PLoS ONE: Evaluering af en Novel Hexavalent humaniseret anti-IGF-1R-antistof og dets Bivalent Parental IgG i forskellige cancercellelinier Lines

abstrakt

En vigtig mekanisme af monoklonale antistoffer, som selektivt målretter insulin-lignende vækstfaktor type 1 receptor (IGF-1R) til at inhibere tumorvækst er ved nedregulering receptoren, uanset om de er i stand (antagonistisk) eller stand (agonistisk) til at blokere bindingen af ​​beslægtede ligander. Vi har udviklet og karakteriseret en hidtil ukendt agonistisk anti-IGF-1R humaniseret antistof, HR1, og anvendes Dock-og-lås (DNL) metode til at konstruere Hex-HR1, den første multivalent antistof omfattende 6 funktionelle Fab’er af HR1, med det formål til at forøge styrken af ​​HR1. Baseret på tværs af blokerende eksperimenter, HR1 genkender en region af cystein-rige domæne på α-underenheden, forskellige fra de epitoper kortlagt for eksisterende anti-IGF-1R-antistoffer, endnu HR1 ligner andre anti-IGF-1R-antistoffer i nedregulering IGF-1R og inhibering af proliferation, kolonidannelse, eller invasion af udvalgte cancercellelinier in vitro, samt undertrykke væksten af ​​RH-30 rhabdomyosarcom xenograft i nøgne mus, når det kombineres med mTOR inhibitor, rapamycin. Hex-HR1 og HR1 er generelt sammenlignelige i deres bioaktiviteter under in-intro og in vivo betingelser undersøgt. Ikke desto mindre, i selektive forsøg med en direkte sammenligning af potens, Hex-HR1 demonstrerede en stærkere effekt på at hæmme celledeling stimuleret af IGF-1 og effektivt kunne nedregulere IGF-1R ved en koncentration så lav som 20 pM.

citation: Chang CH, Wang Y, Trisal P, Li R, Rossi DL, Nair A, et al. (2012) Evaluering af en roman Hexavalent humaniseret anti-IGF-1R antistof og dens bivalent Parental IgG i Diverse kræftceller. PLoS ONE 7 (8): e44235. doi: 10,1371 /journal.pone.0044235

Redaktør: Zhaozhong Han, Vanderbilt University, USA

Modtaget: 24. maj 2012; Accepteret: 30 Juli 2012; Udgivet: 31 august, 2012 |

Copyright: © Chang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af National Cancer Institute giver 1R 43CA150742-01 fra USA National Institutes of Health. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret følgende interesser. Selvom en eller flere af forfatterne er ansat af kommercielle virksomheder Immunomedics, Inc, IBC Pharmaceuticals, Inc, og centrum for Molekylær Medicin og Immunologi, ændrer det ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Indledning

