PLoS ONE: Androgen receptor Fremmer ligand-uafhængig prostatakræft Progression gennem c-myc Upregulation

Abstrakt

androgen receptor (AR) er den vigtigste terapeutiske mål i prostatakræft. I de sidste 70 år, har androgen deprivation terapi (ADT) været den store terapeutiske fokus. Men nogle patienter ikke gavn, og de tumorer, der i første omgang reagerer på ADT sidst fremskridt. En nylig beskrevne mekanisme af en sådan virkning er vækst og overlevelse-fremmende virkninger af AR, der udøves uafhængigt af AR-ligander, testosteron og dihydrotestosteron. Imidlertid blev specifikke ligand-uafhængig AR target gener, der tegner sig for denne effekt ikke godt karakteriseret. Vi viser her, at

c-myc,

som er en vigtig mediator af ligand-uafhængig vækst prostatakræft, er et centralt ligand-uafhængig AR målgen. Ved hjælp af microarray analyse, fandt vi, at

c-myc

AR ekspressionsniveauerne stærkt korreleret med hinanden i tumorer fra patienter med kastrationsresistent prostatacancer (CRPC) skrider trods ADT. Vi bekræftede, at AR direkte regulerer

c-Myc

transkription i en ligand-uafhængig måde, at

AR

og

c-Myc

suppression reducerer ligand-uafhængig vækst prostatacancercelle , og at ektopisk ekspression af c-Myc dæmper anti-vækst virkninger af AR suppression. Vigtigere, behandling med bromodomain inhibitoren JQ1 undertrykt c-Myc funktion og undertrykt ligand-uafhængig prostatacancer celleoverlevelse. . Vores resultater definerer en ny forbindelse mellem to kritiske proteiner i prostatakræft – AR og c-myc – og demonstrere potentialet i AR og c-myc-rettet terapier for at forbedre prostatakræft kontrol

Henvisning: Gao L, Schwartzman J, Gibbs A, Lisac R, Kleinschmidt R, Wilmot B, et al. (2013) Androgen receptor Fremmer ligand-uafhængig prostatakræft Progression gennem c-myc Opregulering. PLoS ONE 8 (5): e63563. doi: 10,1371 /journal.pone.0063563

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA

Modtaget: 30 oktober, 2012; Accepteret: April 2, 2013; Udgivet: 21. maj 2013 |

Copyright: © 2013 Gao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne publikation blev muliggjort med støtte fra Oregon Klinisk og Translational Research Institute, tildele nummer KL2 RR024141 fra National center for Research Resources og National center for Fremme Translationelle Sciences i National Institutes of Health (ja). Dette arbejde blev også støttet af Pacific Northwest prostatakræft SPORE /National Cancer Institute (P50CA097186) (JA, PN, IC), Department of Defense (PC093509) (PSN), en stewardesse Medical Research Institute Young Klinisk Scientist Award (JA ), en Wayne D. Kuni Joan E. Kuni Foundation Kuni Scholar Award (JA), og en prostatakræft Foundation Young Investigator Award (JA). Med særlig tak til Platt Electric, Bruce Burns, og The Burns Family Fund af Oregon Community Foundation for deres filantropiske støtte for dette arbejde. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den mest almindelige kræftform hos mænd i USA med 241,740 nye tilfælde forventet, i år [1]. Trods screening og tidlig behandling, prostatakræft almindeligt opstår igen, er og 28,170 mænd forventes at dø af prostatakræft i år [1]. Næsten alle disse prostata kræftdødsfald kan henføres til metastatisk, kastrationsresistent prostatacancer (CRPC), der har udviklet sig på trods af androgen deprivation terapi (ADT) -. Den mest almindelige behandling for patienter med tilbagevendende eller fremskreden prostatacancer

ADT virker ved at sænke niveauer af potente AR ligander testosteron og dihydrotestosteron (DHT) eller forstyrre binding af androgen ligander til androgen receptor (AR) protein, den vigtigste terapeutisk mål i prostatacancer [2]. Trods ADT, herunder nye og mere potente behandlinger, alle prostatakræft efterhånden fremskridt [3], [4]. Ved progression er AR allestedsnærværende udtrykt [5], [6].

