PLoS ONE: IL-6 Expression Regulerer Tumorigenicitet og korrelerer med Prognose i Blære Cancer

Abstrakt

Identifikation af potentielle tumormarkører vil hjælpe stratificere og identificere en tumor maligne potentiale og dens reaktion på specifikke behandlinger. IL-6 er blevet rapporteret at være en prædiktor i forskellige cancerformer. Derfor blev den foreliggende undersøgelse udført for at fremhæve den rolle af IL-6 i at forbedre behandling og bestemmelse prognose af blærecancer. De humane blære cancercellelinjer HT1376 og HT1197 blev udvalgt til celle- og dyreforsøg, hvori biologiske ændringer efter eksperimentel manipulation af IL-6 blev undersøgt, herunder tumor adfærd og signalering i blærekræft. Desuden blev kliniske prøver fra 85 patienter med muskel-invasiv og 50 med ikke-muskel invasiv blære kræft udvalgt til immunhistokemisk farvning for at evaluere den prædiktive kapacitet af IL-6 i forhold til det kliniske resultat. Dataene viste, at IL-6 blev overudtrykt i blærekræft prøver sammenlignet med ikke-maligne væv på både mRNA og protein niveauer. Positiv farvning af IL-6 var signifikant korreleret med højere kliniske stadium, højere recidivrate efter helbredende behandling, og reduceret overlevelse sats. Tumorvækst og invasiv kapacitet blev svækket, når IL-6 blev blokeret. De underliggende ændringer, der indregnes nedsat celleproliferation, mindre epitel-mesenkymale overgang (EMT), nedsat DNA methyltransferase 1-ekspression og svækket angiogenese. Som konklusion viste vores resultater, at IL-6 kunne være en betydelig prædiktor for klinisk fase og prognose af blærecancer. Desuden målrettet IL-6 kan være en lovende strategi til behandling af blærekræft

Henvisning:. Chen MF, Lin PY, Wu CF, Chen toilet, Wu CT (2013) IL-6 Expression Regulerer Tumorigenicitet og korrelerer med prognose i blærekræft. PLoS ONE 8 (4): e61901. doi: 10,1371 /journal.pone.0061901

Redaktør: Peter Canoll, Columbia University, USA

Modtaget: December 6, 2012; Accepteret: 14. marts 2013; Udgivet: 30 april, 2013 |

Copyright: © 2013 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan, giver CMRPG690332-3. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Urinary blærekræft repræsenterer et spektrum af neoplasmer, herunder ikke-muskel invasive (NMIBC), muskel invasive og metastatiske læsioner. Transitional cell carcinoma (TCC) i blæren er den mest almindelige form for blærekræft og manifesterer sig i to forskellige former med forskellige kliniske og biologiske adfærd. Ca. 70% af patienterne til stede med ikke-muskel invasive tumorer, mens de resterende 30% til stede med muskel-invasive tumorer. Trods god prognose for patienter med overfladiske sygdom, tilbagefald er almindelig og er forbundet med udvikling af muskel-invasiv sygdom [1]. Næsten halvdelen af ​​alle patienter med muskel-invasiv sygdom eller dem, der allerede har udviklet sig til denne tilstand havn okkult fjernmetastaser og har dårlig 5-års overlevelse [2]. I modsætning til andre urologiske kræftformer, blærekræft mangler klinisk nyttige biomarkører til at forudsige sygdom scenen og klinisk resultat. Derfor er molekylære markører, der kan anvendes til at lagdele og identificere en tumor sande malignt potentiale og dets reaktion på specifikke behandlinger kræves