Signaler transmitteres gennem celleoverflade vækstfaktorreceptorer efter binding til beslægtede ligander er afgørende for reguleringen normal cellevækst og differentiering, men også bidrage til udvikling, proliferation, overlevelse, bevægelighed og metastase af forskellige typer af maligne celler, som eksemplificeret ved velundersøgte insulinlignende vækstfaktorer (IGF’er), og deres vigtigste signalering receptor, IGF-1R [1] – [4]. IGF signalering akse består også af insulin som en ligand; tre andre homo-receptorer, IGF-2R, insulinreceptor isoform A (IRA), og insulin receptor isoform B (IRB); tre hybrid-receptorer, hver dannet af IGF-1R og IRA, IGF-1R og IRB, og IRA og IRB; seks IGF-bindende proteiner (IGFBRs); og en gruppe af proteaser, som nedbryder IGFBP’er at frigive IGF’er. IGF-1R er en receptortyrosinkinase, omfattende to disulfidbundne ekstracellulære a-underenheder, hver også disulfidbundne til en transmembran β-underenheden. Det cytoplasmatiske område af β-underenheden huser et tyrosinkinasedomæne, samt en docking site for medlemmer af insulinreceptoren substrat (IRS) familie, og SH2-holdige adapter protein, Shc [5]. IGF-1 binder til a-subunits af IGF-1R med en højere affinitet end IGF-2 [6]. Indgrebet af IGF-1R af IGF’er inducerer autophosphorylering af de tre tyrosinrester i kinase domæne af β-subunit [7], hvilket yderligere phosphorylerer andre tyrosinrester i det cytoplasmatiske domæne, hvilket fører til rekruttering af IRS og Shc, med efterfølgende aktivering af både phosphoinositid 3-kinase (PI3K) -Akt og mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) veje [8]. De minimale strukturelle elementer af IGF-1 bindingssted på IGF-1R er blevet bestemt [9] for at kræve den N-terminale L1 domæne (aa 1-150), den C-terminale ende af den cysteinrige domæne (aa 190- 300), og den C-terminale ende af α-underenhed (aa 692-702). Til sammenligning blev de funktionelle epitoper af IGF-2 på IGF-1R kortlagt [10] for at involvere den N-terminale L1 domæne og det C-terminale ende af α-underenheden, men ikke den cysteinrige domæne. Foruden IGFBP’er, er biotilgængeligheden af ​​IGF-2 også reguleres af IGF-2R, som mangler intracellulær kinaseaktivitet og fungerer således som en scavenger receptor for IGF-2. Selvom IRB kun genkender insulin, dets splejsningsvariant, IRA, som er mest almindeligt udtrykt af tumorer, bindes også til IGF-2 [11] med høj affinitet, hvilket resulterer i mitogene virkninger og øget overlevelse, motilitet, og invasivitet af cancerceller [12 ]. Kompleksiteten af ​​IGF-signalsystem er yderligere forstærket ved evnen af ​​IGF-2 til at stimulere IRA og IRA /IRB, evne til både IGF-1 og IGF-2 til at stimulere IGF-1R, IGF-1R /IRA, og IGF-1R /IRB, og krydstale mellem IGF-1R og EGFR [13] – [15], som alle synes at udgøre veje for visse cancerceller at undslippe IGF-1R-målrettede behandlinger og tilvejebringer rationalet for cotargeting IGF -1R med IR [16], [17] eller EGFR /HER2 [18], [19] for at forbedre behandlingseffektiviteten.

potentialet for målretning IGF-1R til behandling af kræft blev demonstreret indledningsvis ved evnen af αIR-3, et monoklonalt muse-antistof (mAb), som blokerer IGF-1R binding [20], til at inhibere in vivo vækst af østrogen-uafhængig MDA-MB-231 human brystcancer xenograft i nøgne mus [21]. To vigtige strategier for IGF-1R-målrettet terapi (nemlig blokerende anti-IGF-1R-antistoffer og små molekyler inhibitorer af tyrosinkinasereceptorer) har været aktivt forfulgt i det seneste årti, hvilket resulterer i forskellige prækliniske og kliniske undersøgelser af forskellige cancere, som blev revideret med jævne mellemrum [22] – [36]. Desuden blev potentialet for dual hæmning af IGF-1 og IGF-2 med neutraliserende antistoffer viste for nylig [37].

De fleste mAb’er udviklet mod IGF-1R hidtil var designet til at skåne IR og inhiberer selektivt IGF-IR-medieret signalering ved at blokere IGF’er i at binde. De deler også en fælles ejendom inducere IGF-1R nedregulering via internalisering og nedbrydning [38], som uforvarende kan påvirke insulin signalering grund samtidig nedregulering af de hybride IGF-1R /IR-receptorer [39]. Som opsummeret i tabel S1 i den supplerende information

online

, disse mAb’er, ud over at være murine, humaniseret eller fuldt humant, afviger i strukturelle og funktionelle egenskaber, der omfatter isotype, epitop, potens til at inhibere den ene eller begge IGF’er, og affinitet for IGF-1R. Otte sådanne mAbs (AVE1642, BIIB022, cixutumumab, dalotuzumab, figitumumab, ganitumumab, R1507, og robatumumab) har været eller er i øjeblikket i kliniske forsøg i forskellige kombinationer. Ud fra følgende betragtninger objektive responser blev rapporteret fra nogle fase II forsøg, for eksempel i to undersøgelser [40], [41] viser klinisk fordel i ikke-småcellet-lungekræft (NSLCL) patienter behandlet med figitumumab, paclitaxel og carboplatin (FPC) , to efterfølgende fase III forsøg, der vurderer FPC og en kombination af figitumumab med erlotinib i uselekterede patienter med fremskreden NSCLC er blevet suspenderet i oktober 2009, på grund af manglende effekt og en større toksicitet end forventet fra tidlig-fase data [42]. På trods et væld af stærke prækliniske data som begrundelse for IGF-1R-målrettet kræftbehandling, de generelt skuffende kliniske resultater, som afsløret ved figitumumab, R1507 (klinisk udvikling ophængt i december 2009), og andre [43], har påpeget til en fremtidig retning, der vil fokusere på identifikation og validering af prædiktive biomarkører, samt undersøgelse af mere rationelle kombinationer med andre anticancer midler til at bekæmpe almindelige resistensmekanismer udviklet fra blokade af IGF-1R alene.

