PLoS ONE: Gefitinib og Luteolin Årsag Vækst Anholdelse af human prostatacancer PC-3 Cells via hæmning af cyclin G-associeret kinase og Induktion af miR-630

Abstrakte

cyclin G-associeret kinase (GAK), en central aktør i clathrin-medieret membran menneskehandel, er overudtrykt i forskellige kræftceller. Her rapporterer vi, at GAK udtryk er positivt korreleret med Gleason score i kirurgiske prøver fra patienter med prostatacancer. Embryonale fibroblaster fra knockout mus, der udtrykker en kinase-døde (KD) form af GAK udviste konstitutiv hyper-phosphorylering af epidermal vækstfaktor-receptor (EGFR). Ud over den velkendte EGFR inhibitorer gefitinib og erlotinib, kosten flavonoid luteolin var en potent inhibitor af Ser /Thr-kinase aktivitet af GAK

in vitro

. Samtidig administration af luteolin og gefitinib til PC-3 celler havde en større effekt på cellernes levedygtighed end administration af enten alene forbindelse; dette fald i levedygtighed var forbundet med drastiske nedregulering af GAK proteinekspression. En omfattende microRNA array analyse afslørede forøget ekspression af MIR-630 og MIR-5703 efter behandling af PC-3-celler med luteolin og /eller gefitinib, og eksogen overekspression af MIR-630 forårsagede vækststandsning af disse celler. GAK synes at være afgørende for celledød, fordi samtidig administration af gefitinib og luteolin til EGFR-mangelfulde U2OS osteosarcomceller også haft en større effekt på cellernes levedygtighed end administration af begge forbindelser alene. Tilsammen tyder disse resultater på, at GAK kan være en ny terapeutisk mål for prostatakræft og osteosarkom

Henvisning:. Sakurai MA, Ozaki Y, Okuzaki D, Naito Y, Sasakura T, Okamoto A, et al. (2014) Gefitinib og Luteolin Årsag Vækst Anholdelse af human prostatacancer PC-3 Cells via hæmning af cyclin G-associeret kinase og Induktion af miR-630. PLoS ONE 9 (6): e100124. doi: 10,1371 /journal.pone.0100124

Redaktør: Ichiro Aoki, Yokohama City University School of Medicine, Japan

Modtaget: Februar 20, 2014 Accepteret: 21. maj 2014 Udgivet: 27 juni 2014

Copyright: © 2014 Sakurai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud-in-Støtte til videnskabelig forskning S (nr 15.101.006), Videnskabelig Forskning B (nr 20.370.081 og 23.370.086), og sonderende forskning (nr 21.651.085) til HN; og videnskabelig forskning C (nr 22.570.185) til NY fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatacancer er en af ​​de hyppigst diagnosticerede cancere og er den førende årsag til mandlige kræftdødsfald verdensplan [1]. Fordi det er primært drevet af androgen receptor (AR) signalering, er fremskreden prostatacancer behandles typisk ved androgen deprivation terapi, hvori kirurgisk eller medicinsk kastration udføres for at blokere aktiv AR signalering enten ved at fjerne liganden eller påvirker receptoren direkte [2] . Selvom effektiv, androgen ablation styrer metastatisk prostatacancer for kun et par år, og næsten alle patienter udvikler progressiv hormon-refraktær prostatakræft (HRPC). Androgen afsavn terapi er ikke helbredende for disse patienter, selv når parret med mere effektive behandlingsformer, der er målrettet den centrale syntese af testosteron, såsom CYP17A1 inhibitor abirateron og AR antagonisten MDV3100 [3], [4]. Identifikation af et nyt mål, der styrer AR signalering indirekte eller endda et mål, der ikke er relateret til AR-signalering, kan være nyttige for at udvikle nye terapeutiske tilgange til HRPC.

allestedsnærværende udtrykt cyclin G-associeret kinase (GAK) regulerer clathrin-medieret membran menneskehandel ved at fungere som en væsentlig cofaktor for Hsc70-afhængig uncoating af clathrin-coatede vesikler i cytoplasmaet [5], [6]. GAK er også lokaliseret til cellekernen [7], hvor det virker som en transkriptions-coaktivator for Ars. Især er GAK ekspression steget betydeligt i HRPC celler [8]. Desuden GAK spiller en rolle i opretholdelsen af ​​korrekt centrosom modning og mitotisk kromosom kongression, og siRNA-medieret knockdown af GAK aktiverer spindlen-samling checkpoint, som registrerer fremspringende, dårligt tilpassede eller unormalt kondenserede kromosomer, hvilket fører til standsning af cellecyklus ved metafase [9]. GAK er essentielle for cellevækst, da GAK knockout (GAK

