PLoS ONE: Pro-oxidant aktivitet af Amine-pyridin-Based Iron komplekser effektivt Kills Kræft og Kræft Stem-lignende celler

Abstrakt

Differential redox homeostase i normale og maligne celler antyder, at pro-oxidant-induceret opregulering af cellulære reaktive ilt arter (ROS) selektivt bør målrette kræftceller uden at kompromittere levedygtighed ikke-transformerede celler. Derfor kan en pro-oxidant afvigelse tolereres godt af ikke-maligne celler hurtigt at nå en celle-død tærskel i maligne celler, der allerede ved en høj sætpunkt konstitutiv oxidativt stress. For at teste denne hypotese, tog vi fordel af et udvalgt antal af amin-pyridin-baserede Fe (II) komplekser, der fungerer som effektive og robuste oxidationskatalysatorer af organiske substrater ved reaktion med peroxider. Fem af disse Fe (II) -complexes og de tilsvarende aminopyridin ligander blev udvalgt til at evaluere deres anticancer egenskaber. Vi fandt, at jernkomplekser undladt at vise nogen form for virksomhed, mens de tilsvarende ligander udviste signifikant antiproliferativ aktivitet. Blandt ligander, hvoraf ingen var hæmolytiske, forbindelserne 1, 2 og 5 var cytotoksisk i det lave mikromolære område mod et panel af molekylært forskellige humane cancercellelinier. Vigtigt er det, den cytotoksiske aktivitet profil nogle forbindelser forblev uændret i epitel-til-mesenchymal (EMT) -induceret stabile populationer af cancer stamceller-lignende celler, som erhvervede resistens over for velkendte ROS inducer doxorubicin. Forbindelserne 1, 2 og 5 inhiberede clonogenicity af cancerceller og induceret apoptotisk celledød ledsaget af caspase 3/7 aktivering. Flowcytometri analyser indikerer, at ligander var stærke inducere af oxidativt stress, hvilket fører til en 7 gange forøgelse i intracellulære ROS-niveauer. ROS induktion var forbundet med deres evne til at binde intracellulært jern og generere aktive koordinationskomplekser inde i celler. I modsætning hertil ekstracellulær kompleksdannelse af jern inhiberede aktiviteten af ​​liganderne. Jernkomplekser viste en høj færdighed til at spalte DNA gennem oxidative-afhængige mekanismer, hvilket antyder en sandsynlig mekanisme af cytotoksicitet. Sammenfattende rapporterer vi, at ved chelatering af intracellulær jern, pro-oxidant aktivitet af amin-pyrimidin-baserede jernkomplekser effektivt dræber cancer og cancer stamceller-lignende celler, hvilket giver funktionel dokumentation for en effektiv familie af redox-rettet anti- cancer metallodrugs

Henvisning:. González-Bártulos M, Aceves-Luquero C, Qualai J, Cussó O, Martínez MA, Fernández de Mattos S, et al. (2015) Pro-oxidant aktivitet af Amine-pyridin-Based Iron komplekser effektivt Kills og kræft Stem-lignende celler. PLoS ONE 10 (9): e0137800. doi: 10,1371 /journal.pone.0137800

Redaktør: Sujit Kumar Bhutia, Statens Institut for teknologi Rourkela, INDIEN

Modtaget: May 5, 2015; Accepteret: August 21, 2015; Udgivet: 14 September, 2015

Copyright: © 2015 González-Bártulos et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra det spanske Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), Consolider-INGENIO 2010 CSD2010-00065, og fra Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN) , SAF2012-38914, Plan Nacional de I + D + I

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræftceller undergår metabolisk tilpasninger til at opretholde deres ukontrollerede vækst og proliferation. Forskellige indre og ydre molekylære mekanismer bidrager til denne metaboliske omprogrammering at levere cancerceller med tilstrækkelig energi og biosyntetiske kapacitet i tumoren miljøet [1,2]. Ændret metabolisme sammen med aktiveret onkogen signalering og deregulering af mitokondrisk funktion resulterer typisk i en stigning i dannelsen af ​​reaktive oxygenarter (ROS) i cancerceller [3,4]. Interessant, dette fænomen fører til en differentieret redox homeostase i normale og maligne celler, der vinder frem som et lovende mål for design af mere selektive og effektive midler mod cancer [5-8].