Multivalente antistoffer ofte øge styrken af ​​deres bivalente forældre, blandt andet som følge af højere binding aviditet til beslægtede antigener på målceller. Brug af Dock-og-Lock (DNL) platform [44], [45] for at generere en hexavalent antistof, betegnet Hex-HR1, fra dets bivalent forælder, HR1, en roman humaniseret antistof (IgG1,

kappa

), som målretter IGF-1R, men ikke IR, vi undersøgt muligheden for at sammenligne de forskellige biologiske aktiviteter udvist af Hex-HR1 og HR1 i forskellige cancercellelinjer samt deres in vivo-effektivitet i en xenograft model af human rhabdomyosarcom (RH -30) i nøgne mus, med eller uden tilsætning af rapamycin. Vi rapporterer her, at HR1 binder til en region i IGF-1R beliggende i midten af ​​første halvdel af den cysteinrige domæne (aa 185 -222), der adskiller sig fra epitoperne rapporteret for en række anti-IGF-1R mAb’er [46, 47, og tabel S1]. Den forskellighed af HR1 til disse anti-IGF-1R mAb’er i klinisk udvikling omfatter også sin manglende evne til at blokere bindingen af ​​enten IGF-1 eller IGF-2 og IGF-1R, og en spændende adfærd til at inducere phosphorylering af IGF-1R og nedstrøms signalering uden særlig stimulerende cellevækst. På den anden side, HR1 ligner andre anti-IGF-1R-antistoffer i dens evne til at nedregulere IGF-1R og inhibere proliferation, kolonidannelse, eller invasion af udvalgte cellelinier in vitro, samt til at forsinke væksten af ​​RH -30 xenograft i nøgne mus, når det kombineres med mTOR inhibitor, rapamycin. Hex-HR1 og HR1 er generelt sammenlignelige i deres bioaktiviteter under de undersøgte betingelser, selv Hex-HR1 faktisk viste en højere styrke end HR1 i nedregulering IGF-1R og inhibering af proliferation af visse responsive cancercellelinjer.

Materialer og Methods

cellelinier, antistoffer og reagenser

Alle cellelinier blev fremskaffet fra ATCC, medmindre RH-30, som blev opnået fra DSMZ. Humaniserede antistoffer, herunder HR1, hPAM4 (anti-mucin), HA20 (anti-CD20), hRS7 (anti-Trop-2), hLL2 (anti-CD22), og HMN-15 (anti-CEACAM6), blev tilvejebragt af Immunomedics . Rekombinant human IGF-1R (rhIGF-1 R), rekombinant human IGF-1, rekombinant human IGF-2, og muse-anti-human IGF-1R mAb (MAB391) blev opnået fra R fra Santa Cruz Biotechnology for 2C8, 1H7, 3B7, og C-20; fra Millipore for 24-57 og 24-31; og fra Invitrogen for 17-69, 24-60, og 1-2. Phospho-specifikke antistoffer og andre primære antistoffer blev erhvervet fra Cell Signaling eller Santa Cruz Biotechnology. Peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundært antistof og én løsning celleproliferationsassay (MTS) blev opnået fra Promega. FITC- eller TRITC-konjugerede sekundære antistoffer var fra Jackson ImmunoResearch Laboratories. PhosphoSafe Extraction Reagent og RIPA-buffer anvendes til cellelyse blev opnået fra EMD Biosciences og cellesignalering, hhv. Cellekulturmedier, kosttilskud, og bovin transferrin (holo form) blev købt fra Invitrogen. Rapamycin (Sigma-Aldrich) blev opløst i DMSO, alikvoteret og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse. Protein Assay Dye Reagent Concentrate var fra Bio-Rad. Alle andre kemikalier blev indkøbt fra Sigma.

Cell Culture

Ondartede cellelinier blev rutinemæssigt holdt ved 37

o C i 5% CO

2 i RPMI 1640 medium suppleret med 10 % varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), 1% GlutaMax i, 1% HEPES, 1% ikke-essentielle aminosyrer og 1% natriumpyruvat (benævnt 10% RPMI). For Capan-1, blev 20% FBS anvendes (20% RPMI). Dyrkningsmediet blev skiftet mindst en gang ugentligt og kun celler med færre end 50 passager blev brugt til eksperimenter.