– /-) mus er embryonale letale [10] og muse embryonale fibroblast (MEF) afledt af GAK

– /- mus ikke dele sig og i sidste ende blive senescent [ ,,,0],11] på grund af afbrydelse af clathrin endocytose. Men tidligere viste vi, at knockout mus, der udtrykker kinasen-døde form af GAK (GAK-kd) var ikke embryonale letale og GAK-kd MEF’er voksede normalt [12], hvilket antyder, at tab af GAK kinaseaktivitet kan ikke være dødelig i normale celler der udtrykker den korrekte mængde GAK. Dette tyder på, at en inhibitor af GAK kinaseaktivitet kunne anvendes til at udvikle en hidtil ukendt molekylær-target terapi, der selektivt inhiberer væksten af ​​HRPC celler med forøget GAK ekspression ved styring AR signalering indirekte.

Gefitinib [13], en tyrosinkinaseinhibitoren selektiv for den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR), hæmmer også kinaseaktiviteten af ​​GAK [14]. Selvom EGFR [15] og GAK [8] udtrykkes i høje niveauer i prostatakræft og deres forbedrede ekspression er associeret med dårlig prognose [8], [15], administration af gefitinib alene er ineffektiv [16] og kombinerede indgivelser af gefitinib og strålebehandling [17] eller docetaxel [18] har begrænsede terapeutiske virkninger. Luteolin, en fælles kosten flavonoid fundet i en lang række planter og fødevarer [19], er en anden antagonist af EGFR-associeret tyrosin proteinkinaser. Svarende til gefitinib, luteolin forårsager vækst anholdelse af PC-3 humane prostata kræftceller via regulering af cellecyklus regulerende gener [20]. Luteolin hæmmer også DNA topoisomeraser, de kliniske mål for lægemidler mod cancer [21]. Derfor kan luteolin være anvendelige som et anticancerlægemiddel, selv om dens

bona fide

target (s) og de molekylære mekanismer, der er involveret i inhibering af cancercelleproliferation forbliver undvigende grund af dets brede spektrum af farmakologiske egenskaber.

Formålet med denne undersøgelse var at identificere en ny faktor, der styrer AR signalering indirekte i HRPC patienter, og undersøge, om GAK kunne målrettes til behandling af ikke blot HRPC men også andre kræftformer med forbedret GAK udtryk. Faktisk vi her anføre, at en stigning i ekspressionen af ​​GAK i HRPC patienter positivt korrelerer med Gleason score, et mål for sygdommens sværhedsgrad. Både GAK og AR lokaliseret mod kernerne i kræftceller i GAK-positive kirurgiske prøver. En

in vitro

kinaseassay afslørede, at luteolin og gefitinib inhiberer kinaseaktiviteten af ​​GAK med lignende styrke, hvilket antyder deres anvendelighed som inhibitorer af GAK kinaseaktivitet. Sammenlignet med virkningerne af hvert lægemiddel for sig, samtidig administration af luteolin og gefitinib til PC-3 celler havde større hæmmende effekt på cellelevedygtighed. Disse forbindelser havde også en kumulativ inhiberende virkning på GAK-proteinekspression, der var uafhængig af proteasom-medieret nedbrydning. Tilsammen resultaterne præsenteret her antyder, at GAK, der er overudtrykt i mange cancerceller, er en ny kandidat til lovende målrettet kemoterapi.

Materialer og Metoder

Antistoffer og siRNAs

Antistoffer mod følgende proteiner blev anvendt i denne undersøgelse: AR (Santa Cruz Biotechnology), aktive caspase 3 (Cell Signaling Technology), Ki67 (DakoCytomation), Lefty (Abcam), lamin A /C (Bethyl Laboratories), EGFR ( kanin, Cell Signaling Technology), EGFR (mus, Millipore), ERK1 /2 (Cell Signaling Technology), pERK (Cell Signaling Technology), GAPDH (Fitzgerald), og α-tubulin (Sigma-Aldrich). De anti-GAK monoklonale antistoffer blev fremstillet som tidligere beskrevet [7]. De Lefty1-specifikke siRNA’er blev købt fra OriGene Technologies og Gene Design