Meget reaktiv ROS produceres i celler ved den ufuldstændige reduktion af molekylært oxygen til vand under aerobe stofskifte. ROS normalt reguleret af cellulære defensive antioxidanter [9,10] og deltage i flere cellulære funktioner, herunder signaltransduktion, enzymaktivering, genekspression og protein post-translationelle modifikationer [11]. Når der genereres i overskud eller når effektiviteten af ​​den cellulære antioxidant system er submaksimal, ROS akkumulere og forårsage irreversibel celleskade gennem oxidation af biomolekyler, såsom lipidmembraner, enzymer eller DNA, som almindeligvis fører til celledød [12]. ROS kan også fremme kræft initiering og progression ved at inducere DNA mutationer og pro-onkogene signalveje [13,14].

Øget ROS i cancerceller opregulerer antioxidant respons, hvilket resulterer i en ny redox balance, som muliggør disse celler at opretholde højere ROS niveauer end normale celler. Følgelig cancerceller udviser vedvarende oxidativ stress, som fremmer celleproliferation men er utilstrækkelig til at fremkalde celledød [4,13]. Denne ændrede homeostase gør kræftceller sårbare over for eksogene oxidationsmidler, der genererer ekstra ROS, som sandsynligvis vil øge oxidativ stress niveauer over den cytotoksiske tærskel. Denne modtagelighed forstærkes af det begrænsede kapacitet af kræftceller til at styrke antioxidant reaktion at neutralisere den oxidative fornærmelse [15]. I modsætning hertil kan normale celler tåle højere niveauer af exogent ROS stress, da de udviser lavere konstitutive ROS-niveauer sammen med en overlegen reaktionsevne antioxidantsystemer. Faktisk er det godt beskrevet, at der ud over deres direkte virkninger på DNA og celledeling, virkningsmekanismen af ​​mange kemoterapeutiske midler, såsom 5-fluoruracil, bleomycin, cisplatin, doxorubicin eller paclitaxel involverer også ROS-medieret apoptose [13 , 16-19].

Mens de biologiske virkninger af ROS og de mekanismer, der regulerer ROS niveauer er veletableret i kræftceller, er lidt kendt om den rolle, ROS i cancer stamceller (CSC) delpopulation, der viser en høj kapacitet til selv-fornyelse og differentiering og også potentiale til at generere tumorer med en markant kemo /radio modstand [20,21]. CSCS indeholde lavere niveauer af ROS end ikke-CSCS, sandsynlige som følge af forbedrede fri radikal udsugningssystemer [22]. Lav ROS niveauer kan være relateret til den privilegerede status for denne delmængde af celler, bevare DNA integritet og protein funktion, som er afgørende for at opretholde muligheden for selv-fornyelse og stemness [23,24]. Således kan eksogen ROS elevation være en tilgang til at dræbe CSC subpopulationen, som normalt beriget efter konventionel kemoterapi. Faktisk niclosamid og arsentrioxid (AS

2O

3), som er potente ROS spoler, er blevet vist at fremme CSC død [25].

Et antal anticancermidler, der målretter den cellulære redox balance er i forskellige faser af præklinisk og klinisk udvikling [5,6]. Mekanistisk, disse midler enten hæmme cellulære antioxidant forsvarssystemer [27-29] eller generere ROS [30-32]. Ud over disse midler, kan overgangsmetalforbindelser-baserede forbindelser være lovende kandidater til pro-oxidant terapier. Når akkumuleret i celler, metaller, såsom jern, mangan og kobber, undergår cykling redoxreaktioner, der udsender store mængder ROS, hovedsagelig de stærkt skadelige hydroxylradikalscavengers arter gennem Fenton reaktionen. Dette metal-medieret form for oxidativt stress er en velkendt årsag til celledød [33], og dermed et stigende antal undersøgelser udforsker potentialet i metallodrugs i redox-baserede anticancer behandlinger [34-37].

