-2 centrosomer opført som punkt-lignende strukturer ses i hver celle. I G9A-KD-celler, unormal centrosom morfologi og antal, antyder centrosom amplifikation blev observeret i ca. 25% af cellerne. Unormalt forstærkede centrosomer er forstørret i kasserne.

centrosomer er afgørende for korrekt cellulære polaritet og afbalanceret fordeling af kromosomer [22]. Vi anvendte et antistof mod γ-tubulin at evaluere centrosomer i KD celler. Selv om de fleste af cellerne i både kontrol- og G9A-KD viste normal (1 til 2) centrosom numre, vi har registreret centrosom amplifikation i ca. 25% af cellerne i de G9A-KD-celler. Dette blev ikke påvist i kontrolcellerne og SUV-KD-celler (fig. 3C). Centrosom abnormitet blev også observeret i både MCF7-G9A-KD-celler og H1299-G9A-KD-celler i omkring 20% ​​af cellerne (figur S1). Således kan G9A spille en kritisk rolle i reguleringen centrosom overlapning, formentlig gennem kromatinstrukturen snarere end ved at påvirke genekspression i cancerceller.

chromatinstruktur på telomerer er også vigtigt at opretholde længden af ​​telomer repeats [7 ]. Vi undersøgte telomer funktion i G9A-KD og SUV-KD-celler. Først brugte vi telo-FISH assay til at evaluere telomer længde. Væsentlig reduktion i telomer signalintensitet blev observeret i G9A-KD og SUV-KD behandlede PC3-celler, i sammenligning med kontrolcellerne antyder, at reguleringen af ​​telomer længde blev afbrudt i disse KD celler. Et repræsentativt eksempel på faldet i telomer signal er vist på figur 4A. Vi kvantificerede næste telomeraseaktivitet i de celler, som TRAP-assay og fundet reduktion af telomeraseaktivitet i G9A-KD-cellelinie (fig. 4B). Derfor kan den forkortede telomerlængde i G9A-KD-celler være resultatet af ændret telomeraseaktivitet. Det lavere niveau af hTERT ekspression i G9A-KD celler underbygger disse fund (fig. 4C). I modsætning hertil viste SUV-KD-celler tilsvarende niveauer af telomeraseaktivitet til kontrolcellerne, hvilket indikerer, at telomer dysfunktion i SUV-KD-celler kan afhænge af andre end hTERT-ekspression mekanismer, sandsynligvis på grund af ændringer af H3K9 status for methylering ved telomere heterochromatin.

A blev interfasen kerner hybridiseret med Cy3-konjugeret peptidnukleinsyre (PNA) telomere probe og modfarvet med DAPI. Markant reduktion i telomer signalet observeret i interfase cellekerner fra KD-celler sammenlignet med kernerne fra styreledningen. Vist i indsatsene er de forstørrede billeder af de angivne områder. B, Telomeraseaktivitet bedømmes ved TRAP-assay. Prøver med telomeraseaktivitet producere en 6-base, inkremental stige af TRAP produkter på gelerne. kontrolbånd interne vises i bunden af ​​gelen. Reduceret signal intensitet telomeraseaktivitet, overholdes i de G9A-KD-cellelinier. Signalet ikke observeret, når ekstrakterne forbehandles med varme at afskaffe proteinkomponenterne af telomerase, hvilket tyder telomerase specificiteten af ​​signalet målt ved dette assay. C, ekspressionsniveauet af hTERT blev målt ved real-time PCR. hTERT udtryk er faldet i de G9A-KD celler i forhold til dem i kontrolgruppen PC3 og SUV-KD-celler. Fejl søjler indikerer standardafvigelse af de 3 uafhængige analyser.

Dsicussion

Den aktuelle undersøgelse viser, at ekspressionen af ​​SUV39H1 og G9A er vigtigt at støtte væksten af ​​maligne celler, selv om de spiller distinkte roller i kræftceller. Uventet, meget få gener opreguleret efter inhibering af de 2 HMTs, hvilket antyder, at H3K9 methylering associeret lyddæmpning, som er blevet mekanisk forbundet til DNA methylering [9] – [11], er stabile, når den er etableret i cancerceller, muligvis gennem handling af flere HMTs.