Der er flere mulige forklaringer på AR-afhængige mekanismer progression trods undertrykkelse eller forstyrrer androgen ligander. Disse omfatter intratumoral androgensyntese, genereringen af ​​konstitutivt aktive AR transcript varianter, AR genamplifikation, aktiverende AR mutationer eller aktivering af AR ved vækstfaktorer [7] – [16]. Det er nu også klart, at AR-protein kan fremme aktiveringen af ​​AR ligand-uafhængige pathways distinkte fra AR kanoniske ligand-aktiverede veje i CRPC [17]. Men kritiske nedstrøms AR målgener af denne type, der tegner sig for AR afhængige, ligand-uafhængig prostatacancer celleoverlevelse er ikke fuldt klarlagt. Studiet af sådanne AR target gener og mekanismer, som AR regulerer deres udtryk vil forbedre vores forståelse af kastration-modstand og føre til identifikation af centrale AR afhængige proteiner, hvis aktivitet kan styre væksten og overlevelsen af ​​CRPC celler. Sådanne mål og veje vil naturligt blive høj prioritet for lægemiddeludvikling.

For at forstå gener, der kan tegne sig for denne retning vi fokuseret på

c-myc

. Dette skyldes, at: 1)

c-myc

overekspression fremmer prostatakræft udvikling [18]; 2)

c-Myc

opreguleres i androgen ligand-afhængig prostatacancer og yderligere opreguleres i CRPC [19], [20]; og 3) tidligere rapporter har vist, at c-Myc, ligesom AR, bidrager til ligand-uafhængig prostatacancer cellevækst [21]. Vores gennemgang af tidligere data, som er lokaliseret AR bindingssteder hele genomet ved chromatin immunoprecipitation (chip) viste, at AR lokaliseres til et enhancerelement af

c-Myc

genet [17]. Men det var uklart, om

c-myc

var en direkte AR target-gen og om androgen ligander var nødvendige for AR regulering af

c-myc

udtryk.

Vi bestemmes at

c-myc

opregulering i humane CRPC tumorer korrelerer med

AR

opregulering, og vi bekræftede, at

c-myc

er en direkte AR målgen hjælp kromatin immunopræcipitation (chip ) assays.

c-myc

undertrykkelse opnår de samme overordnede virkninger som

AR

undertrykkelse, og

c-myc

overekspression dæmper anti-vækst virkninger af

AR

undertrykkelse. Mens AR fremmer

c-myc

udtryk, behandling med androgen ligander steg ikke

c-myc

udtryk. , AR fremmer således udtryk for

c-myc

i en ligand-uafhængig måde, og

c-myc

er en central AR målgen.

Endelig har vi behandlet prostatacancerceller med BET bromodomain inhibitor JQ1 der undertrykker c-myc udtryk [22], [23]. Behandling med JQ1 opnået den samme samlede effekt som

c-myc

RNAi og nedsat prostatakræft celle overlevelse i androgen ligand-udtømte betingelser.

Vores undersøgelser præcisere, at

c-myc

er en vigtig androgen ligand-uafhængig AR målgen, der bidrager til androgen ligand-uafhængig, men AR-afhængig prostatacancer celleoverlevelse. Vores resultater viser også potentialet i AR-rettet terapier eller c-myc-rettede terapier i prostatakræft som supplement til ADT.

Resultater

AR og

c-myc

er samstemmende Udtrykt i metastatisk CRPC

både AR og c-myc er kritiske overlevelse veje i prostatakræft, og ekspressionsniveauerne af både

AR

og

c-myc

er almindeligt forøget i humane CRPC tumorer forløber trods ADT [24], [25]. Men det var ikke, om overekspression af

AR

og

c-myc

var forbundet med de andre i humane CRPC tumorer. Derfor bestemte vi ekspressionsniveauerne af

AR

og

c-myc

bruge genekspression microarrays i 140 humane CRPC tumorer versus 15 normale prostata prøver. Dernæst undersøgte vi sammenslutning af

AR

opregulering og

c-myc

opregulering i de menneskelige CRPC tumorer.