overgangsmetalkomplekser med aminopyridin-holdige organiske scaffolds er dukket op som kraftige katalysatorer til oxidation af organiske substrater. Disse komplekser betragtes også som bioinspirerede katalysatorer, eftersom de reproducerer strukturelle og reaktivitet egenskaber af oxidative enzymer. Et centralt aspekt af deres aktivitet er deres stærke binding til jern og mangan ioner, genererer stærke oxidanter efter reagere med peroxider [38-43]. Disse oxiderende forbindelser fungere som katalysatorer til at fremme oxidationen af ​​inerte molekyler, såsom alkaner, alkener og endda den udfordrende vandmolekylet. Virkningsmekanismen involverer jern-peroxid arter, kemisk minder til aktiveret bleomycin. Desuden er disse forbindelser meget modstandsdygtige over for selv-oxidation. Med denne baggrund, vi her vurderede antiproliferative og cytotoksiske aktivitet profiler af fem amino-pyridin-baserede Fe (II) -complexes som tidligere er blevet vist at være særligt aktive i peroxid aktiveringsreaktioner [38-43], og den tilsvarende metal- gratis ligander, mod et panel af forskellige humane cellelinjer, herunder epitel-til-mesenkymale (EMT) -induceret stabile populationer af cancer stamceller-lignende celler og ikke-maligne celler. De mest aktive forbindelser blev yderligere analyseret for deres evne til at inhibere clonogenicity af kræftceller, modulere cellecyklussen og inducerer celledød. Kapaciteten af ​​aminen-pyrimidin-baserede jernkomplekser at generere ROS og forårsage DNA-skader blev evalueret sammen med indflydelsen af ​​chelatering af intracellulær jern på deres cytotoksiske profil. Baseret på den dødbringende forstyrrelser i redox balance forårsaget af disse komplekser i kræft og ROS-resistente cancer stamceller-lignende celler, giver vi stærke funktionelle beviser for en effektiv familie af redox-rettet anti-cancer metallodrugs.

Materialer og Methods

Materialer

3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT), dimethylsulfoxid (DMSO), propidiumiodid (PI) , deferoxaminemesylate salt (DFO), N-acetyl-L-cystein (NAC), calcein-acetoxymethylester (calcein-AM), cacodylatbuffer, Tris-EDTA (ethylen-diamino tetraeddikesyre), Tiron, natriumazid, methyl grøn, Hoechst ethidiumbromid, bromphenolblåt, xylencyanol, glycerol og RNase A var fra Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Methylenblåt, hydrogenperoxid 35% (vægt /volumen) og ethanol var fra Panreac (Barcelona, ​​Spanien). HEPES var fra ICN (Madrid, Spanien). Triton-X100 var fra Plusone (Amersham Bioscience, Uppsala, Sverige). 2 ‘, 7’-Dichlorodihydrofluorescein diacetat (H

2DCFDA) var fra Molecular Probes (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Agarose var fra Ecogen (Barcelona, ​​Spanien). Cisplatin (Pharmacia, Pfizer Inc., Kalamazoo, MI, USA) er venligst leveret af apoteket af den catalanske Institut for Onkologi (ICO, Hospital Dr. Josep Trueta, Gerona, Spanien). Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), RPMI-1640 medium, phosphatbufret saltvand (PBS), kalvefosterserum (FBS), blev penicillin-streptomycin og trypsin opnået fra GIBCO BRL (Grand Island, NY, USA). DMEM /F12, hesteserum og insulin var fra Invitrogen. Hydrocortison, choleratoksin og epidermal vækstfaktor var fra Sigma-Aldrich. Brystepitelceller Cell Growth Medium (MEGM) var fra Lonza (Berkshire, UK). PUC18-plasmidet var fra Thermo Scientific (Waltham, MA, USA). Forbindelser valgt til denne undersøgelse (1, 1-Fe, 2, 2-Fe, 3, 3-Fe, 4, 4-Fe, 5 og 5-Fe) blev syntetiseret ved indberettede procedurer [38-41].

Cellelinjer

Humant MCF-7 brystcancer cellelinje, Capan-1 pancreascancer cellelinje, PC-3 prostatacancer-cellelinie, Z-138, Jeko-1, Granta og SP53 non-Hodgkins lymfomcellelinjer, Jurkat T-celle akut lymfoblastisk leukæmi-celler, LN229 og U87MG glioma cellelinjer og MCF 10A udødeliggjort brystepitel- cellelinje blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). CCD-18Co human kolon fibroblast cellelinje blev opnået fra EucellBank (University of Barcelona, ​​Barcelona, ​​Spanien). 1BR3G transformerede humane hudfibroblaster blev opnået fra European Collection of Cell Cultures (ECACC, Porton, UK). MCF-7, Capan-1, PC-3, LN229 og U87MG blev opretholdt i DMEM. Hæmatologiske cellelinier blev holdt i RPMI-1640. Alle medier blev suppleret med 10% FBS og 100 U /ml penicillin-streptomycin. Medium til JURKAT blev Jeko-1 og Z-138 celler suppleret med 25 mmol /l HEPES. MCF 10A-celler blev opretholdt i DMEM /F12 suppleret med 5% hesteserum, 500 ng /ml hydrocortison, 100 ng /ml koleratoksin, 10 ug /ml insulin og 20 ng /ml epidermal vækstfaktor. HMLE celler (immortaliserede humane mammae epitelceller), HMLER celler (HMLE celler, der overudtrykker hTERT, SV40 T /T og H-RASV12) og HMLERshEcad cancer stamceller-lignende celler (HMLER celler transformeret via korte hårnål RNA til at inhibere ekspression af CDH1 genet, som koder for E-cadherin) [44], blev holdt i en 1: 1 blanding af HMLE medium (DMEM /F-12 plus 5% hesteserum, penicillin-streptomycin-glutamin (PSG), 10 ug /ml insulin, 10 ng /ml epidermal vækstfaktor og 0,5 g /ml hydrocortison) og MEGM. Alle cellelinier blev dyrket ved 37 ° C under en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2