Kemikalier og kosttilskud

Følgende kemikalier og kosttilskud blev anvendt i denne undersøgelse:. Gefitinib (Tocris Bioscience), erlotinib ( Kemprotec), SB203580 (LC Laboratories), LutiMax (CalComp Nutrition), Oryza luteolin (Oryza Oil Fat Chemical), luteolin (Sigma-Aldrich), resveratrol (Sigma-Aldrich), og DMSO (Sigma-Aldrich)

Cell kultur

PC-3 celler blev leveret af den japanske Cancer Research Resources Bank. Alle andre humane cancerceller blev indkøbt fra American Type Culture Collection. Cellerne blev holdt i 5% CO

2 ved 37 ° C i Dulbeccos modificerede Eagles medium tilsat 10% føtalt bovint serum (FBS, Hyclone Laboratories), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. WT (GAK-kd

+ /+) og GAK-kd

– /- MEF’er blev holdt i MEF medium (Dulbeccos modificerede Eagles medium suppleret med 10% FBS, penicillin, streptomycin og 50 mM 2-mercaptoethanol) som tidligere beskrevet [22].

EGF stimulering

efter to vaske i phosphatbufret saltvand (PBS), MEF’er blev dyrket i lav-serum MEF medium (indeholdende 0,5% FBS) i 12 h. Muse EGF (Sigma) blev sat til dyrkningsmediet ved en slutkoncentration på 10 ng /ml (til western blot-analyse) eller 100 ng /ml (for immunfluorescens), og cellerne blev derefter inkuberet i 5% CO

2 ved 37 ° C i de angivne tidsrum.

FACS-analyse

Celler blev farvet under anvendelse af Cycletest Plus DNA Reagent Kit (BD Bioscience), ifølge producentens instruktioner. Analyse blev udført under anvendelse af et FACS Calibur-instrument med CellQuest software (BD Bioscience).

Vækstkurve analyse

Ca. 1,0 x 10

3 PC-3-celler blev podet i et 3,5 cm Petri skål og inkuberet ved 37 ° C natten over. Gefitinib, luteolin, og resveratrol blev derefter opløst i DMSO og tilsat til dyrkningsmediet på tidspunktet nul.

Måling

Cellelevedygtighed under anvendelse MIR-630

Ekspression af MIR-630 fra miRNASelect pEP- HSA-mir-630-ekspressionsvektor blev udført ifølge producentens instruktioner (Cell Biolabs). For at bestemme levedygtighed blev cellerne udpladet i 6-brønds plader ved en densitet på 1 x 10

5 celler per brønd og derefter trypsiniseret i de angivne tidspunkter. Antallet af prolifererende celler blev bestemt ved hjælp af en grevinde Automated Cell Counter (Invitrogen).

Histologisk analyse

Kirurgiske prøver fra patienter, der gennemgår radikal prostatektomi blev fikseret i 10% bufferet formalin, indlejret i paraffin, og derefter skåret i 4 um tykke serielle sektioner. De første sektioner blev farvet med hematoxylin og eosin og anvendes til patologisk diagnose af den betændte område. De resterende tre sektioner blev underkastet immunohistokemiske analyser, som tidligere [23] beskrevne. Kort beskrevet blev deparaffinerede sektioner autoklaveret i 0,1 M citratpuffer, blokeret med bovint serumalbumin og derefter inkuberet med primære antistoffer i PBS indeholdende 2% bovint serumalbumin. Sekundære antistofinkubationer og signal enhancement reaktioner blev udført under anvendelse af Histofine Simple Stain Kit (Nichirei) og farve blev udviklet under anvendelse aminoethlcarbazole (Impact AEC; Vector Laboratories). Sektionerne blev modfarvet med hæmatoxylin for nuklear visualisering og derefter monteres ved hjælp Ultramount Vandig Permanent Mounting Medium (Dako). Billederne blev optaget med et mikroskop (BX51, Olympus) udstyret med en CCD-kamera (DP72, Olympus).