AR

mRNA-niveauer i CRPC prøver blev stærkt forbundet med

c-myc

mRNA-niveauer (Pearson korrelation = 0,3698, 95% konfidensinterval: 0,2172 til 0,5048, to-halet p-værdi 0,0001 ) (figur 1A). Vi beregnede også odds ratio for

c-myc

AR

opregulering i disse CRPC prøver. Der var en statistisk signifikant sammenhæng med

AR

opregulering og

c-myc

opregulering (OR = 3,528, 95% konfidensinterval: 1,347-9,240, p-værdi: 0,0108 ved Fishers eksakte test) (figur 1B).

A) Z-score (til normale prostata prøver) af

AR

versus

c-myc

mRNA-ekspression i 140 humane CRPC metastaser. The Pearson korrelationskoefficienten, lineær regression, og F-test for signifikant forskellig fra nul hældning blev udført for hvert par af gener. B) Fishers eksakte test og odds ratio på kontingenstabel analysere samtidig forekomst af tumorer med

AR

eller

c-myc

z-scores større end 2.

AR Suppression Reducerer vækst af AR ligand-afhængige og AR ligand-uafhængig kastrationsresistent prostatacancerceller

Vi undertrykt udtryk for

AR

med RNAi i prostatacancerceller dyrket i trækul-strippet, androgen ligand-depleteret serum.

AR

RNAi reduceret cellevækst af både androgen ligand-afhængige LNCaP-celler og deres CRPC derivater kaldet LNCaP-abl (figur 2A). At bemærke, begge af disse celler kun udtrykke fuld-længde AR transkript.

AR

undertrykkelse med RNAi i 22RV1 CRPC cellelinie, der udtrykker både fuld længde AR og en AR udskrift variant opnået den samme effekt (figur 2A). I alle cellelinjer, AR suppression reduceret cellevækst uden at inducere apoptose (data ikke vist), hvilket tyder på en defekt i proliferation. På trods androgen ligand udtømning,

AR

undertrykkelse yderligere reducerer prostatakræft cellevækst.

A) LNCaP, abl og 22RV1 celler blev transficeret med 50 nM af ikke-målrettet kontrol (NTC), eller

AR

RNAi oligonukleotider. Celler blev skiftet til kul-strippet serum på dagen for transfektion. Cellevækst blev bestemt 5 dage senere for LNCaP og 6 dage senere for abl og CRPC 22RV1 med trypan udelukkelse metoden blå. B) Immunblot for AR ekspression. De nedre bånd i AR immunoblot i 22RV1 celler afspejle tilstedeværelsen af ​​en AR transkript variant [7]. B) LNCaP, abl og 22RV1 celler blev transficeret med 50 nM NTC eller

c-myc

RNAi oligonukleotider. Celler blev skiftet til kul-strippet serum på dagen for transfektion. Cellevækst blev bestemt 5 dage senere for LNCaP-celler og 6 dage senere for abl og 22RV1 med trypan ekskluderingsmetode blå. Immunblot for c-myc proteinekspression. C) LNCaP-celler med stabil overekspression af tom vektor (EV) eller c-myc blev dannet. Disse celler blev transficeret med 50 nM for ikke-målrettet kontrol (NTC) eller AR siRNA oligonukleotider. Cellevækst blev bestemt 6 dage senere med trypan ekskluderingsmetode blå. Immunblot for AR og c-myc proteinekspression. De højere bånd på c-Myc immunoblot i c-myc-overudtrykkende celler repræsenterer ektopisk-udtrykte c-Myc. * Betegner p. 0,05 sammenlignet med NTC

c-myc Suppression rekapitulerer Effekten af ​​AR Suppression, og c-myc Overekspression Dæmper Anti-tumor aktivitet af AR Suppression

Til bestemme, om c-Myc også påvirket prostatakræft cellevækst uafhængig af androgen ligander, vi undertrykt

c-Myc

hjælp RNAi. Ligesom

AR

nedregulering,

c-Myc

nedregulering undertrykt ligand-uafhængig vækst af LNCaP, abl, og 22RV1 celler (figur 2B). Endvidere har vi samtidig undertrykt

AR

og

c-myc

med RNAi. Co-undertrykkelse af begge proteiner ikke reducere cellevækst mere end undertrykkelse af enten

AR

eller

c-myc

af sig selv (figur S1).