cytotoksicitetsassays

Den cytotoksiske aktivitet af forbindelserne blev bestemt ved MTT reduktion assay som beskrevet [ ,,,0],45]. Forbindelser blev fortyndet i Milli-Q-vand til opnåelse af 1 mmol /l stamopløsninger. Passende alikvoter af disse opløsninger blev fortyndet i den tilsvarende celle dyrkningsmedium til opnåelse af de endelige arbejder koncentrationer. Portioner af 5000 1BR3G celler, 6000 MCF-7, 6000 PC-3-celler, 10 000 Capan-1 celler, 4000 MCF 10A-celler, 4000 HMLE celler eller 4000 CCD-18Co-celler blev podet i plader med 96 brønde, 24 timer før behandlingerne. Hæmatologiske cellelinier blev podet ved 400 000 celler /ml. Celler blev behandlet med den tilsvarende forbindelse i koncentrationer i området fra 0 til 100 pmol /l i 48 timer. Tre gentagelser for hver forbindelse blev anvendt. IC

50 blev etableret for hver forbindelse med standard ikke-lineær regression og kurve montering ved hjælp af GraphPad Prism (Graph Pad Software Inc., La Jolla, CA, USA).

Hæmolytisk assay

hæmolytiske aktivitet af forbindelserne ved 100 pmol /l blev vurderet ved at bestemme hæmoglobin-frigivelse fra erythrocyt suspensioner af frisk humant blod (5% vol /vol) som beskrevet [46].

Kolonidannelse assay

MCF-7-celler blev podet i 12-brønds plader. Fireogtyve timer senere blev celler behandlet med cisplatin, forbindelse 1, 2 eller 5 ved 10 umol /L, eller bærestof som kontrol, i 3 og 24 timer ved 37 ° C. Derudover blev cellerne eksponeret til forbindelse 1 i 3, 6, 12 og 24 timer. Efterfølgende blev cellerne vasket med PBS, opsamlet med trypsin og udpladet ved lav densitet (3000 celler i en 360 mm plade). Cellerne fik lov at dele sig og danne kolonier i 7-10 dage; hvorefter blev kolonier fikseret og farvet med 2% methylenblåt i 50% ethanol. Antallet af kolonier i hver plade blev bestemt ved anvendelse Alpha Innotech Imaging System (Alpha Innotech, San Leandro, CA).

Caspase aktivitetsanalyse

Enzymatisk caspaseaktivitet blev bestemt efter udsættelse af cellerne for forbindelse 1, 2 og 5 ved 10 umol /L i 48 timer. Caspase 3/7 aktivitet blev målt med luminometrisk caspase-Glo 3 /7assay (Promega, Madison, WI, USA) under anvendelse af en Synergy HT multi-detektion mikropladelæser (Bio-Tek).

Cellecyklusanalyse

cellecyklus-profiler blev analyseret ved flowcytometri af PI-farvede celler. Kort beskrevet blev celler opsamlet ved centrifugering, vasket i iskold PBS og fikseret i 30 minutter ved 4 ° C i 70% ethanol. Efter vask to gange med PBS, blev DNA farvet med 50 pg /ml PI i nærvær af 50 ug /ml RNase A. farvede celler blev derefter behandlet på en FACScan flowcytometer (Coulter Epics XL-MSL, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) og winMDI software.