Kronisk inflammation ofte forud for eller ledsager et betydeligt antal cancere [3] – [5]. . En stigning i inflammatoriske mediatorer er blevet vist at føre til tumorpromotion, invasion, og angiogenese [6] – [7]. Selvom den rolle, kronisk inflammation i ætiologien af ​​TCC af blæren ikke er veletableret, er der stigende tegn på, at proinflammatoriske cytokiner spiller kritiske roller i patogenesen af ​​blærecancer, såsom IL-6, IL-8 og TNF-α [8]. Endvidere blev ihærdigt STAT3-aktivering vist at opretholde konstitutiv NF-KB-aktivitet og tilvejebringer således bevis for relationen mellem onkologi signalveje i den inflammatoriske mikromiljø [9]. IL-6 er en væsentlig aktivator af STAT3 signalveje, og den vigtigste cytokin påvirker den inflammatoriske reaktion hos mennesker [10], [11]. IL-6-signalering har været impliceret i reguleringen af ​​tumorvækst og metastatisk spredning, og dens niveau kunne korreleret med dårlig prognose i forskellige kræftformer [11], [12]. Endvidere forøget IL-6 i serum blev rapporteret at være associeret med metastase og dårlig prognose af prostata, ovarie, og blære kræft [13] – [15]. Selv om der er beviser for, at IL-6 kan være en kritisk faktor i forskellige maligniteter, dens rolle i blærekræft fortsat uklar. Derfor, i den foreliggende undersøgelse har vi fokuseret på de underliggende mekanismer af IL-6 og dens mulige nytte for at afhjælpe behovet for aggressiv behandling for blærekræft.

Materialer og metoder

Patient karakteristika

Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital godkendt nærværende undersøgelse (Permit nummer: 99-0207B). De skriftlige samtykke blev underskrevet af patienterne for deres modellen og oplysninger, der skal lagres i hospitalet og anvendes til forskning. I alt 85 patienter med muskel-invasiv blære TCC (39 med stadie T2 og 46 med trin T3 -T4), der afsluttede et kursus af konkret kemostråleterapi (CCRT) behandling blev inkluderet i undersøgelsen. Ved afslutningen af ​​CCRT, patienter gennemgik en gentagelse computertomografi scanninger (CT) og cystoskopi undersøgelse for at fastslå respons på behandlingen. Patienterne blev observeret ved 3 måneders intervaller i de første 2 år og hver 6. måned derefter. Opfølgningen for patienter blev fortsat, indtil deres død, og endepunkterne var samlet overlevelse (OS), progressionsfri overlevelse, svigt mønster og respons på konkret CCRT. Sygdomsprogression blev defineret som dokumenteret lokalt recidiv eller fjernmetastaser. Analyser blev udført ved hjælp af SPSS-version 17.0.

immunhistokemisk (IHC) farvning

Ud over vævsprøver indsamlet fra de 85 patienter med muskel-invasiv blærekræft blev blære vævsprøver indsamlet til immunhistokemisk ( IHC) farvning fra 17 patienter med blærecarcinom med fjernmetastaser, 50 NMIBC patienter, og 40 ikke-malignitet patienter. Formalinfikserede, paraffinindlejrede væv opnået ved transuretral resektion i diagnosen blev skåret i 5 um snit, og monteret på objektglas til IHC-farvning. Til histologisk evaluering af IL-6-farvning, blev farvningen scoret uafhængigt af to observatører, som var blind for det kliniske resultat af patienter; uharmoniske scoringer blev gennemgået, og en blev opnået enighed. I den foreliggende undersøgelse blev et kriterium på over 10% positiv farvning af tumorceller anses for positivt på IHC scoring, som blev fastlagt receiver operating characteristic (ROC) kurve analyse.

Cellekultur og reagenser

HT137 og HT1197, humane blærecancer cellelinier blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). IL-6-neutraliserende antistof blev opnået fra R to prøver i hver bane). Primersekvenserne var som følger: (fremad og tilbage, henholdsvis) 5′-GTTCTTCCTCCTGGAGAATGTCA-3 ‘og 5′-GGGCCACGCCGTACTG-3′ for DNMT-1; 5’-TACATCCTCGACGGCATCTC-3 ‘og 5′-GCTACATTTGCCGAAGA- -gcc-3’ for IL-6. En β-actin primersæt blev anvendt som en loading kontrol. Den optimerede PCR blev udført på en iCycler iQ flerfarvet real-time PCR detection system. Væsentlige fluorescerende PCR signaler fra carcinoma væv blev normaliseret i forhold til middelværdien af ​​signaler fra ikke-maligne væv.