Western blot-analyse

For at forberede helcellelysater blev cellerne lyseret ved 4 ° C i 30 min i modificeret RIPA-buffer (10 mM Tris-HCI pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM dithiothreitol, 0,1% SDS og 0,1% deoxycholat) suppleret med 1% protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich), 1 mM NaF, 1 mM Na

3VO

4, og 10 mM β-glycerophosphat. Efter centrifugering blev klarede lysater udsat for SDS-PAGE. De opløste proteiner blev overført til PVDF-membraner, som blev blokeret og derefter immunoblottedes med de angivne antistoffer i Tris-bufret saltvand og Tween 20 indeholdende 5% fedtfri mælk. De immunreaktive proteinbånd blev visualiseret under anvendelse Western Lightning Plus ECL reagenser (PerkinElmer).

Oprensning af rekombinante proteiner Salg

Oprensning af GST-mærkede proteiner til kinase assays blev udført som tidligere [22] beskrevne. Kort fortalt

E. coli

BL21 celler transformeret med pGEX-plasmidet blev inkuberet i Luria-Bertani-bouillon ved 37 ° C, indtil de nåede en absorbans på 0,4-0,8 ved 600 nm. Ekspression af hvert rekombinant protein blev induceret ved eksponering natten af ​​cellerne til 0,5 mM IPTG ved 20 ° C. Cellerne blev derefter opsamlet og lyseret ved sonikering i PBS indeholdende 1% Triton X-100, 1 ug /ml leupeptin, 1 ug /ml aprotinin, 1 ug /ml pepstatin A, 1 mM benzamidin, 100 ug /ml phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mM NaF og 1 mM Na

3VO

4. Efter centrifugering blev klarede lysat adsorberet til glutathion Sepharose 4B (Amersham Pharmacia Biotech), skyllet med PBS, og derefter elueret med en puffer indeholdende 10 mM reduceret glutathion (Nacalai Tesque).

In vitro

kinaseassay af GAK

In vitro

kinase assays blev udført under anvendelse af GST-mærket humant AR (-150 pg /ml) som prøven og oprenset GST-mærket humant GAK (~ 100 ug /ml) som test kinase. Et oprenset fragment af B’γ3 undertype af muse PP2A (B’γ; -10 ug /ml) blev anvendt som en positiv kontrol GAK substrat, som tidligere [22] beskrevne. Aurora A kinase (~ 50 ug /ml) og Lats1 /2-kinase (-25 ug /ml; i nærvær eller fravær af Mob1A (~ 50 ug /ml) som sin aktivator) blev anvendt som positiv kontrol enzymer, og en kinase -dead (KD) form af Aurora a kinase (~ 50 ug /ml) blev anvendt som en negativ kontrol for phosphorylering af AR. De kinaser og substratproteiner blev inkuberet i 30 minutter ved 30 ° C i 10 pi reaktionsbuffer (10 mM HEPES pH 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, 5 mM MnC

2, 1 mM DTT, 5 mM NaF, og 50 mM β-glycerophosphat) indeholdende 5 pM ATP og 10 uCi [γ-

32P] ATP (PerkinElmer). Når det kræves, gefitinib, erlotinib, SB203580, resveratrol, og luteolin blev medtaget ved de angivne koncentrationer. Reaktionen blev standset ved tilsætning af 4 x Laemmli-buffer (0,4 M Tris-CI pH 6,8, 8% SDS, 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol og 0,2% bromphenolblåt). Prøverne blev opløst ved gradient SDS-PAGE under anvendelse af en Multigel II Mini-apparat (Daiichi Pure Chemicals) og blev detekteret ved autoradiografi. Mængderne af proteiner indlæst på gelen blev overvåget ved farvning med Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad) eller SimplyBlue ™ SafeStain (Life Technologies).

Menneskelig genom microarray analyse

Microarray analyser blev udført som ensfarvede hybridiseringer bruger Agilent Whole human Genome Oligonucleotid Microarrays (4 × 44K; Produktkode: 4112F). Totalt RNA blev ekstraheret fra PC-3-celler 24 timer efter behandling med DMSO, 60 uM luteolin, 60 pM gefitinib, eller 60 uM luteolin plus 60 pM gefitinib anvendelse af et miRNeasy Mini kit ifølge producentens instruktioner (Qiagen). Kvaliteten af ​​RNA blev bestemt ved anvendelse af RNA 6000 Nano LabChip Kit på Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). RNA’et blev revers-transkriberet under anvendelse AffinityScript revers transkriptase (Agilent Technologies) og oligo-dT primere indeholdende T7 RNA-polymerase promotorsekvens.