Vi viste også, at

c-myc

overekspression tillagt ligand-uafhængig vækst til ligand-afhængige LNCaP celler opformeret langsigtet kastrationsniveauer betingelser, som er samstemmende med en forudgående rapport (figur S2) [21]. Dernæst vi undertrykt

AR

med RNAi i LNCaP celler, der overudtrykker tom vektor eller

c-myc

og kvantificeret cellevækst.

c-myc

overekspression var beskyttende mod vækst undertrykkende effekter af

AR

RNAi (figur 2C). Dette viser, at

c-myc

mindste delvist bidrager til AR virkninger på fremme ligand-uafhængig prostatacancer celle overlevelse.

AR men ikke Androgener Fremme c-myc Expression

c-Myc

onkogen er almindeligt opreguleret i prostatacancer, og

c-Myc

opregulering fremmer ligand-uafhængig prostatacancer celleoverlevelse [21]. Men afhængigheden af ​​

c-myc

udtryk på AR var ikke fastlagt. Derfor undersøgte vi tidligere offentliggjorte ChIP microarray data, lokaliseret AR hele genomet af androgen ligand-afhængige LNCaP-celler og deres Abl CRPC derivater [17]. AR blev rapporteret at være bundet til en forstærker element i

c-myc

gen i begge disse cellelinjer. Derfor vi næste brugte chip til at bekræfte disse resultater.

Først, vi voksede celler i kul-strippet, androgen ligand-udtømte serum og bestemmes effekten af ​​behandling med androgen ligand R1881 på AR belægning og histonacetylering, et tegn på aktiv transskription, i

c-myc

forstærker element ved hjælp chip. Vi målte også virkningerne af R1881 behandling på velbeskrevne, ligand-aktiverede gen

KLK3

. AR og høje niveauer af histonacetylering var til stede ved

c-Myc

enhancer selv når celler blev dyrket i ligand-udtømte serum (figur 3A). Endvidere har tilføjelsen af ​​R1881 til kultur ikke øge AR belægning eller histonacetylering på

c-myc

(figur 3A). Dette står i kontrast med den virkning, R1881 på

KLK3

gen enhancer- øget berigelse af AR og histonacetylering (figur 3A).

LNCaP, abl, og 22RV1 celler blev dyrket i kul-strippet serum i 72 timer og derefter behandlet med 10 nM R1881 (eller ethanol køretøj) i 4 timer. A) kromatin immunopræcipitation blev udført for at bestemme berigelsen af ​​AR og histon H3 acetylering (AcH3) på

c-myc

KLK3

enhancerelementer. B) QRT-PCR blev udført for at bestemme mRNA-niveauerne af

KLK3

c-Myc

forhold til actin. C) Immunblotting blev udført for at bestemme proteinniveauer af AR, c-Myc, og actin. * Betegner p 0,05 sammenlignet med køretøj

Vi næste bestemmes effekten af ​​R1881 behandling på ekspressionen af ​​

c-myc

eller

KLK3

.. R1881 behandling steget

KLK3

udtryk (figur 3B). Desværre fik R1881 behandling ikke øge

c-myc

udtryk. Figur 3B, C).

Dernæst behandlede vi prostatacancerceller med MDV3100, en potent, ny androgen antagonist [26]. MDV3100 behandling undertrykt udtryk for

KLK3

men påvirkede ikke udtryk for

c-myc

. (Fig S3). Disse resultater understøtter endvidere den opfattelse, at androgen ligander ikke fremmer udtryk for

c-myc

.