enzymmaerket assay (ELISA) for IL-6 niveauer

in vitro

og

in vivo

Urinprøver blev opnået fra 60 patienter med blære kræft (25 fra patienter med NMIBC, 35 fra dem med muskel-invasiv sygdom), og 20 prøver fra patienter uden tegn på malignitet. Prøve på 10 ml frisk urin blev opsamlet fra hvert individ, og derefter centrifugeret ved 3000 rpm i 5 minutter. På tidspunktet for analyse urin portioner blev optøet og urin IL-6 blev målt i supernatanterne. Kommercielt tilgængeligt ELISA-assay (HS human IL-6 immunoassay kit, R 0,05 taget at angive betydning. Betydningen af ​​forskellen mellem prøverne blev bestemt under anvendelse af Students t-test. Data er præsenteret som gennemsnit ± standardfejl af middelværdien (SEM). Tre gentagelser blev udført for at vurdere hvert eksperiment, og gentages hele sæt eksperimenter mindst to gange. En sandsynlighed på p 0,05 blev vedtaget hele til at bestemme statistisk signifikans medmindre andet er angivet

Resultater

IL-6 udtryk i patienter med blære kræft

Niveauet af IL. -6 i vævsprøver (seks parret kræft og tilstødende ikke-maligne vævsprøver) blev undersøgt ved hjælp af mRNA og protein-analyser. Som vist i figur 1A, blærecancer prøver udtrykt væsentligt højere niveau af IL-6 end ikke-maligne væv. IHC analyse for blære TCC (Fig. 1B og tabel 1) indikerede positiv farvning for IL-6 i 51% af T2 -T4 blærekræft væv [28% (11/39) i T2 vs. 70% (32/46) i T3 -T4;

P

= 0,0001]. Derudover, 65% (11/17) af de mere avancerede tumorer (patienter med spredte metastaser) viste positiv farvning for IL-6, men kun 17,5% (7/40) af ikke-maligne blære væv og 26% (13 /50) af den tidlige fase tumorer (CIS eller T1) udtrykte IL-6. Som vist i figur 1C, positiv farvning for IL-6 var signifikant korreleret med klinisk fase (T2 -T4 vs. T1 og CIS;

P

= 0,005). Desuden var urin niveauer af IL-6 undersøgt ved ELISA-analyse. De gennemsnitlige IL-6-niveauer i urinprøver fra patienter med NMIBC (81 ± 30,8 pg /ml) og T2 muskel-invasiv blærecancer (98 ± 24 pg /ml) var en smule højere end dem uden ondartet sygdom (25,14 ± 9,71 pg /ml), men forskellene var ikke statistisk signifikante (fig. 1D). Urinary IL-6-niveauer blev signifikant forhøjet hos patienter med T3 -T4 lokal-avanceret blære kræft (250 ± 27 pg /ml) sammenlignet med dem hos patienter med ≤T2 blærecancer eller ikke-malign sygdom (

P

= 0,01).

A. Niveauer af IL-6 blev undersøgt i seks prøver (parret cancer (C) og tilstødende ikke-malignt væv (N), to prøver i en lane) ved RT-PCR og Western blotting-analyse. For real-time RT-PCR-analyse, y-aksen viser forholdet mellem IL-6 i cancervæv divideret med den i ikke-maligne prøve. Kolonner, gennemsnit af tre separate forsøg; Barer, standardafvigelse (SD); *,

P

0,05. B. immunhistokemisk farvning af humane blærecancer prøver med anti-IL-6-antistof. Repræsentative lysbilleder vises. C. IHC data viste, at IL-6-niveauer var signifikant korreleret med kliniske stadium. D. Urinary IL-6 niveauer af patienter blev undersøgt ved ELISA-analyse. Kolonner, gennemsnit af tre separate forsøg; Barer, SD; *,

P

0,05. (NT, patienter med ikke-maligne sygdomme).

Rolle af IL-6 i tumorvækst og invasion

For at undersøge om IL-6 spiller en rolle i den aggressiv adfærd blærecancer, HT1197 og HT1376-celler blev transficeret med IL-6-GFP silencing vektor. Som vist i figur 2A, IL-6 silencing vektor signifikant reduceret IL-6-ekspression i begge cellelinier. Som bestemt ved levedygtige celletal over seks dage (Fig.2B), IL-6 silencing vektor betydeligt svækkede proliferationshastigheden af ​​HT1197 og HT1376-celler. Under anvendelse xenotransplantattumorer model, inhibering af IL-6 resulterede i langsommere tumorvækst

in vivo

(fig. 2C). Dataene viser, at IL-6-silencing vektor inhiberede væksthastigheden af ​​blære cancerceller væsentligt. Derudover IL-6 silencing vektor betydeligt svækkede den invasive kapacitet blære cancerceller som påvist under anvendelse af migration scratch assays [16] og invasion assay