In vitro

transkription blev derefter udført under anvendelse af T7 RNA-polymerase og en lav input Quick-Amp Labeling Kit (Agilent Technologies) for at mærke de cRNA’er med Cy3-CTP (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Oprensede Cy3-mærkede cRNA’er (1650 ng) blev hybridiseret til mikroarrayene. Vask, scanning og gen-analyser blev udført ifølge producentens protokol (Agilent Technologies). Agilent Feature Extraction software (v. 10.5.1) blev anvendt til at vurdere spot kvalitet og udtrække statistikker har intensitet. Den Subio Platform og Subio Basic Plug-in (v1.15, Subio Inc.) blev derefter anvendt til at beregne mellem-prøve fold-ændringer, som blev analyseret af en prøve Students

t

-tests. De microarray data er blevet deponeret i Gene Expression Omnibus database (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) under tiltrædelsen nummer GSE53180.

Menneskelig miRNA microarray analyse

miRNA microarray analyse blev udført ved hjælp af Agilent SurePrint Menneskelig v18.0 miRNA arrays, som indeholder 20-40 funktioner rettet mod 1919 menneskelige miRNA katalogiseret i version 8.0 af Sanger-databasen (design ID 025.416). Portioner af total RNA (100 ng) blev anvendt til fremstilling miRNA prober ifølge Agilent protokollen (v. 2.4). Kort beskrevet blev totalt RNA dephosphoryleret med kalvetarm alkalisk phosphatase, denatureret med DMSO og derefter mærket med Cyanin 3-pCp anvendelse af T4-RNA-ligase og miRNA Labeling Kit. Proberne blev hybridiseret til de arrays i 20 timer ved 55 ° C med rotation ved hjælp af Agilent miRNA Hybridisering Kit. Dobbelte mikroarrays blev udført for PC-3 celler behandlet med DMSO, luteolin, gefitinib eller luteolin og gefitinib. Objektglassene blev vasket med Gene Expression Wash Buffer 1 (Agilent) ved stuetemperatur i 5 minutter og derefter med Gene Expression Wash Buffer 2 (Agilent) ved 37 ° C i yderligere 5 min. Efter hybridisering og vask blev objektglassene scannet under anvendelse af en Agilent scanner (G2505C). Billeder blev udvundet ved hjælp af Agilent Feature Extraction software (v. 10.7.3) og Agilent GeneSpring GX software (v. 12.6). Den samlede gen-signalet fra GeneView datafiler (ekstraheret med standardindstillingerne i Agilent Feature Extraction software) blev anvendt. Forskelle i miRNA ekspressionsniveauer blev normaliseret ved hjælp af PC-3 behandlet DMSO prøve som en kontrol. aFold-ændringer større end 2,0 og

P

-værdier mindre end 0,05 (Students

t

-test) blev anset for yderligere analyse. MiRNA microarray data er blevet deponeret i Gene Expression Omnibus database under accessionsnummer GSE53178.

Kvantitativ realtids-PCR

Kvantitativ RT-PCR-analyser blev udført ved anvendelse af et ABI PRISM 7900 instrument (PE Applied Biosystems) og Assay-on-Demand TaqMan prober til Lefty1 (Hs00764128_s1), miR-630 (HSA-mir-630), og miR-5703 (HSA-mir-5703), i henhold til producentens protokoller (Agilent Technologies).

Statistisk analyse

Fejl barer for alle data repræsenterer SDS fra middelværdien.

P

-værdier blev beregnet ved hjælp af Students

t

-tests, medmindre andet er angivet.

Etik

Humane prøver blev indsamlet ved biopsi fra prostata af kræftpatienter med relevante kliniske data på Kinki University Hospital. Alle eksperimenter med humane prøver blev godkendt af den etiske komité i Osaka University (Godkendelse # 326) og Kinki University (Godkendelse # 23-088); vores etiske udvalg frafaldes behovet for samtykke. Kirurgiske prøver fra patienter, der gennemgår radikal prostatektomi ved Kinki University Hospital (Osaka, Japan) blev fikseret i 10% bufferet formalin, indlejret i paraffin, og derefter skåret i 4 um tykke serielle snit.