For at afgøre, om AR var i stand til at regulere

c-myc

i en ligand-uafhængig måde, vi brugte RNAi til at undertrykke ekspressionen af ​​

AR

og måles

c-myc

udtryk. RNAi-medieret suppression af

AR

reduceret c-myc mRNA og proteinekspression (figur 4A, B). Vi udførte chip assays og bekræftede, at

AR

RNAi reducerede AR og histonacetylering fra

c-myc

forstærker (figur 4C). Dette var mest markant i 22RV1 cellelinie, selvom stærke tendenser også blev set i LNCaP og Abl celler. ,

c-myc

er således en direkte AR målgen, og

AR

RNAi undertrykker

c-myc

udtryk i det mindste delvis gennem udtømning af AR og histonacetylering fra

c-myc

forstærker. Vi overudtrykt også AR i M12 prostatacancer-cellelinie, der ikke normalt udtrykker AR. AR overekspression forøget c-myc mRNA og proteinekspression (fig S4). Dette understøtter yderligere den opfattelse, at AR aktiverer

c-myc

udtryk i en ligand-uafhængig måde.

LNCaP, abl og 22RV1 celler blev transficeret med 50 nM af ikke-målrettet kontrol (NTC) eller Ar RNAi oligonukleotider. Celler blev derefter dyrket i kul-strippet serum i 96 timer. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev cellerne høstet at ekstrahere mRNA og protein. A) QRT-PCR blev udført for at bestemme niveauerne for

c-Myc

forhold til

actin

. B) Immunoblotting blev udført for at bestemme indholdet af AR, c-Myc og actin. C) Parallelle behandlinger blev udført, og cellerne blev tværbundet og behandlet til chip til at bestemme AR og histon H3 acetylering (AcH3) berigelse på

c-myc

forstærker. * Betegner p 0,05 sammenlignet med NTC

AR Suppression rekapitulerer Effekt af c-myc Suppression

Vi næste afgøres, om RNAi-medieret undertrykkelse af

AR

. opsummerede virkningen af ​​RNAi-medieret suppression af

c-Myc

på ekspression af velbeskrevne

c-myc

målgener (figur 5) [27], [28]. Begge

c-myc

RNAi og

AR RNAi

reduceret ekspression af

c-myc

-aktiverede gen

E2F1

; omvendt,

c-myc

AR

RNAi begge forøget ekspression af

c-myc

-repressed gen

CDKN1A

(figur 5). De seneste rapporter viser, at mitotiske gener, herunder

KIF11

,

AURKB

, og

TPX2

, er centrale c-myc målgener [29] – [31].

AR

RNAi opsummerede virkningen af ​​c

Myc

RNAi og også reduceret ekspression af disse gener (figur 5). Dette viser, at AR undertrykkelse forstyrrer c-myc funktion og udtryk for veletablerede c-myc målgener.

LNCaP og ABL celler blev transficeret med 50 nM af ikke-målrettet kontrol (NTC) og enten A)

AR

eller B)

c-myc

RNAi oligonukleotider. Celler blev skiftet til kul-strippet serum på dagen for transfektion og høstes 96 timer senere. QRT-PCR blev udført for at bestemme indholdet af de angivne

c-myc

målgener forhold til

actin

. * Betegner p 0,05 sammenlignet med NTC

Den BET Bromodomain Inhibitor JQ1 Undertrykker c-myc Funktion og Reducerer AR ligand-uafhængig prostatakræft Cell Survival

Vores resultater viser, at

c-myc

er en vigtig AR målgen men at

c-myc

‘s udtryk er ikke aktiveret af androgene ligander. I øjeblikket terapier at undertrykke AR udtryk er endnu ikke tilgængelige. seneste arbejde viser imidlertid, at en BET bromodomain hæmmer kaldet JQ1 undertrykker c-myc-ekspression og c-myc funktion, fordi

c-myc

er en bromodomain target gen [22], [23]. Derfor behandlede vi prostatacancerceller med JQ1. JQ1 behandling reducerede mRNA og protein niveauer af c-Myc (figur 6A, B) og undertrykt c-Myc funktion som målt ved c-myc målgenekspression (figur 6B). Endelig såsom

c-Myc

RNAi, JQ1 behandling med nanomolære koncentrationer reduceret ligand-uafhængig prostatacancer celleoverlevelse (figur 6C).