in vitro

(fig. 3A, fig. S1). En ortotopisk tumor implantation teknik blev anvendt til at undersøge virkningerne af IL-6 lyddæmpning vektor på invasive kapacitet

in vivo

(fig. 3B). Seksten mus modtog intravesikulær inddrypning af hver blærecancer-cellelinie. Efter 28 dage, 13 mus (81%) indpodet med HT1197-celler, fire (25%) indpodet med HT1197 celler plus IL-6 silencing vektor, 11 (69%) med HT1376-celler og to (13%) med HT1376 celler plus IL-6 silencing vektor udviklet intravesikulær tumorer. Dataene viste, at IL-6 lyddæmpning vektor faldt invasive kapacitet

in vivo

.

A. Virkninger af IL-6-GFP silencing vektor på IL-6-niveau i HT1197 og HT1376-celler som påvist ved immunofluorescens-analyse. Repræsentative mikrografer er vist, med de respektive immunfluorescerende farver (DAPI, blue, GFP, grønt, IL-6, rød). IL-6-niveauer blev signifikant reduceret af IL-6-GFP silencing vektor sammenlignet med kontrollen-GFP-vektoren. B. Virkninger af IL-6 lyddæmpning vektor på han spredning satser HT1197 og HT1376 cancerceller. Det samme antal celler (10

4) blev udpladet i hver plade på dag 0 og lades vokse i deres respektive kulturer. Vi tælles antallet af levedygtige celler efter inkubation i 2, 4 og 6 dage. Y-aksen repræsenterer antallet af levedygtige celler. Point, gennemsnit af tre separate forsøg. Barer, SD. *,

P

0,05. C. Virkninger af IL-6-inhibering på xenograft tumorvækst. Hvert punkt repræsenterer middelværdien af ​​tre separate forsøg; barer, SD; *,

P

0,05. Ekspression af IL-6 blev også vurderet ved immunkemisk farvning af xenotransplantater. Repræsentative dias vises på × 400 forstørrelse.

A. Den invasive kapacitet blære cancerceller med eller uden IL-6 silencing vektor blev evalueret ved migration scratch assays. Resultaterne fra repræsentative lysbilleder vises. Kolonne, gennemsnit af tre separate forsøg. Barer, SD. *,

P

0,05. B. invasive kapacitet blære cancerceller med eller uden IL-6 silencing vektor blev evalueret ved murin ortotopisk tumorimplantation. De repræsentative dias og kvantitative data vises. Y-aksen repræsenterer forholdet af mus frembyder intravesikulær tumorer, normaliseret til de modtagne ortotopisk tumorimplantation. IL-6-silencing vektor faldt hastigheden af ​​tumorimplantation i blæren og er forbundet med en mindre tumorstørrelse. Kolonne, gennemsnit af tre separate forsøg. Barer, SD. *,

P

0,05. (CV, celler transficeret med kontrolvektoren, IL-6 SV, celler transficeret med IL-6 silencing vektor). C. Ændring i E-cadherin i celler blev vurderet og er vist de repræsentative mikrografier, med de respektive immunfluorescerende farver (DAPI, blue, GFP, grønt, E-cadherin, rød). D. Ændring i EMT-associerede proteiner i transfektanter blev evalueret ved Western blotting-analyse (CV, celler transficeret med kontrolvektoren, IL-6 SV, celler transficeret med IL-6 silencing vektor). E. Ændring i EMT-associerede proteiner i celler behandlet med JAK inhibitor- AG490.

Rolle af IL-6 i EMT ændrer

EMT er en central begivenhed i invasiv [17] og vi undersøgt, om dette er den mekanisme, der ligger den aggressive opførsel af IL-6-positive blærecancer. Som vist i figur 3C-D, IL-6 silencing vektor forøget ekspression af E-cadherin forbundet med fald i vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) og matrix metallopeptidase 9 (MMP-9) udtryk i tumorceller [18]. Det er blevet rapporteret, at IL-6 er en væsentlig aktivator af STAT3 signalering, og aktiveringen af ​​STAT3 signalering spiller en rolle i induktionen af ​​aggressive tumor adfærd og EMT ændringer i cancer [19]. Når vi blokeret STAT3-aktivering med JAK-inhibitor-AG490 blev EMT-relaterede proteiner faldt (fig. 3E). Disse observationer antydede, at de forøgede aggressiv tumor adfærd og EMT ændringer induceret af IL-6 kan være medieret af STAT3-aktivering, en del i det mindste.