ROS maaletemperaturen

Cellular ROS-indholdet blev bestemt ved hjælp af 2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetat sonde (H

2DCFDA). Celler blev podet i 24-brønds plader (50 000 celler /brønd) i phenolrødt-frit DMEM 24 timer før behandlinger. Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af forbindelse 1, 2 og 5 (2,5, 5 eller 10 pmol /L) eller bærer alene som en kontrol, i 5 eller 24 timer ved 37 ° C. I nogle eksperimenter blev celler co-behandlet med forbindelserne plus 5 mmol /l NAC. Efter behandlingerne blev celler vasket med PBS og inkuberet med 1 pmol /L H

2DCF-DA i PBS i 30 minutter i mørke. Efter vask blev cellerne indsamlet med trypsin og analyseret ved flowcytometri hjælp af en FACS-Calibur flowcytometer (Becton-Dickinson®, Immunofluorometry Systems, Mountain View, CA, USA). Den geometriske gennemsnitlige fluorescensintensitet på 10 000 celler blev etableret under anvendelse CellQuestTM software (Becton Dickinson). Den fluorescens fold-stigning versus ubehandlede celler blev bestemt for hver behandling.

Bestemmelse af cellulære labile jern pool

Det cellulære labile jern pulje blev bestemt med calcein-AM. Capan-1-celler (125 000 celler /brønd) blev podet i plader med 24 brønde og inkuberet i 24 timer. Derefter blev cellerne behandlet i 24 timer med 10 pmol /l af forbindelse 1, 2 eller 5 ved 37 ° C. I nogle eksperimenter blev celler inkuberet i 2 timer med 100 pmol /L i DFO eller 100 pmol /L FeCl

2. Celler udsat for alene køretøjet blev anvendt som kontrol. Efter behandlingerne blev celler vasket med PBS og inkuberet med calcein-AM (0,25 mmol /l) i 30 min ved 37 ° C i mørke. Efterfølgende blev cellerne vasket og opsamlet med trypsin og den geometriske gennemsnitlige fluorescensintensitet på 10 000 celler blev bestemt ved flowcytometri som beskrevet.

Cellulær DNA skader analyse

DNA beskadigelse blev vurderet ved at overvåge intensiteten af ​​p-H2A.X fluorescens under anvendelse af flowcytometri. Kort beskrevet blev celler opsamlet med trypsin, vasket i PBS og fikseres i 3,7% formaldehyd i 15 minutter på is. Celler blev derefter permeabiliseres med 0,2% vol /vol Triton-X100 i 10 minutter og inkuberet med 1: 400 kanin-anti-p- (S139) -H2A.X antistof (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) i 30 minutter på is. Efter vask i 0,1% Triton-X100 i PBS blev cellerne inkuberet med 1: 400 anti-kanin Alexa 555-konjugeret antistof (Jackson ImmunoResearch, Newmarket, UK) i 20 minutter på is. Analyse blev udført i en FACScan flowcytometer med strømmende software.

DNA-spaltning analyse

DNA-spaltning blev overvåget ved agarosegelelektroforese. En stamopløsning af pUC18 DNA blev frisk fremstillet i Milli-Q-vand i en koncentration på 0,5 ug /ml (1512 pmol /L nukleotider, 756 pmol /L bp). Reaktioner blev udført ved blanding af 0,5 pi pUC18 med passende portioner af forbindelserne og 1 pi aktiverende middel-opløsning (35% vægt /volumen H

2O

2 i H

2O). Cacodylatbuffer (0,1 M, pH 6,0) blev sat til blandingen til opnåelse af et slutvolumen på 20 pi. Slutkoncentrationen af ​​pUC18 DNA var 37,8 pmol /L i nukleotider (18,9 pmol /L bp). Prøver blev inkuberet i 1 time ved 37 ° C; reaktioner blev standset ved tilsætning af 6 pi af en pufferopløsning bestående af bromphenolblåt (0,25%), xylencyanol (0,25%) og glycerol (30%). Efterfølgende blev prøverne underkastet elektroforese i 0,8% agarosegeler i 0,5 × TBE-buffer (0,045 mol /l Tris, 0,045 mol /l borsyre og 1 mmol /l EDTA) ved 100 V i 1 time og 40 min. Geler blev farvet med ethidiumbromid (10 mg /ml i TBE) i 15 minutter og visualiseres under UV-gennemlysning. DNA-bånd blev taget med PROGRES CapturePro 2.7 systemet, og intensiteten af ​​hvert bånd blev kvantificeret med GelQuant version 2.7 software (DNR Bio-Imaging Systems, Jerusalem, Israel) under anvendelse af en korrektionsfaktor på 1,31 for at kompensere for den reducerede ethidiumbromid optagelse af supersnoet plasmid pUC18 DNA [47]. Andelen af ​​forskellige former for plasmid-DNA blev fastsat for hver behandling. For at teste inddragelse af ROS i strengspaltning og eventuelle kompleks-DNA-vekselvirkninger sites blev forskellige ROS skyllevæsker og groove-bindere, hvormed reaktionsblandingerne. De skyllevæsker blev anvendt, var Tiron (10 mmol /l), natriumazid (0,4 mol /l), og dimethylsulfoxid (DMSO, 3 pi). De groove bindere anvendte var methyl grøn (20 mmol /l) og Hoechst (40 pmol /L)