Resultater

GAK er lokaliseret hovedsageligt til cellekernen i cancerceller

Selvom GAK lokaliseres hovedsageligt til cytoplasmaet i normale celler, såsom TIG-1 har vi for nylig rapporteret, at en fraktion af proteinet også findes i kernen [7 ]. Især en tidligere undersøgelse under anvendelse af en neo-adjuvant hormonbehandling væv microarray viste, at GAK ekspression øger betydeligt i progressionen af ​​prostatacancer til androgenuafhængighed [8]. For at bestemme om GAK ekspression forøges i kerner af cancerceller, blev immunoblots anvendes til måling GAK proteinniveauer i cytoplasmatiske og nukleare fraktioner af forskellige cancercellelinier. I hormon-ufølsomme humane prostata kræftceller (PC-3), blev GAK udtrykt på et højere niveau i kernen end i cytoplasmaet; Dette resultat blev bekræftet under anvendelse af to forskellige monoklonale antistoffer (bane 3 og 4 i fig. 1). Selvom mængden af ​​GAK var lav, kernerne i hormon-følsomme humane prostatacancerceller (LNCaP) udtrykte ligeledes GAK (bane 6 i fig. 1). Desuden nukleare GAK band migrerede hurtigere end det cytoplasmatiske GAK band, hvilket tyder distinkte modifikationer af proteinet i disse cellulære rum. Lignende resultater blev også observeret for MDA-MB231 og MCF-7 brystcancerceller, samt HeLaS3 cervicale cancerceller (fig. 1). Derimod GAK var til stede ved højere niveauer i den cytoplasmatiske fraktion end den nukleare fraktion af TIG-1 normale fibroblaster (fig. 1). Navnlig hormon-ufølsomme cancerceller (PC-3 og MDA-MB231) udtrykte GAK i højere niveauer end hormon-følsomme cancerceller (LNCaP og MCF-7). Taget sammen indikerer disse resultater, at GAK der ændres, og overudtrykt i cancerceller, især metastatiske celler.

Western blot-analyse af GAK, lamin A /C, og α-tubulin (kontrol) i cytoplasmatisk (Cyt) og nuklear (Nuc) ekstrakter fra prostatacancer (PC-3 og LNCaP), brystcancer (MDA-MB231 og MCF-7) og livmoderhalskræft (HeLaS3) cellelinier. Lamin A /C blev anvendt som et nukleart markør. To forskellige anti-GAK antistoffer blev anvendt. Pilene og pilespidser angiver GAK bands identificeret primært i nukleare og cytoplasmatiske fraktioner henholdsvis.

Nuclear GAK udtrykkes ved høje niveauer i kirurgiske prøver fra prostata cancer patienter

For at bestemme hvis nukleare overekspression af GAK opstår

in vivo

, immunhistokemisk analyser af normale og kræft kirurgiske prøver fra 42 prostata cancer patienter blev udført. Selv GAK kun blev udtrykt svagt i de normale væv, blev proteinet udtrykkes ved høje niveauer i kernerne i kræftceller (Fig. 2A-E). En chi-square test afslørede en statistisk signifikant positiv korrelation mellem GAK immunfarvning og Gleason score (tabel 1 og tabel S1).

A-D, hematoxylin og eosin (HE) farvning (A, B) og anti -GAK immunfarvning (C, D) af repræsentative radikal prostatektomi sektioner af kræft (A, C) og normal (B, D) væv fra prostatacancerpatienter (n = 42). Scale bar = 50 um. E, højere forstørrelse af det indrammede areal er vist i C. Scale bar = 50 um.

Over-aktivering af AR signalering er forbundet med progression af androgenafhængige prostata-cancere. Fordi GAK ​​interagerer med AR

in vitro

[8], blev immunfarvning anvendt til at bestemme, om GAK også colocalizes med AR

in vivo

. Kernelokalisering af GAK og AR blev detekteret i kernerne i cancerceller fra alle GAK-positive kirurgiske prøver (n = 4 patienter med en Gleason score ≤7 og n = 5 patienter med en Gleason score ≥8) (fig. S1) . Men på trods af deres nukleare lokalisering, direkte fosforylering af AR af GAK blev ikke opdaget af en

in vitro

kinase assay (fig. S1E). Desuden er der i tre uafhængige patientprøver, GAK og AR ikke colocalize med Ki-67, en cancer antigen, som primært findes i voksende celler og er fraværende i hvilende celler (Fig. S2). Dette fund tyder på, at co-lokalisering af GAK og AR ikke nødvendigvis korrelerer med væksten af ​​kræftceller.