Generation af R1

Tre BALB /c mus blev hver immuniseret intraperitonealt med 15 ug rhIGF-1R (Met1Asn932), som omfatter en blanding af både forarbejdede og uforarbejdede ekstracellulære domæne af human IGF-1R, i komplet Freunds adjuvans. Yderligere immuniseringer i ukomplet Freunds adjuvans blev gjort 14, 21, og 28 dage efter den indledende immunisering. Hybridomer blev frembragt ved fusionering af miltceller fra de immuniserede mus med P3 × 63Ag8.653 myelomceller. Et hybridom klon (C-11), hvis supernatant udviste bindingsaktivitet for IGF-1R men ikke IR, blev isoleret og udvidet i kulturer til opnåelse af muse antistof betegnet R1 eller MR1.

Generation of CR1

Chimerization af R1 til opnåelse CR1 blev udført som følger. V

H og V

K gener af R1 blev klonet af 5′-RACE. DNA-sekvenserne af de klonede V

H og V

K-gener blev bestemt med ægtheden bekræftes ved N-terminal proteinsekventering, der viste en eksakt match af de første 15 N-terminale aminosyrer med de tilsvarende aminosyrer udledes fra DNA-sekvenser (tabel S2). Det klonede V

H og V

K-gener blev indsat i

pdHL2

vektor til generering

cR1pdHL2

, som blev anvendt til at transficere SPE-26-celler, en variant ofSp2 /0-Ag14 udviklet internt. Transfektanter blev selekteret med 0,075 pM methotrexat (MTX), og screenet ved ELISA for humant Fc bindingsaktiviteter. Højere producerende kloner blev yderligere udvidet til opnåelse af de to bedste kloner (709.2D2 og 710.2G2), hvorfra CR1 blev produceret i batch-kulturer og oprenset ved protein A-kromatografi.

Generation of HR1

humanisering [48] af CR1 til HR1 blev opnået ved podning CDR’erne på de humane skeletregioner af HMN-14. For visse skeletpositioner blev murine rester af R1 bevaret, hvilket resulterer i aminosyresekvenserne af HR1 V

H (fig S1A) og HR1 V

K (fig S1B). Syntetiske gener, der koder HR1 V

H og HR1 Vk blev manipuleret ind

pdHL2

at opnå

hR1pdHL2

, ekspressionsvektoren for HR1. Efterfølgende bestræbelser på at sikre produktionen klon (711.3C11) for HR1 svarede til dem beskrevet ovenfor for CR1, bortset fra, at de positive kloner blev selekteret for binding aktiviteter til både human Fab og rhIGF-1R.

Generation Hex -hR1 af DNL

C

H1-DDD2-Fab-HR1 og C

H3-AD2-IgG-HR1 blev fremstillet som fusionsproteiner i SpESF celler [49] transficeret med de respektive vektorer som beskrevet for C

H1-DDD2-Fab-HA20 og C

H3-AD2-IgG-HA20 [50]. Hex-HR1 blev opnået som følger. C

H1-DDD2-Fab-HR1 blev blandet med C

H3-AD2-IgG-HR1 i phosphatbufret saltvand (PBS), pH 7,4, med 1 mM EDTA, ved et molært forhold på 4,2 til følge at konjugering af de fleste, om ikke alle, C

H3-AD2-IgG-HR1 til C

H1-DDD2-Fab-HR1, hvilket reducerer de potentielle co-oprensning af C

H3-AD2-IgG- HR1 med det endelige produkt ved protein A-søjlekromatografi. Den DNL Reaktionen blev initieret ved tilsætning af reduceret glutathion (GSH) til 1 mM, efterfulgt af tilsætning af oxideret glutathion (GSSH) til 2 mm på den næste dag, og efter en yderligere inkubation natten over blev Hex-HR1 oprenset fra den resulterende opløsning ved protein a-kromatografi.