LNCaP, abl, og 22RV1 celler blev dyrket i charcoal- strippet serum og behandlet med vehikel, 50 nM, 250 nM eller 500 nM JQ1 hver 24. time i 72 timer. A) Immunoblotting blev udført for at bestemme proteinniveauer af c-Myc. B) QRT-PCR blev udført for at bestemme mRNA-niveauet af

c-Myc

og c-Myc målretter gener

KIF11, CDKN1A, TPX2

, og

AURKB

forhold til

actin

. * Betegner p 0,05 i forhold til køretøjet. C) Cellelevedygtighed blev bestemt ved afslutningen af ​​behandlingen med trypan ekskluderingsmetode blå. p. 0,01 til 250 nM og 500 nM doser vs. køretøj i alle tre cellelinjer

Diskussion

Det er godt værdsat, at AR er en kritisk drivkraft for prostata kræftcellen overlevelse, og at AR står for progression til fatal CRPC trods behandling med ADT [24]. I mange tilfælde androgener fortsætter intracellulært inden CRPC tumorer trods kastrationsniveauer serumniveauer af androgener [24], [32]. Imidlertid har androgen ligand-uafhængige, men AR-afhængige mekanismer, som også fremmer overlevelsen af ​​CRPC celler blevet rapporteret. Disse omfatter aktivering af AR ved IL-6, AR genamplifikation, og AR transcript varianter, der mangler androgen ligandbindingsdomænet [7] – [9], [15]. Alle disse mekanismer kan bidrage til prostatakræft progression trods ADT da ingen er direkte ramt af ADT.

For nylig blev det påvist, at AR protein fremmer ekspressionen af ​​et gen program adskiller sig fra sin kanoniske androgen ligand-rettet mål i CRPC celler [17]. Et sådant eksempel er den AR målgen

UBE2C

der fremmer ligand-uafhængig prostatacancer proliferation [17]. Hvilke af de andre AR-inducerede genprodukter er kritisk for ligand-uafhængig prostatacancer celleoverlevelse har været uklar. Vores arbejde viser, at

c-Myc

onkogen er sådan en ligand-uafhængig AR målgen.

c-Myc

almindeligvis opreguleret i prostatacancer, og

c-Myc

overekspression forvandler normale prostataepitelceller i genmanipulerede musemodeller for prostatakræft og bibringer ligand-uafhængig prostatacancer celleoverlevelse, men afhængigheden af ​​

c-Myc

ekspression på AR var uklart [18], [20], [21], [33]. Vi viser her, at

AR

og

c-myc

er almindeligt opreguleret i CRPC, og vi bekræftede, at

AR

og

c-myc

opregulering stærkt korreleret med hinanden i en stor serie af metastatiske CRPC patientens tumorer (figur 1).

Vi bekræftede, at

AR

suppression fører til tab af c-myc-ekspression i prostata cancer cellelinjer, der udtrykker fuld -længde AR (LNCaP og Abl) og i et andet CRPC cellelinje 22RV1, der udtrykker både fuld længde AR og en AR udskrift variant. Selvom vi ikke kan udelukke en rolle for AR udskrift variant også fremme

c-myc

udtryk, vores resultater med AR RNAi i LNCaP og Abl og vores resultater med AR overekspression i M12 celler viser, at fuld-længde AR er stand til at aktivere

c-Myc

ekspression (figur 4, figur S4).

lide

AR

RNAi,

c-Myc

RNAi reduceret prostatakræft celleoverlevelse i androgen ligand-depleterede betingelser, mens co-suppression af

AR

og

c-Myc

var ikke mere effektiv end undertrykkelse af enten protein alene (figur 2, figur S1).

c-myc

overekspression giver ligand-uafhængig overlevelse til prostatacancerceller (figur S2), der matcher en forudgående rapport [21]. Vi viste også, at

c-Myc

overekspression svækkede antitumoraktiviteten af ​​

AR

suppression med RNAi (figur 2C). Således c-Myc bidrager til AR virkninger på fremme ligand-uafhængig prostatacancer celleoverlevelse.