Virkninger af IL-6 på angiogenese

ELISA-data afslørede, at IL-6 silencing vektor klart svækket IL-6-sekretion i cellekultursupernatanter og serum fra mus efter 28 dages tumorimplantation (fig. 4A). CD31-medieret endotheliale celle-celle-interaktioner er involveret i angiogenese [20]. Figur 4B viser, at IL-6 silencing vektor svækket angiogenese demonstreret ved farvning af CD31 og VEGF. For yderligere undersøgt, om cirkulerende IL-6 letter induktionen af ​​angiogenese, en intraperitoneal injektion af IL-6 (60 eller 100 ng pr mus, 3 gange om ugen) blev påbegyndt en dag før tumorimplantation. Som vist i figur 4C, IL-6 udløst angiogenese og endotelrør-dannelse i tumoren ved farvningen af ​​VEGF, MMP-9 og CD31 i mus, der bærer tumorer i 2 uger. Derfor kan induktion af angiogenese være en af ​​de mekanismer, der er ansvarlige for tumorpromotion af IL-6.

A. Niveauet af IL-6 i cellekultursupernatanter og serum fra mus, der bærer tumorer, med eller uden IL-6 silencing vektor blev undersøgt ved ELISA

in vitro

in vivo

. Kolonne, gennemsnit af tre separate forsøg. Barer, SD. *,

P

0,05. B. Ændringer i vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) og matrix metallopeptidase 9 (MMP-9), og CD31 i tumorxenotransplantater blev evalueret ved immunhistokemisk farvning. Resultaterne fra repræsentative lysbilleder vises. C. Virkning af IL-6 på xenograft tumorvækst og induktion af angiogenese bedømtes i mus med tumorer i 2 uger. Tumorceller blev injiceret subkutant i mus med eller uden IL-6 injektion som angivet i Materialer og Metoder, og tumorvækst undersøgt 2 uger senere. Immunhistokemi hjælp MMP-9, CD31, og VEGF stained- repræsentative slides blev påvist.

Forholdet mellem ekspressionen af ​​IL-6 og DNMT1 i blærekræft

Som vi rapporterede tidligere [21 ], blev højere DNMT1 niveauer forbundet med aggressive tumor adfærd og EMT ændringer i blære kræftformer. Vi fandt der var en signifikant korrelation mellem positiv farvning for IL-6 og DNMT1 om IHC-farvning af blærekræft prøver (fig. 5A). Af mRNA og protein analyse, nedsat IL-6 resulterede i inhiberet DNMT1 forbundet med svækket STAT3 og Akt aktivering (fig. 5B-C). Vi undersøgte yderligere, om IL-6-inhibering faldt DNMT1 ekspression via hæmning af AKT under anvendelse af et PI3K-inhibitor-LY294002 [22], eller nedregulering af STAT3 med STAT3 lille interfererende RNA (siRNA). Som vist i figur 5D, hæmning af Akt phosphorylering, men ikke faldet p-STAT3, betydeligt svækket DNMT1 ekspression. Det foreslås derfor, at aktivering af AKT kan være ansvarlig for den øgede DNMT1 i IL-6-positive blære kræft.

A. IL-6-niveau var positivt korreleret med DNMT1 udtryk i humane blærekræft prøver (

P

0,0001). Repræsentative lysbilleder af en udvalgt tumorprøve positivt farvning for både IL-6 og DNMT1, og en anden tumorprøve negative for både IL-6 og DNMT1 er vist ved × 400 forstørrelse. B. Virkning af IL-6 på niveauet for DNMT1, p-AKT, og p-STAT3 blev undersøgt ved Western blotting (CV, celler transficeret med kontrolvektoren, IL-6 SV, celler transficeret med IL-6 silencing vektor ). C. Virkning af IL-6 på niveauet for DNMT1 og p-AKT blev vurderet ved immunohistokemisk farvning, og resultaterne fra repræsentative lysbilleder vises. D. Virkning af IL-6-inhibering af IL-6-neutraliserende antistof, p-AKT inhibering med PI3K-inhibitor, og p-STAT3 inhibering med STAT3 siRNA på niveauet af DNMT1 blev undersøgt ved Western blotting (W, vildtype; IL -6