Renhed, størrelse og masse Analyser

Størrelse-udelukkelse højtryksvæskekromatografi (SE-HPLC) blev udført på en Beckman System Gold Model 116 med en BioSep-SEC-S3000 kolonne (300 x 7,80 mm) af Phenomenex under anvendelse 0,04 M PBS (pH 6,8) plus 1 mM EDTA som den mobile fase for at bestemme den molekylære integritet og produktrenhed af mAb’er og HexAbs. De gennemsnitlige hydrodynamiske diametre på HR1 og Hex-HR1 blev bestemt ved dynamisk lysspredning (DLS) med en kontrakt til Microtrac. Elektrosprayionisering time of flight (ESI-TOF) væskekromatografi /massespektrometri (LC-MS) blev udført på en 1200-serie HPLC koblet med en 6210 TOF MS (Agilent Technologies). Kort fortalt blev HR1 eller Hex-HR1 reduceret med 50 mM tris (2-carboxyethyl) phosphin i 30 minutter og opløst ved omvendt fase HPLC (RP-HPLC) under anvendelse af en 20-min gradient af 30-80% acetonitril i 0,1% vandig myresyre med en Jupiter C4 5μ søjle (Phenomenex). På TOF MS blev de kapillære og fragmentor spændinger sat til 5500 og 250 V, henholdsvis.

Konkurrence Binding Studies

Homogene polystyren mikrokugle perler overtrukket med rhIGF-1R at tjene som surrogater for celler udtrykker IGF-1R blev anvendt i alle konkurrence bindingsundersøgelser. At sammenligne bindingsaffiniteten, varierende koncentrationer af umærket MR1, CR1, og HR1 blev blandet med en konstant mængde Alexa Fluor 532-mærket CR1 (532-CR1). De overtrukne perler blev tilsat til en endelig densitet på 2 × 10

5 partikler /ml, og blandingerne blev inkuberet ved stuetemperatur (RT) i 1 time under forsigtig vipning. Det bundne 532-CR1 blev bestemt ved måling gennemsnitlig fluorescensintensitet (MFI) på 2.000 perler på en Guava PCA System (Millipore).

For at bestemme om CR1 kan blokere bindingen af ​​IGF-1 eller IGF-2 til IGF-1R, forskellige koncentrationer (fra 0 til 670 nm) af CR1, IGF-1, eller IGF-2 blev blandet med en konstant mængde

125I-IGF-1 eller

125I-IGF-2. De overtrukne kugler blev derefter tilsat, inkuberet ved stuetemperatur i 1 time med forsigtig vuggende, vasket og talt for radioaktivitet.

For at sondere bindende region af HR1 på IGF-1R, et panel af kommercielt tilgængelige anti-IGF -1R mAb’er, med deres epitoper til IGF-1R kortlagt (undtagen MAB391), blev evalueret som konkurrenter til blokering HR1 fra binding til rhIGF-1R-belagte kugler. I disse eksperimenter R1, CR1, HR1, MAB391, 24-60, og αIR-3 blev hver mærket med R-phycoerythrin (PE) og inkuberet med et umærket antistof af interesse i varierende koncentrationer.

Binding til celleoverfladen IGF-1R

Hver prøve blev fremstillet in duplo til at indeholde 2 × 10

5-celler og 10 ug /ml af en test-antistof i et endeligt volumen på 200 pi. Efter inkubering ved 4 ° C i 45 minutter blev prøver vasket to gange med PBS-1% BSA, efterfulgt af tilsætning af FITC-GAH IgG, (H + L), og en yderligere inkubering ved 4 ° C i 45 minutter i mørk. Prøver blev derefter vasket to gange med PBS-1% BSA, resuspenderet i 500 pi PBS-pufret formalin og analyseret på FACScan.

celleproliferationsassay

Alle inkubationer af celler blev udført ved 37 ° C i en befugtet 5% CO

2 incubator. Celler blev løsnet med trypsin, vasket tre gange med PBS for at fjerne ethvert spor af serum og resuspenderet i et serumfrit medium indeholdende 10 ug /ml bovin transferrin (SFM-TRF). Celler blev podet ved 1,0 x 10

3 celler /50 pl /brønd og inkuberet natten over. Den følgende dag hver testartiklen i SFM-TRF var 5-fold seriefortyndet fra 400 nM til 0,001 nM og 50 pi af hver koncentration blev tilsat tredobbelt til brøndene, således at de endelige koncentrationer af testartiklen lå fra 200 nM til 0,0005 nm. Ubehandlede kontrolceller kun modtaget 50 pi SFM-TRF. Efter inkubation i 1 time, udpegede brønde modtog 100 pi af hver testartiklen ved den samme koncentration i SFM-TRF indeholdende 50 ng /ml IGF-1. Plader blev derefter inkuberet i et tidsrum som angivet, og antallet af levedygtige celler i hver brønd blev bestemt under anvendelse af MTS-assayet pr producentens protokol.