Selvom AR fremmer ekspression af

c-Myc

, behandling med androgen ligand forøgede ikke

c-Myc

ekspression (figur 3). Derudover gjorde behandling med androgen ligander ikke øge AR belægning på

c-myc

forstærker (figur 3). Dette står i kontrast med virkningerne af androgen stimulation på udtryk for

KLK3

gen, en velbeskrevet androgen-aktiverede gen, og AR belægningsprocent på

KLK3

forstærker (figur 3). For yderligere at bekræfte, at AR fremmer udtryk for

c-myc

i en ligand-uafhængig måde, vi behandlede prostatacancerceller med det nye, potent androgen antagonist MDV3100 [26]. Behandling med MDV3100 i en nylig randomiseret, placebokontrolleret fase III klinisk forsøg forbedret samlet overlevelse af patienter med CRPC [34]. Men i nogle patienter er der ikke tumorrespons, og på progression AR forbliver i kernen [3], [6], [34]. Mens MDV3100 behandling reduceret ekspression af

KLK3

, MDV3100 behandling havde ingen effekt på

c-myc

udtryk (figur S3). Disse data understøtter endvidere den opfattelse, at AR fremmer

c-myc

udtryk i en ligand-uafhængig måde.

c-Myc

er en kritisk faktor i ligand-uafhængig prostatacancer progression (Figur 2, Figur S2) [21]. Derfor, i fremtiden vil det være vigtigt at måle

c-myc

udtryk og funktion i CRPC patient tumorer forløber trods mere komplet androgen interferens med stoffer som MDV3100.

På grund af vigtigheden af

c-myc

som en downstream bidragyder til AR virkninger på ligand-uafhængig prostatacancer celle overlevelse, vi behandlede prostatacancerceller med BET bromodomain inhibitor JQ1, et lægemiddel kendt for at undertrykke ekspressionen af ​​bromodomain målgener; fremmest blandt hvilke var

c-myc

[22], [23]. I tidligere undersøgelser, JQ1 behandling in vitro og in vivo undertrykt c-myc-ekspression og funktion og undertrykte tumorvækst uden nævneværdig toksicitet [22], [23].

Vi bekræftede, at JQ1 behandling af prostata cancer celler ved hjælp nanomolær koncentrationer, der opnås samme overordnede virkninger som RNAi-medieret suppression af

c-Myc

– c-myc mRNA og protein udtømning, undertrykkelse af c-Myc-funktion, og undertrykkelse af ligand-uafhængig prostatacancer celleoverlevelse (fig 6 ). I lyset af at inddrage

c-myc

i kritiske fysiologiske processer, rettet mod c-myc protein generelt i flere celletyper gennem langsigtet administration kunne være uønsket [35], [36]. Kliniske forsøg vil være nødvendigt at fastslå sikkerhed for bromodomain hæmning. Men resultaterne til dato, herunder vores egen, antyder, at dette er et lovende antitumor-strategi til behandling af CRPC (figur 6) [22], [23].

Endelig at AR kontrol ekspression af sit mål gener, såsom

c-Myc

i en vævsspecifik måde tyder på, at det ideelle middel til undertrykkelse af

c-Myc

ekspression i prostatacancerceller specifikt ville målrette AR, selv. Faktisk vores studier præcisere, at androgen ligand-uafhængig, men AR-afhængige

c-myc

gen opregulering er en mekanisme, hvormed AR protein fremmer ligand-uafhængig overlevelse prostata kræftceller. Vore undersøgelser understøtter værdighed af bestræbelserne på at undertrykke AR s ligand-uafhængig funktion og udtryk vigtige ligand-uafhængig AR målgener såsom

c-myc

(figur 7). Narkotika kan undertrykke AR udtryk først nu begyndt at indtaste test. Disse lægemidler indbefatter selektive AR degraders og Ar antisense-oligonukleotider [37] – [40]. Vi afvente resultaterne af disse kliniske undersøgelser for at fastslå sikkerhed, specificitet og effektivitet af disse midler hos mænd med fremskreden prostatacancer.

øjeblikket, androgen deprivation terapier, der interfererer med androgen ligandaktivering af AR anvendes primært at behandle denne sygdom. Disse terapier undertrykke AR s androgen ligand-afhængig funktion og undertrykke ekspression af androgen ligand-afhængige (AD) AR målgener. Trods disse behandlinger prostatakræft progression er uundgåelig. AR fremmer også udtryk for androgen ligand-uafhængig veje såsom

c-myc

.

c-Myc

genet er almindeligt opreguleret i prostatacancer og bidrager til androgen ligand-uafhængig prostatacancer progression. Denne model antyder kraftigt, at AR eller c-myc-rettede terapier vil supplere de nuværende androgen afsavn strategier.