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført med SPSS statistisk software til Windows (version 15.0.; SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Kvantitative variabler blev udtrykt som middelværdi og standardafvigelse (SD) på mindst tre uafhængige forsøg. Normaliteten af ​​dataene blev testet under anvendelse af Shapiro-Wilk test. Forskellene mellem data med normal fordeling og homogene varianser blev analyseret under anvendelse af parametrisk Students t-test. En værdi på p 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Valg af forbindelser

Jern koordinering komplekser 1-Fe, 2-Fe, 3-Fe, 4-Fe. og 5-Fe blev udvalgt til analyse af deres antitumoraktivitet mod forskellige humane cellelinjer baseret på deres evne til at danne stærkt oxiderende arter ved reaktion med peroxider [38-43]. Fire Fe (II) -baserede komplekser 1-Fe, 2-Fe, 3-Fe og 4-Fe indeholder tetradentate aminopyridin ligander og er kendt for deres overlegne aktivitet i oxidation katalyse [38-40,42,43]. Kompleks 5-Fe indeholder en pentadentat ligand og er kendt for at stabilisere høje oxidationstrin af jern [41]. Derudover jern organiske forbindelser 1, 2, 3, 4 og 5 blev testet for at vurdere effekten af ​​metal ligering for deres cytotoksiske aktivitet (figur 1).

forbindelserne 1, 2 og 5 er meget cytotoksisk over for cancer og cancer stamceller-lignende celler Salg

antiproliferative aktivitet af jernkomplekserne (1-Fe, 2-Fe, 3-Fe, 4-Fe og 5-Fe) og den tilsvarende jernfri ligander (1, 2, 3, 4 og 5) blev indledningsvis testet mod to tumor kræftceller linjer, MCF-7 og Capan-1. Forbindelser blev testet ved forskellige koncentrationer i området fra 0 til 100 pmol /l for at bestemme koncentrationen krævet for at inhibere cellevækst med 50% (IC

50). Forbindelser med IC

50 værdier større end 100 mmol /l blev anset for at være inaktive. Kun tre af de fem jernkomplekser (1-Fe, 3-Fe, 4-Fe) viste en målelig antiproliferativ virkning i MCF-7-celler, mens ingen af ​​jernkomplekser var aktive over Capan-1-celler (tabel 1). Den antiproliferative aktivitet af 3-Fe og 4-Fe var temmelig beskedne (IC

50 = 73,5 ± 0,7 mmol /l og 63,5 ± 2,1 mmol /l, henholdsvis). I modsætning hertil alle jern-fri ligander var cytotoksiske i begge cellelinier analyseret, med IC

50 værdier i intervallet fra 3,7 ± 0,4 til 88.5 ± 0,7 pmol /L i MCF-7-celler og fra 6,0 ± 0,7 til 32,0 ± 10,4 pmol /L i Capan-1-celler. Disse værdier er inden for området på veletablerede anticancermidler, såsom cisplatin analyseret under de samme betingelser (tabel 1). I betragtning af den svage antiproliferative aktivitet af jern komplekser, vi fokuseret på de metal-organiske forbindelser og evalueret deres cytotoksicitet mod et udvalg af tumor (PC-3, Z-138 og JURKAT) og ikke-maligne (HMLE, MCF 10A, 1BR3G og CCD-18Co) cellelinier (Tabel 2). Forbindelse 2 var den mest aktive ligand mod tumorceller, med IC

50 værdier i intervallet fra 3,8 ° ± 0,2 til 7.2 ± 1,9 pmol /l. Forbindelserne 1 og 5 udviste også lave IC

50 værdier (fra 4,8 ± 1,2 til 15,1 ± 3,1 pmol /l og fra 2,9 ± 0,4 til 7,7 ± 0,3 mmol /l, henholdsvis), mens en mere moderat antitumoraktivitet blev opnået for ligander 3 og 4. Kun i den normale colon CCD-18Co cellelinje aktiviteten af ​​forbindelserne var lavere end i tumorceller linjer. Vigtigt er det, at ingen af ​​liganderne var hæmolytiske, selv ved 100 pmol /L (tabel 2). De antitumoregenskaber af liganderne blev yderligere evalueret i et panel af cellelinier, herunder human leukæmi, lymfom og gliom cancerceller, ved at analysere deres cytotoksiske virkninger ved 10 umol /L. Som forventet forbindelserne 1, 2 og 5 vises også høj antiproliferativ aktivitet mod disse cellelinier (fig 2A), viser deres evne til at være stort set aktive antitumormidler.