kolonidannelse Assay af celler dyrket i monolagskultur

DU 145-celler blev løsnet med trypsin og udpladet i 60 mm skåle (1 × 10

3 celler) i 10% RPMI suppleret med 1% penicillin /streptomycin (P /S). Testartikler blev tilsat, og medium indeholdende teststofferne blev udskiftet hver fjerde dag, Efter 14 dage blev cellerne fikseret i 4% paraformaldehyd og farvet med 5% Giemsa opløsning. Kolonier større end 50 celler blev optalt under et mikroskop. I et separat eksperiment blev testartikler ikke føjet til den efterfølgende medium.

kolonidannelse Assay af celler dyrket i blød agar

Basal agar (0,5%) blev fremstillet ved blanding af 1% agar ( ved 40 ° C) med et tilsvarende volumen af ​​2 x 10% RPMI og tilsat til hver brønd (0,5 ml) i en 24-brønds plade. Celler i 2 × 10% RPMI blev blandet med et tilsvarende volumen af ​​0,7% agarose og tilsat (0,5 ml) til toppen af ​​basen agar ved den endelige celletal på 1250 per brønd i 0,35% agarose. Celler blev fodret med 0,5 ml 10% RPMI tilsat til hver brønd ugentligt. Behandlede brønde indeholdt teststofferne i agarose /cellelaget i begyndelsen og i efterfølgende fodringer. Når kolonier var klart synlige ved mikroskopi i ubehandlede kontrolbrønde blev mediet fjernet, og kolonierne farvet med krystalviolet. Kolonier blev talt under et mikroskop og det gennemsnitlige antal blev bestemt ud fra fem forskellige synsfelter i brønden.

immunoblotanalyse

Medmindre andet er angivet, blev cellerne sultet i serum-frit medium i 24 h, behandlet, og lyseret ved iskold temperatur i en buffer som angivet. Proteinkoncentrationer blev bestemt ved Bio-Rad Protein Assay og prøver (15 til 30 ug indlæst i hver bane) blev adskilt på 4-20% Tris-glycin-geler, overført til PDVF eller nitrocellullose membraner, blokeret med TBST-buffer (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) indeholdende 5% fedtfri mælk, vasket med TBST-buffer og inkuberet natten over ved 4 ° C med primære antistoffer. Membranerne blev derefter vasket i TBST fire gange (én gang i 15 minutter og tre mere i 5 min hver), inkuberet med HRP-konjugerede sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur, vasket i TBST buffer fire gange, som beskrevet ovenfor, detekteres derefter med Super Signal West Dura Udvidet Varighed Substrat (Thermo Scientific) i henhold til anvisningerne fra producenten. Immunblottet signaler blev visualiseret med et chemiluminescens-system (Thermo Scientific). Digitale billeder blev behandlet af Carestream (Carestream Molecular Imaging).

nedregulering af IGF-IR

Celler i 10% RPMI blev podet ved 1 × 10

6 pr 100 mm skål og dyrket natten til fastgørelse. Den næste dag blev mediet udskiftet med frisk 10% RPMI indeholdende en testartiklen af ​​interesse ved angivne koncentrationer og celler blev yderligere inkuberet i 24 timer eller en forudbestemt tid. Til analyse ved Western blot, blev behandlede celler vasket med kold PBS, skrabet fra skålene, opsamlet og centrifugeret ved 4 ° C ved 2.000 rpm i 5 min. Celler pellets blev lyseret i 10 minutter på is i RIPA buffer eller en buffer bestående af 25 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton og 1 × Fuldstændig, EDTA-fri proteaseinhibitor (Roche Diagnostics ). Lysaterne blev klaret ved centrifugering, analyseret for proteinkoncentration, og analyseret ved immunblotting. Til analyse ved flowcytometri blev behandlede celler vasket i PBS to gange, inkuberet med PE-mærket 1H7 i 1 time, vasket to gange med PBS, resuspenderet i 500 pi PBS og analyseret på FACScan.

Phosphorylering af IGF -IR og Akt

Celler (5 x 10

5 per brønd) blev dyrket i 10% RPMI i 6-brønds plader natten over til fastgørelse. Efter to vaske med serum-frit medium, blev celler inkuberet i 4 timer i serumfrit medium og behandlet med teststofferne ved angivne koncentrationer for et bestemt tidsrum. Celler blev derefter stimuleret med IGF-I i 10 minutter, vasket med PBS, lyseret med 200 pi RIPA buffer i 5 minutter ved stuetemperatur, og forarbejdet til immunoblotanalyse.