Cytoplasmatisk GAK regulerer EGFR-medieret signalveje

nedregulering af GAK reducerer tyrosinkinasen aktivitet af EGFR og ændrer dens downstream signalveje [5]. At afgøre, om denne regel er medieret af Ser /Thr-kinase aktivitet af GAK, vi undersøgte adfærd EGFR i GAK-kd MEF’er [12]. En immunoblotanalyse af vildtype (WT) og GAK-kd-MEF’er afslørede tilstedeværelsen af ​​to EGFR proteiner i begge prøver, det største af som var fremherskende i GAK-kd-MEF’er (fig. 3A). Den større bånd forsvandt efter behandling af cellerne med λ-phosphatase (fig. 3B, bane 2), hvilket antyder, at det udgjorde en phosphoryleret form af EGFR. Tyr-phosphatase inhibitor Na

3VO

4, men ikke den Ser /Thr phosphataseinhibitorer NaF, β-glycerophosphat, og okadainsyre, afskaffede denne virkning af λ-phosphatase, hvilket antyder, at Tyr rester i EGFR er konstitutivt phosphoryleret i GAK-kd MEF i fravær af EGF stimulus (fig. 3B). Tilsvarende, når de MEF’er blev serum sultet i 11 timer, behandlet med cycloheximid i 1 time for at inhibere ny proteinsyntese, og derefter stimuleret ved tilsætning af EGF, phosphorylering af EGFR var mere fremtrædende i GAK-kd MEF’er end WT MEF’er (Fig . 3C og 3D). Især blev en endnu større EGFR protein påvist i både WT og GAK-kd MEF’er 10 min efter EGF-stimulering (fig. 3C og 3D), hvilket antyder, at EGF øgede antallet af phosphorylerede Tyr rester i EGFR. Denne hyper-phosphorylering fremskyndet dephosphorylering af phosphorylerede ekstracellulære signal-regulerede kinaser 1/2 (pErk1 /2) (fig. 3C), som er nedstrømseffektorer af EGFR, hvilket antyder for tidlig forringelse af EGFR-signalering.

A , Western blot-analyse af EGFR i WT (GAK-kd

+ /+) og mutant (GAK-kd

– /-) MEF’er. B, virkningerne af en Tyr-phosphatase inhibitor (50 mM Na

3VO

4) og Ser /Thr phosphataseinhibitorer (50 mM NaF og 50 mM β-glycerophosphat, eller 2,5 uM okadainsyre) på inhibering af EGFR phosphorylering af λ-phosphatase (λPPase; 200 U). A, B, pilene angiver den phosphorylerede EGFR-proteinet. Alpha-tubulin (α-Tub) blev anvendt som en loading kontrol. (C, D) Western blot-analyse af ekspressionsniveauer af EGFR og ERK1 /2 i WT (+ /+) og GAK-kd (- /-) MEF’er efter EGF-stimulering i de angivne tidsrum. Cycloheximid (50 ug /ml) tilsat til dyrkningsmediet 1 time før EGF (10 ug /ml) til at inhibere ny proteinsyntese. Den vippede og vandrette pile angiver de phosphorylerede og hyper-phosphoryleret EGFR bands, hhv. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. C, de pilespidser angiver differentiel ekspression af phosphoryleret ERK1 /2 i WT og GAK-kd MEF’er. D, NT, ikke-behandlede. E, immunfarvning af EGFR-proteinet i WT (+ /+) og mutant (- /-) MEF’er behandlet med eller uden proteasominhibitor MG132 (50 ug /ml). Bemærkelsesværdige paneler er omkranset af turkis og grønne striber. F er antallet af EGFR-positive celler i WT og GAK-kd (Homo) celler i nærvær eller fravær af MG132. Dataene er vist som middelværdien ± SEM af n = 3 uafhængige forsøg på hvert tidspunkt.

Immunfarvning viste, at niveauerne af EGFR i cytoplasmaet i GAK-kd-MEF’er var lavere end i cytoplasma WT MEF’er, hvilket tyder unormal internalisering af det EGFR i knockout-celler (kolonne 2 paneler af fig. 3E). Lignende resultater blev opnået, når eksperimentet blev gentaget i nærvær af proteasominhibitor MG132, hvilket antyder, at abnormitet ikke skyldtes nedbrydningen af ​​EGFR-proteiner (kolonne 4 paneler af fig. 3E). Desuden er antallet af EGFR-positive celler var lavere i GAK-kd-MEF’er end WT MEF’er, og dette fænotype var også uafhængig af proteasomhæmning (fig. 3F). Disse resultater antyder, at konstitutiv hyper-phosphorylering af EGFR forårsaget af en mangel på GAK aktivitet hæmmer korrekt lokalisering af receptoren, hvilket fører til reduceret aktivering af EGFR-medieret vækst signalering. De ovenfor beskrevne resultater er i overensstemmelse med en nylig rapport, at MEF’er fra GAK betinget knockout mus og GAK knockdown celler fremstillet ved hjælp af små hårnål RNA vise ændret intracellulær EGFR menneskehandel, undergår vækst anholdelse, og har reduceret pErk1 /2 signalering [11]. Tilsammen tyder disse data, at en mangel på GAK aktivitet forstyrrer korrekt aktivering af EGFR-medieret signalveje.