(A) cytotoksiske aktivitet af forbindelserne 1, 2, og 5 imod cancerceller. De angivne cellelinier blev behandlet i 48 timer med ligander (10 pmol /l) og cellelevedygtighed blev målt med MTT-assayet. Data repræsenterer procentdelen af ​​levedygtige celler i forhold til ubehandlede celler (kontrol). (B) Cytotoksicitet af doxorubicin og forbindelserne 1, 2 og 5 mod CS-lignende celler. CS-lignende HMLER-shEcad celler og ikke-CS-lignende HMLER isogene parentale celler blev behandlet i 48 timer med graduerede koncentrationer af doxorubicin, 1, 2 og 5. Cellelevedygtighed blev målt med MTT-assayet. For hver behandling, er den procentuelle andel af levedygtige celler i forhold til ubehandlede celler er angivet. Dataene repræsenterer middelværdien ± SD af 3 uafhængige forsøg udført tredobbelt. Vejviser

For at få indblik i den cytotoksiske styrken af ​​ligander 1, 2 og 5, deres antiproliferativ aktivitet blev evalueret i en stabil brystcancer stamceller (CS) -lignende cellelinie (HMLER-shEcad). Denne cellelinje blev oprindeligt etableret fra triple onkogene transformerede og immortaliserede humane mammae epitelceller (HMLER), hvor knockdown af E-cadherin udløst en epitelial-mesenkymale overgang (EMT), som resulterede i celler med funktioner karakteristiske for CSCS [44,48]. Som forventet, CS-lignende HMLER-shECad celler var mere resistente over for den velkendte kemoterapimiddel doxorubicin end ikke-CS-lignende HMLER isogene kontrolceller [48] (IC

50 = 0,3 ± 0,02 pmol /l vs 0,10 ± 0,02 mmol /l, henholdsvis repræsenterer en ~ 3 gange stigning i IC

50) (fig 2B). I modsætning hertil cytotoksiske profil af ligander 1 og 2 forblev stort set uforandret i CS-lignende HMLER-shECad celler (IC

50 = 5,3 ± 0,7 pmol /l og 6,8 ± 0,1 pmol /l, henholdsvis) i forhold til HMLER celler ( IC

50 = 6,5 ± 0,4 pmol /l og 6,6 ± 0,3 pmol /l, henholdsvis) (fig 2B), hvilket indikerer, at disse ligander inducerer celledød via en mekanisme, der ikke ved undertrykkes af kemoterapi-CS-lignende fænotype. Endvidere forbindelse 1 viste nogle selektive cytotoksicitet dybt HMLER-shECad celler. I modsætning hertil HMLER-shECad udstillet en vis modstand mod ligand 5-induceret cytotoksicitet (IC

50 = 8,6 ± 0,5 mmol /l sammenlignet med 5,1 ± 0,1 mmol /l i HMLER celler) (Fig 2B).

den langsigtede virkning af liganderne blev bestemt ved måling af deres evne til at inhibere klonogene potentiale af cancerceller. Således blev MCF-7-celler behandlet i 3 eller 24 timer med 10 pmol /l af ligand 1, 2 eller 5, eller cisplatin som en positiv kontrol, efterfulgt af udpladning ved lav densitet. Analyse af koloni-numre efter 10 dage viste en markant inhiberende virkning af forbindelse 2 på kolonidannelse, og antallet af kolonier var signifikant reduceret med 39% sammenlignet med kontrolceller efter 3 h udsættelse for liganden (Fig 3A). Endvidere blev clonogenicity af MCF-7-celler næsten afskaffet efter 24 timers eksponering til forbindelse 2, afslører en større inhibitorisk aktivitet end cisplatin. På dette tidspunkt, forbindelser 1 og 5 reducerede også signifikant koloni tal ved 57% og 53%, henholdsvis, selvom deres aktivitet var lavere end forbindelse 2, hvilket er i overensstemmelse med den antiproliferative aktivitet af liganderne (tabel 2). I modsætning til cisplatin behandling, inhibering af cellevækst med ligander var tidsafhængig. Eksponering af MCF-7-celler til ligand 1 for 3, 5, 12 og 24 timer reduceret antallet af kolonier med 0%, 18,7%, 40,5% og 56,6%, henholdsvis (fig 3B). Disse resultater indikerer, at liganderne udløse en forsinket celledød mekanisme, der kræver flere timer at finde sted.