Matrigel Invasion Assay

fabrikantens protokol på BD BioCoat ™ Matrigel ™ invasion Chamber (BD Biosciences) blev fulgt under anvendelse af 24-brønds format, som giver 12 skær, der hver indeholder en 8-um porestørrelse membran med et tyndt lag af MATRIGEL basalmembranmatrix. Før anvendelse blev den 24-brønd samling fjernet fra opbevaring ved -20 ° C og fik lov til at opvarme til RT. Det indre af indsatsene og bunden af ​​brøndene blev rehydreret med varmt (37 ° C) bicarbonatbaseret dyrkningsmedium i 2 timer, og forsigtigt fjernet. Celler (0,5 ml ved 5 × 10

4 /ml) i serumfrit medium blev anbragt i indsatsen (øvre kammer) og brønden (nedre kammer) blev fyldt med 0,5 ml 10% RPMI. Efter 2 timer blev teststofferne tilsat til cellerne i det øvre kammer og inkubationen fortsat i 20 timer, på hvilket tidspunkt cellerne, der forblev i Matrigel eller fastgjort til den øvre side af membranen blev fjernet med vatpind. Celler på den nedre side af membranen blev fikseret i methanol, farvet med enten Wright-Giemsa farve eller Hoechst 33258, og undersøgt under et fluorescerende mikroskop.

immunfluorescensmikroskopi

celler dyrket på dækglas vasket, fikseret med 4% formalin, vasket, inkuberet med primære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur, vasket med PBS, og omsat med FITC- eller TRITC-konjugerede sekundære antistoffer ved stuetemperatur i 40 min. Efter vask blev prøverne farvet med Hoechst 33258, monteret, og undersøges under et fluorescerende mikroskop.

In vivo Effektivitet

Kvindelige 8 uger gamle SCID-mus (Taconic Farms) blev anvendt. Hver mus blev injiceret s.c. med 5 × 10

6 RH-30 celler. Når tumorer nåede ca. 0,2 cm

3 i størrelse, blev dyrene delt i seks grupper af 10 mus hver injiceret i.p. to gange om ugen i fire uger med HR1 (1 mg), hex-HR1 (0,82 mg), rapamycin (5 mg /kg), HR1 (1 mg) plus rapamycin (5 mg /kg), hex-HR1 (0,82 mg) plus rapamycin (5 mg /kg), og saltvand (indeholdende 2% DMSO), hhv. En stamopløsning af rapamycin fremstilles i saltvand (indeholdende 2% DMSO) ved 1 mg /ml og 100 pi blev administreret til hver mus per injektion. Tumorer blev målt og mus vejet to gange ugentligt. Dyrene blev aflivet, når tumorer nåede 2 cm

3. En anden undersøgelse for at sammenligne virkningen af ​​HR1 og Hex-HR1 givet ved molære ækvivalente doser (0,33 mg vs. 0,82 mg) blev også udført. Protokoller for dyreforsøg blev godkendt af CMMI Institutional Animal Care og brug Udvalg.

Statistisk analyse

For in vitro-studier, den statistiske forskel mellem to populationer blev bestemt ved Students

t

-test. Statistisk analyse for data tumorvækst var baseret på arealet under kurven (AUC) og gennemsnitlig overlevelsestid anvendelse af en to-halet

t

-test til vurdering signifikans mellem alle de forskellige behandlingsgrupper og kontroller, undtagen saltvand kontrol, som en ensidet

t

-test blev anvendt. Overlevelse kurver blev analyseret af Kaplan-Meier plot (log-rank analyse), ved hjælp af Prism GraphPad softwarepakke (v4.03, Advanced Graphics Software, Inc.). En værdi på