-, celler behandlet med IL-6-neutraliserende Ab; STAT3

-, celler behandlet med Stat3 siRNA,. PI3K-I, celler behandlet med PI3K-hæmmer

IL 6 er relateret til klinisk udfald af blære TCC

Den mediane progressionsfri overlevelse tid i de 85 patienter fuldførte konkret CCRT behandling var 36.97 måned. Ved univariat analyse, positiv farvning for IL-6 var signifikant relateret til højere klinisk fase, højere sygdom fejlrate efter konkret behandling og kortere overlevelsestid (tabel 1 og figur 6). resultaterne kraftigt understrege bidrag af IL-6 til prognosen hos blærekræft.

A overlevelse forskel blev påvist i overensstemmelse med positiv farvning af IL-6. De Kaplan-Meier samlede overlevelseskurver viste, at patienter med højere niveauer af IL-6-ekspression havde kortere overlevelse perioder.

diskussion

Vi demonstrerede at IL-6 blev udtrykt ved højere niveauer i blæren TCC end i ikke-maligne væv. Endvidere blev positiv farvning for IL-6 fortrinsvis forbundet med muskel-invasiv blære TCC forhold til lavere stadie Ta-T1 sygdom. Urinary niveauer af IL-6 blev også signifikant forhøjet hos patienter med lokalt fremskreden blære TCC sammenlignet med patienter med NMIBC. Derfor kan IL-6-ekspression være relateret til en mere ondartet fænotype.

For at undersøge om IL-6 var ansvarlig for den aggressive adfærd blære TCC, IL-6 blev undertrykt i blære cancerceller ved stabil transfektion med en silencing vektor. Data, afslørede, at hæmme IL-6 resulterede i nedsat blære tumorvækst

in vitro

in vivo

. Desuden IL-6 silencing vektor betydeligt svækkede den invasive evne detekteret i cellulære invasion assays og mus ortotopisk modeller. IL-6 er en væsentlig aktivator af JAK /STAT3 signalering [10], [11], og aktiveret STAT3 signalering er blevet rapporteret at bidrage til onkogenese ved at fremme proliferation og EMT [18], [23]. Desuden har STAT3-aktivering påvist en rolle i disponerende urothelial basale celler mod CIS progression vej ind invasiv blærekræft [24]. Vores data viste, at inhibering af IL-6 svækket STAT3-aktivering i forbindelse med øget E-cadherin og nedsat VEGF og MMP-9 udtryk. Øgede udtryk for VEGF og MMP-9 er rapporteret at korrelere med EMT forandringer og dårlig prognose for blærekræft [25], [26]. Det er derfor sandsynligt, at STAT3-aktivering spiller en rolle i IL-6 transmitterende downstream mål, der regulerer EMT og invasionsevne.

Vi viste, at IL-6-niveauer i serum og urin var forhøjet i en undergruppe af patienter med muskel-invasiv blærekræft, i overensstemmelse med anden forskning [13], [27]. Angiogenese er en af ​​de mekanismer, der fremmer tumorprogression, og ekspressionen af ​​angiogene faktorer foreslås at have prædiktiv værdi for behandlingsrespons og resultater hos patienter med cancer [28]. Desuden har IL-6 blevet beskrevet at spille flere funktioner i angiogenese og vaskulær modellering [29] og øge angiogenese ved transkriptionel af VEGF og MMP-9 i STAT3-afhængig måde. STAT3-aktivering blev påvist at modulere ekspressionen af ​​gener, der medierer angiogenese;

e

.

g

., VEGF [30]. Derfor forbindelserne mellem IL-6, blev angiogenese, og fremme af blærekræft i tumor-bærende mus yderligere undersøgt i nærværende undersøgelse. Ved hjælp af en xenotransplantat tumormodel, demonstrerede vores data, at IL-6-niveau positivt forbundet med angiogenese og STAT3-aktivering. Disse resultater viste, at induktionen af ​​angiogenese medieret af STAT3-aktivering kan være en af ​​de mekanismer, der ligger til grund aggressivitet IL-6-positive blærecancer.