Luteolin og gefitinib hæmmer kinase aktivitet af GAK

Gefitinib hæmmer GAK, EGFR, og receptor-interagerende serin /threonin-kinase

in vitro

[14]. For at bestemme om gefitinib inhiberer GAK aktivitet direkte, en

in vitro

kinaseassay blev udført under anvendelse PP2A B’γ, en kendt mål på GAK, som substrat [22]. Gefitinib inhiberede GAK autophosphorylering og GAK-medieret phosphorylering af PP2A B’γ på en dosis-afhængig måde, hvilket antyder, at gefitinib inhiberer GAK kinaseaktivitet direkte (fig. 4A). Virkningerne af andre kinaseinhibitorer, såsom den velkendte EGFR-inhibitor erlotinib [24] og p38a og GAK inhibitor SB203580 [25], på GAK-aktivitet blev også undersøgt. Begge disse forbindelser inhiberede GAK aktivitet på samme måde, selv om de var lidt mindre kraftigt virkende end gefitinib (fig. 4A).

In vitro

kinase assays blev også anvendt til at bestemme virkningerne af luteolin (et flavonoid) og resveratrol (a polyphenol) på GAK aktivitet; disse forbindelser inhiberer væksten af ​​prostatakræft-cellelinier [20], [26]. Især 10 uM luteolin inhiberede GAK aktivitet drastisk, mens den samme koncentration af resveratrol kun en let inhibitorisk virkning (fig. 4B). En yderligere analyse viste, at 2 uM luteolin var påkrævet for at inhibere GAK-aktivitet (fig. 4C). Disse resultater viser, at der ud over gefitinib, luteolin og erlotinib er hidtil ukendte inhibitorer af GAK.

A-C, der er repræsentativt SDS-PAGE-analyse af proteiner underkastes

in vitro Salg kinase assays under anvendelse af

32P-γATP, GAK (-100 pg /ml) som enzymet, PP2A B’γ (~ 10 ug /ml) som substrat, og de angivne koncentrationer af gefitinib, erlotinib, og SB203580 som inhibitorer. Signalerne inkorporerede blev detekteret ved autoradiografi og mængderne af proteiner læsset blev vurderet ved Coomassie Brilliant Blue (CBB) farvning. Graferne viser intensiteten forhold mellem phosphoryleret PP2A B’γ og GAK i forhold til den for ikke-behandlede prøver. Dataene er repræsenteret som middelværdien ± SEM af n = 3 uafhængige forsøg ved hver koncentration.

Samtidig administration af gefitinib og luteolin forårsager dødsfald af PC-3 celler

Dernæst vi undersøgte effekten af ​​samtidig administration af gefitinib og luteolin på væksten af ​​PC-3 prostatacancerceller. Vi bruges første genomisk DNA-sekvensering for at undersøge for tilstedeværelsen af ​​mutationer i EGFR-genet i PC-3-celler, som blev rapporteret tidligere for at huses hyppigt af lungecancerceller [27]. Som vist i fig. S3, fandt vi ingen mutationer i sådanne steder i genomet af PC-3, hvilket antyder, at en lav koncentration af gefitinib (-1 uM) ikke kan være effektiv i PC-3-celler. Faktisk blev en højere koncentration af gefitinib (60 uM), der kræves til at standse væksten af ​​PC-3-celler. Interessant, når antallet af prolifererende celler blev talt efter udsættelse af cellerne til 60 uM luteolin, 60 pM gefitinib, eller en kombination af disse lægemidler i 24, 48 eller 72 timer, fandt vi en kumulativ inhiberende virkning af gefitinib og luteolin på cellevækst (fig. 5A). Kontrolceller blev behandlet med dimethylsulfoxid (DMSO) alene.