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Bemærkelsesværdige egenskaber R1, CR1 og HR1

forældrenes R1 blev vist. til delvist at inhibere bindingen af ​​

125I-mærket IGF-1 (

125I-IGF-1) til den humane brystcancer-cellelinie MCF-7L (a sublinie af MCF7) sammenlignelig med MAB391 (tabel S3). Chimerization af R1 syntes at forbedre affiniteten af ​​R1 for rhIGF-1R immobiliseret på polystyrenperler som vist ved et kompetitivt assay, hvor bindingen af ​​R1 mærket med en fluorescerende probe (Alexa 532) blev målt ved flowcytometri ved tilstedeværelse af varierende koncentrationer af CR1 eller R1 (figur S2). Antistoffer produceret af to kloner af CR1 viste den samme affinitet på 0,1 nM (figur S3) og var specifikt for immobiliseret rhIGF-1R men ikke immobiliseret rhIR (fig S4). Men CR1 undladt at blokere bindingen af ​​IGF-1 eller IGF-2 til immobiliseret rhIGF-1R i vulsten assayet (fig S5), i modsætning til den tidligere observation, at dets murine modstykke kunne delvist inhibere bindingen af ​​

125I- IGF-1 til MCF-7L-celler. Vellykket humanisering blev påvist ved den ækvivalente styrke af HR1 og CR1 at konkurrere med 532-CR1 om binding til rhIGF-1R-immobiliserede perler (figur S6). På den anden side, perlen assay viste også HR1 var ineffektiv til at inhibere bindingen af ​​

125I-IGF-1 til den immobiliserede rhIGF-1R (fig S7). Baseret på resultaterne fra korset-blokerende eksperimenter (tabel 1 og 2), blev epitopen af ​​HR1 afledt til at opholde mellem aminosyreresterne 185 og 222 i midten af ​​første halvdel af den cysteinrige domæne. Interessant nok selv MAB391 havde nogen virkning på bindingen af ​​PE-mærket R1 til immobiliseret rhIGF-1R (fig S8A), R1 reduceret væsentligt bindingen af ​​PE-mærket MAB391 (fig S8B), hvilket antyder, at R1 kan inhibere bindingen af ​​MAB391 til immobiliseret rhIGF-1R allosterisk.

Molekylær karakterisering af HR1 og Hex-HR1

SE-HPLC og DLS profiler af HR1 og Hex-HR1, vist i fig. 1A og 1B, henholdsvis indikerer deres høje grad af homogenitet. For HR1 blev en enkelt top på 8.51 min observeret. Hex-HR1, der omfatter et par af stabiliserede dimerer af HR1 Fab vedlagt en fuld HR1 IgG ved carboxyl termini af de to tunge kæder, vises også kun en større top ved 7,43 minutter. De partikler af HR1 og Hex-HR1 var stort set monodisperse, med de gennemsnitlige hydrodynamiske diametre på 10,34 nm og 15,83 nm.

Som vist i tabel 3, massen af ​​hver af polypeptiderne omfatter HR1 og Hex-HR1 bestemt ved LC /MS stemte overens med den masse beregnet fra deres afledte aminosyresekvens og forudsagte posttranslationelle modifikationer, herunder N-bundet glycosylering og aminoterminale pyroglutamat på den tunge kæde af HR1 og Hex-HR1, og Fd-DDD2 kæde Hex-HR1. For både HR1 og Hex-HR1,

kappa

kæde, som ikke ændres, gav en næsten identisk masse observeret inden 20 ppm den forudsagte masse. For HR1, blev den tunge kæde påvises som flere isoformer, herunder carboxylterminale lysin varianter og forskellige glycoformer. For Hex-HR1, den AD2-fusionerede tunge kæde var intakt, med overvejende G0F og G1F glycoformer. The HR1-Fd-DDD2 komponent Hex-HR1 også lige så stor som den forudsagte masse inden 0,1 ppm, uden yderligere posttranslationelle modifikationer udover den aminoterminale pyroglutamat.

Ekspression af IGF 1R i Diverse kræftceller

Positiv binding af HR1 og Hex-HR1 blev demonstreret i MCF7 (brystkræft), DU 145 (prostatakræft), ME-180 (livmoderhalskræft) og RH-30 (rabdomyosarkom) ved flowcytometri (tabel 4). Baseret på den konstaterede median fluorescensintensitet (MFI), ekspressionsniveauerne af IGF-1R varierede blandt disse fire cellelinjer, med den relative forekomst af receptoren i RH-30 steg næsten 2-fold i DU 145 eller ME-180, og omkring 3 gange i MCF7. I lyset af antallet af overfladen IGF-1 RS per celle som rapporteret for RH-30 [51] og MCF7 [52] til at være 20.600 og 43.000, henholdsvis ville der være en 2,3 gange stigning i MCF7 sammenlignet med RH-30 , hvilket stemmer godt overens med 3 gange stigning estimeret ud fra MFI-data. 2C. Fig. Som vist i fig. Som vist i fig. Som vist i fig.