Centromer medierer flere segregation funktioner, herunder kinetochore dannelse, spindel-medierede bevægelser, søster samhørighed og en mitotisk checkpoint [6]. Den pericentric heterochromatin arkitektur spiller afgørende roller i kromosomal adskillelse samt i oprettelse transkriptionel repression. Tabet af Suv39h1 og Suv39h2 HMTases i musemodel afskaffet H3-K9 methylering på pericentric heterochromatin og induceret kromosomal ustabilitet. Men enkelt gen forstyrrelser for enten Suv39h1 eller Suv39h2 ikke at påvirke levedygtighed og frugtbarhed mutant mus, hvilket tyder disse to enzymer er overflødige [2]. Undersøgelse i G9A knockout mus viste, at G9A var nødvendig for embryonal udvikling eller differentiering og embryonale vækst defekt i G9A-deficiente ES-celler kan skyldes apoptotisk celledød men ikke cellecyklusstandsning. I denne model blev kromosomal instabilitet ikke opfattes i knockout celler [19]. Vi fandt her, at i cancerceller, hvor man ofte afvigende antal kromosom, G9A KD induceret centrosom forstyrrelser og mere omfattende kromosom ustabilitet, hvilket resulterede i inhibering af cellevækst og cellulær aldring. Det viste sig, at 3MeH3K9 blev også formindsket ved euchromatic region i G9A KD celler. Dette kan skyldes den drastiske faldende af 2MeH3K9, hvilket er forudsætningen for modifikation af tri-methylering på loci. Disse data antydede, at den rolle G9A i cancerceller er kritisk og synes at være beskyttende yderligere kromosomal forstyrrelser. Derimod enkelt Suv39H1 KD delvist afskaffet 3MeH3K9 på pericentric region, men kunne ikke fremkalde kromosomal ustabilitet, sandsynligvis på grund af afskedigede roller for SUV39H HMTases [2].

De seneste rapporter viste, at centromerregionen kromatin specifikke kombinationer af histon modifikationer og tre-dimensionelle organisation af kromosomer kunne også være vigtigt for rekruttering af samhørighedsfondene komplekser til heterochromatin nær søster kinetochores [23] [24]. 2MeH3K9 chromatin, som er til stede i det indre kinetochore rummet mellem mitotiske søsterchromatider og i regioner, der flankerer centromere chromatin, kunne tilskrives stilling CENP-A mod poleward flade af det mitotiske kromosom [25]. Den reducerede niveau af 2MeH3K9 om flankerende region i centromer chromatin ved G9A KD kan påvirke tredimensionale organisering af centromerfusioner kromosomer, hvilket resulterer i det kromosomale ustabilitet vi fundet her.

centrosomer begynder at duplikere på det sene G1 /tidlige S-fase af cellecyklussen, og to funktionelle centrosomer dannes under G2 [22]. Hvis celler ikke undergå cytokinese efter DNA-syntese og den næste celle cyklus genoptages, kan de have to gange den normale DNA-indhold og centrosom nummer. Således er den aktuelle data foreslog, at svigt i cytokinese kunne være en forklaring på de abnormiteter i kromosomal nummer og centrosomer i G9A-KD celler.

G9A synes at være nødvendig for hTERT udtryk og telomer vedligeholdelse. SUV39H1 er også påkrævet til styring telomer regulering. I musemodel, embryonisk fibroblast fra mus null med både Suv39h1 og Suv39h2 viste unormal telomer forlængelse [26]. Ophævelse af de to HMTs resulterede i tab af heterochromatic funktioner på telomerer i embryonale stamceller og mus embryonale fibroblaster. Vore data antydede, at SUV39H1 KD i cancerceller har kortere telomerer. Årsagerne til, at vi fandt afkortning af telomerer i SUV39KD celler i modsætning til de tidligere resultater kan skyldes celletyperne undersøgt (dvs. normale celler versus cancerceller), da telomer funktion generelt blev aberrerende reguleret i cancerceller [27]. Yderligere undersøgelser er nødt til at tage fat på de mekanistiske forbindelser mellem G9A, SUV39H1 og kromosomale /telomer strukturer samt hTERT udtryk i kræftceller. Det kan også være interessant at se, om de enkelte effekter af G9A og SUV39H1 er samarbejdsvillig, når de er begge opbrugt, og om genindførelse af de to HMTs vender fænotype. Ikke desto mindre er rettet mod disse histon methyltransferaser kunne være af terapeutisk fordel i kræftbehandling.

Støtte Information

figur S1.

Nedregulering af G9A methyltransferase i MCF7 og H1299 cellelinier. A, Real-time PCR viser, at shRNA interferens effektivt nedregulerer G9A i MCF7 og H1299. Fejlsøjler i real-time PCR indikerer standardafvigelse for ekspression i 3 uafhængigt isolerede kloner. B, FACS-analyser viser DNA-indholdet øges 1,5-2 gange i de G9A-KD-celler sammenlignet med mock kontrol i en isoleret klon. Øget indhold DNA blev observeret i to uafhængigt isolerede kloner (data ikke vist). C, viste karyotype analyser små og øgede kromosomer i både MCF7-G9A-KD og H11299-G9A-KD-cellelinier. D, centrosomer blev påvist under anvendelse af et antistof mod γ-tubulin. I kontrolcellerne, er 1-2 centrosomer opført som punkt-lignende strukturer set. Unormal centrosom morfologi og nummer observeres i ca. 20% af de G9A-KD celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0002037.s001

(2,67 MB EPS)

tabel S1.