(A) Kolonidannelse af MCF-7-celler efter eksponering for forbindelserne 1, 2 og 5 (10 pmol /L ) i 3 eller 24 timer. Cisplatin blev indbefattet som en positiv kontrol. (B) Colony dannelse efter udsættelse til forbindelse 1 (10 pmol /l) i 3, 5, 12 og 24 timer. Søjlediagrammer viser procentdelen af ​​optalte kolonier i forhold til kontrol ubehandlede celler og repræsenterer middelværdien ± SD af 3 uafhængige forsøg. * P 0,05 versus kontrol celler.

Forbindelser 1, 2 og 5 fremmer cellecyklusstop og apoptose

For at bestemme, om de ligander inducerer celledød via aktivering af programmeret celledød (apoptose) , aktiveringen af ​​Bøddelens caspaser, caspase-3 og -7, blev analyseret under anvendelse af en luminometrisk assay i et panel af humane cancercellelinjer. Celler blev behandlet med liganderne ved 10 umol /L og caspase-aktivitet blev overvåget efter 48 timer. Alle tre ligander aktiveret caspase 3/7 i nogen grad (figur 4). Forbindelse 2 behandlingen tydeligt forøget caspase 3/7 aktivitet i alle cellelinier i sammenligning med ubehandlede kontroller. Interessant, behandling med forbindelse 1 førte til betydelig caspase 3/7 aktivering i lymfom (Z-138, Jeko-1, Granta og SP-53), men ikke i leukæmi (JURKAT) eller gliom (LN229 og U87MG) cellelinjer. Forbindelse 5 inducerede en bred pro-apoptotisk virkning, aktiverende caspase 3/7 i de fleste cellelinjer, bortset PC-3-celler, og var den mest effektive forbindelse over for Jurkat-celler (figur 4). Vigtigere er, disse resultater korrelerer stærkt med profilen af ​​cytotoksiske virkninger induceret af forbindelserne 1, 2 og 5 (fig 2A), og antyder, at forbindelserne 2 og 5 fremmer celledød hovedsagelig ved at inducere apoptose. Disse resultater blev bekræftet ved at analysere virkningen af ​​caspase-inhibering på den cytotoksiske aktivitet af forbindelserne. Som vist i fig 4B, den pan-caspaseinhibitoren QVD-Oph reverterede signifikant cytotoksicitet af forbindelser 1 og 5 i MCF-7 og Capan-1-celler at inducere en stigning i celle levedygtighed mellem 2,5 og til 4 gange. Bemærkelsesværdigt, i forståelse med vores tidligere observationer, forbindelse 2 viste en meget høj cytotoksisk aktivitet, hvilket kan forklare den manglende reversion i nærvær af caspaseinhibitoren i disse eksperimentelle betingelser. Disse resultater understøtter, at den cytotoksiske aktivitet af disse forbindelser indebærer caspase-afhængig apoptose.

(A) De angivne cellelinier blev behandlet i 48 timer med forbindelserne 1, 2 og 5 (10 pmol /l) og caspase 3 /7-aktivitet blev målt som angivet i Materialer og Metoder. Søjlediagrammer viser fold stigning i caspase aktivitet i forhold til ubehandlet (kontrol) og repræsenterer middelværdien ± SD fra tre uafhængige forsøg udført in triplo. (B) MCF-7 og Capan-1-celler blev behandlet i 48 timer med liganderne (10 uM) i fravær (-) eller nærvær (+) af pan-caspaseinhibitoren QVD-Oph (20 uM) og cellelevedygtighed blev målt med MTT-assayet. Dataene viser procentdelen af ​​levedygtige celler i forhold til ubehandlede celler (kontrol). Data repræsenterer middelværdien ± SD af 3 uafhængige eksperimenter udført i triplikat. Forskellene mellem fravær og tilstedeværelse af QVD-OPh behandling var statistisk signifikante ved * p 0,05, ** p 0,01 og *** p. 0,001

For at undersøge effekten af ​​ligander på celle cyklus progression, cellecyklus distribution af MCF-7 og LN229 celler blev undersøgt ved flowcytometri efter 24 og 48 timers udsættelse for forbindelserne 1, 2 og 5 (10 pmol /L). 0,05.