Metoder

Cell Culture

LNCaP- og 22RV1 celler blev købt fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i 10% trækul-strippet føtalt bovint serum for alle forsøg. ABL-celler, en CRPC derivat af LNCaP, var en venlig gave fra Zoran Culig, PhD og blev dyrket i RPMI med 10% trækul-strippet føtalt bovint serum. M12 prostatacancerceller udtrykker tom vektor eller AR var en venlig gave fra Stephen R. Plymate, PhD og dyrket som tidligere beskrevet [9].

I RNAi eksperimenter, LNCaP og ABL-celler blev transficeret med RNAi-oligonukleotider (

AR

: 5′-GACCUACCGAGGAGCUUUCUU-3 ‘, og

c-Myc

: 5′-GAGCUAAAACGGAGCUUUUdTdT-3′) ved anvendelse DharmaFECT 3 (Dharmacon) transfektionsreagens til en slutkoncentration på 50 nM [41]. 22RV1 celler blev transficeret med siRNA oligonukleotider ved hjælp lipofectamin 2000 (Life Technologies) transfektionsreagens til en slutkoncentration på 50 nM. Celler blev høstet ved angivne tidspunkter efter transfektion.

R1881 (Sigma) blev resuspenderet i 100% ethanol. MDV3100 blev købt (Selleckchem) og resuspenderes i DMSO. JQ1 blev indkøbt fra Sigma og resuspenderes i DMSO. Cellevækst blev bestemt ved afslutningen af ​​behandlingen med trypanblåt ekskluderingsmetode (Life Technologies) efter fabrikantens anvisninger. Alle cellekultur blev udført med biologiske tredobbelte prøver og bekræftet i gentagne eksperimenter.

LNCaP celler med stabil overekspression af c-myc eller tom vektor blev genereret ved transfektion LNCaP celler med pCDNA-DEST40-

c- myc

(venligst stillet til rådighed af Rosalie Sears, ph.d.) eller pCMV6-AN-His (Origene) og vælge med G418.

Colony-formation Assay

200.000 LNCaP celler med stabil overekspression af tom vektor (EV) eller

c-Myc

blev udpladet i 10 cm skåle. RPMI med 10% trækul-strippet føtalt bovint serum suppleret med 300 ug /ml G418 og 10 ug /ml bicalutamid behandling blev tilsat til cellerne hver anden dag i 14 dage. Derefter blev cellerne fikseret med 4% formaldehyd og farvet med syto60 (Invitrogen). Billeder blev taget med Licor Odyssey imaging system.

Immunoblotting

blev udført Immunoblotting eksperimenter som tidligere [42] beskrevet. Endelige billeder blev opnået med Licor Odyssey imaging system. Primære antistoffer blev anvendt, var: AR (N-20, Santa Cruz); actin (Sigma) og c-myc (Epitomics). Sekundære antistoffer blev købt hos Licor.

QRT-PCR

RNA blev ekstraheret fra cellepellets opbevaret i RNAlater reagens (Life Technologies) under anvendelse af en MagMAX Total RNA Isolation kit (Life Technologies) eller Trizol ( Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. RNA-koncentrationen blev bestemt ved anvendelse af et NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (NanoDrop). 250 ng-1 ug RNA (normaliseret for hvert forsøg) blev omvendt transskriberet ved hjælp af et High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Life Technologies) med tilfældige primere. Realtime (QRT) -PCR blev udført under anvendelse af en 7500 Fast thermocycler (Life Technologies) med følgende cykling: 50 ° C i 2 min, 95 ° C i 10 minutter, 40 cykler ved 95 ° C i 15 sek dissociation, 60 ° C i 1 min annealing /forlængelse /læse. 10 uL singleplex RTPCR reaktioner indeholdt 1X Taqman universel standard mastermiksens, 1X Taqman hydrolyse sonde, og 10 ng RNA-ækvivalent cDNA skabelon. Human beta-actin (# 4326315E) blev anvendt som en endogen kontrol. Primer oplysninger er indeholdt i tabel S1.