Vi har tidligere rapporteret [21], at DNMT1 kunne være en signifikant klinisk prædiktor for blærekræft. Studier har identificeret at DNMT1 ekspression kan ændres direkte af pro-inflammatoriske cytokiner, såsom IL-6 i nogle typer af maligniteter [5], [31], [32]. En positiv korrelation mellem IL-6-positive prøver og nuklear farvning for DNMT1 blev fundet ved IHC-analyse i den foreliggende undersøgelse. Forholdet mellem IL-6 /STAT3 signalering og DNMT1 i blærekræft blev yderligere undersøgt for at se, om regulering af IL-6 /STAT3 signalering resulterer i ændringer af DNMT1 udtryk. MRNA’et og protein analyse afslørede, at inhiberede IL-6-signalering undertrykt nuklear DNMT1 ekspression forbundet med nedsat p-AKT og p-STAT3. Men direkte at hæmme STAT3 af STAT3 siRNA ikke havde nogen indlysende effekt på DNMT1 udtryk. Phosphorylering af Akt-kinase er blevet rapporteret at være den mekanisme, der er ansvarlig for forøget ekspression af DNMT1 stimuleret af IL-6 [33], [34]. Når vi blokerede phosphoinositid 3 kinase /Akt signalering ved hjælp af den specifikke inhibitor LY294002 blev dæmpningen af ​​AKT aktivering forbundet med nedsat DNMT1. Vi foreslår derfor, at aktiverede IL-6-signalering forbedret aktivering af DNMT1 medieres af aktivering af Akt i blæren TCC.

Identifikation af potentielle faktorer har store konsekvenser for udviklingen og udvælgelsen af ​​molekylære mål i behandlingen af ​​kræft. Vores eksperimentelle data viste, at niveauet af IL-6 er vigtig for den aggressive tumor adfærd set i blærekræft. Derfor vi yderligere undersøgt forudsigelseskraft af IL-6 vedrørende det kliniske resultat af blære TCC efter konkret CCRT. Vores data viser, at forøget ekspression af IL-6 var signifikant associeret med en lavere samlede responsrate efter behandling, en højere sygdom fejlrate og en kortere overlevelse periode, hvilket viser en rolle af IL-6 til at forudsige prognose. De opnåede fra denne undersøgelse afslørede, at forøget IL-6-produktion er kritisk i tumor aggressivitet og prognose af blærecancer. Vi skitserede de vigtigste signalveje, der menes at linke IL-6 til blærekræft (fig. 7).

Udover IL-6, blev adskillige cytokiner rapporteret at være vigtige ved undersøgelser af blæren kræft. TNF-α viste sig at stimulere blære cancerceller til at producere MMP-9, som har været impliceret i tumor invaαsion og metastase [35]. Mian et. al. rapporterede, at IL-8 blokade inhiberede signifikant udtrykkene for MMP-2 og MMP-9, hvilket resulterer i faldende invasion [36]. Desuden er forøget ekspression af IL-8 korreleret med dårlig prognose for blærekræft [37]. Inflammation kan betragtes som muligt for sit bidrag til erhvervelse af centrale kendetegnende kapaciteter. De biologiske mekanismer, der forbinder tumor aggressivitet i IL-6, er IL-8 og TNF-α ikke klart forstået. Spørgsmålet behov for yderligere undersøgelser i fremtiden.

Vores undersøgelse har nogle begrænsninger. Først, vi efterfølgende undersøgt den prædiktive værdi af IL-6 i blærecancerpatienter kun af den del af positiv farvning. Også, det er en retrospektiv analyse af en population med forskellige kliniske stadier fra en enkelt institution. Derfor er der behov for yderligere undersøgelser af niveauerne af IL-6 i patienter med forskellige stadier i et prospektivt studie.

Tilsammen vores resultater tyder på, at IL-6 er afgørende for aggressiv tumor vækst, og det kliniske resultat af blærekræft efter konkret strålebehandling. Dataene understøtter spirende hypotese, at IL-6 er en klinisk signifikant prognostisk prædiktor og kan repræsentere en passende mål for blærekræft behandling.

Støtte Information

Figur S1.

IL-6-inhibering svækkede invasionen kapacitet. Den invasive kapacitet i blære cancerceller med eller uden IL-6 silencing vektor blev evalueret. Resultaterne er vist ved repræsentative dias og kvantitative data. Kvantificering af invasion evne blev tælling af antallet af invaderende celler for hver tilstand. Y-aksen repræsenterer forholdet normaliseret ved værdien af ​​den respektive cellelinje under kontrol betingelse. Kolonne, gennemsnit af tre separate forsøg; Bar, SD.