PLoS ONE: Huaier vandigt ekstrakt Hæmmer kræft i æggestokkene Cell motilitet via AKT /GSK3p /β-Catenin Pathway

Abstrakt

Traditionel kinesisk medicin har vundet popularitet på grund af sin evne til at dræbe tumorceller. For nylig er de apoptotiske og antiangiogene virkninger af Trametes robiniophila Murr (Huaier) blevet undersøgt. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge dens virkning på cellen mobilitet og tumorvækst i ovariecancer. Cellernes levedygtighed og motilitet blev målt ved hjælp af SRB, scratch og migration assays. Celle apoptose blev analyseret ved annexin V /PI-farvning. Ved hjælp af en omvendt-fase-protein array (RPPA) assay analyserede vi niveauerne af 153 proteiner og /eller phosphoryleringer i Huaier-behandlede og ubehandlede celler. Huaier hæmmede cellelevedygtighed og induceret både tidlig og sen apoptose i SKOV3, SKOV3.ip1 og Hey celler i en tids- og dosisafhængig måde. Celle invasionsevne og migration blev også undertrykt signifikant. De RPPA Resultaterne viste signifikante forskelle (på mindst 30%, p 0,05) i niveauerne af 7 molekyler i SKOV3-celler og 10 i SKOV3.ip1 celler mellem de ubehandlede og behandlede celler. De fleste af de identificerede molekyler spiller en rolle i celleproliferation, apoptose eller celleadhæsion /invasion. Western blot-analyse yderligere valideret, at Huaier behandling resulterede i nedsat AKT phosphorylering, forøget ekspression af samlet GSK3p, inhibering af phosphorylering af GSK3p på S9, reduktion af både cytoplasmatisk β-catenin-ekspression og nuklear β-catenin translokation, og transkriptionel repression af flere Wnt /β-catenin target gener (

DIXDC1, LRP6, WNT5A

, og cyklin D1). Efter banker ned GSK3p, kan β-catenin-ekspression ikke hæmmes af Huaier. Endelig Huaier hæmmede væksten af ​​ovariale tumorxenotransplantater in vivo. Disse undersøgelser viser, at Huaier hæmmer tumorceller mobilitet i kræft i æggestokkene via AKT /GSK3p /β-catenin signalvej

Henvisning:. Yan X, Lyu T, Jia N, Yu Y, Hua K, Feng W ( 2013) Huaier vandigt ekstrakt Hæmmer kræft i æggestokkene Cell motilitet via AKT /GSK3p /β-Catenin Pathway. PLoS ONE 8 (5): e63731. doi: 10,1371 /journal.pone.0063731

Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA

Modtaget: 9. oktober, 2012; Accepteret: April 5, 2013; Udgivet: 8. maj 2013 |

Copyright: © 2013 Yan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af National Natural Science Foundation of China, tildele nummer 30973185 (https://www.nsfc.gov.cn). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

epitelovariecancer er en førende dødsårsag fra gynækologisk cancer i USA og den femte mest almindelige dødsårsag kræft hos kvinder [1]. Forekomsten af ​​kræft i æggestokkene stiger med alderen. Halvfjerds procent af patienter til stede med fremskreden sygdom, og mindre end fyrre procent kunne helbredes. Den samlede overlevelse af fremskreden kræft i æggestokkene har ikke vist sig lovende, selv efter kirurgi kombineret med nye adjuvans strategier, såsom højdosis kemoterapi med perifert blod stamcelletransplantation, dosis-tætte ugentlig paclitaxel med carboplatin, og målrettet behandling med carboplatin /paclitaxel. For nylig, resultater fra et randomiseret fase III studie (GOG 0208) viste, at brugen af ​​bevacizumab (et endotelvækstfaktorreceptor antistof) under og op til 10 måneder efter carboplatin og paclitaxel kemoterapi forlænger den mediane progressionsfri overlevelse med ca. 4 måneder i patienter med fremskreden epitelial ovariecancer [2]. Men den samlede overlevelse ligner konventionel terapi trods den høje udgift. Fordi ingen af ​​disse strategier helt kan beskytte æggestokkene kræftpatienter fra tilbagefald og metastaser, er et presserende behov for nye lægemidler.

Blandt komplementære behandlingsformer, er traditionel kinesisk medicin (TCM) vundet popularitet for sin evne til at dræbe tumorceller med mindre skade på normale celler. Desuden TCM urte behandling er relativt billig og er blevet rapporteret at øge kemoterapi virkningsfuldhed, reducere toksiciteten, forlænge overlevelsestiden og forbedre livskvaliteten og immunfunktioner [3]. Trametes robiniophila Murr (Huaier) er en type svamp fra Kina, der er blevet anvendt i TCM i ca. 1600 år. Men dens antitumorvirkninger og mekanismer kun blevet undersøgt i de senere år. De effektive bestanddele blev ekstraheret og analyseret ved højtydende flydende chromatophy (HPLC) og natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) analyser, som identificerede proteoglycaner som hovedkomponenterne i den Huaier ekstrakt, som bestod af 41,53% polysaccharider, 12,93 % aminosyrer og 8,72% vand [4], [5]. Det stof, som er blevet godkendt af den kinesiske Food and Drug Administration (FDA), har været anvendt i hepatocellulære kræftpatienter. In vitro viste eksperimenter, Huaier kan inhibere væksten af ​​leverkarcinom celler (HepG2, MHCC97H), human lunge-adenocarcinom-celler (A549) og humane brystcancerceller (MCF-7, MDA-MB-231) ved at inducere apoptose [6] – [8]. For nylig, Wang et al. rapporterede, at Huaier ekstrakt kan tjene som en potent anti-angiogenetisk og antitumormiddel [9]. Men hvorvidt Huaier påvirker biologiske adfærd ovarieceller er ikke blevet udforsket,. I denne undersøgelse ud over sine anti-proliferative og apoptotiske virkninger, den hidtil ukendte mulighed, at Huaier udøver en anti-invasiv virkning i ovariecancerceller via AKT /GSK3p /β-catenin-signalvejen blev undersøgt.

Materialer og metoder

Antistoffer og reagenser

RPMI-1640 medium blev købt fra Jinuo Co., Ltd (Shanghai, Kina). Føtalt bovint serum (FBS) blev leveret af Gibco-BRL (Rockville, IN, USA). Antistoffer mod AKT (1:1000), Pakt-Thr308 (1:1000), PS6-S235 (1:1000), PS6-S240 (1:1000), cyclin D1 (1:2000), cyclin A (1:2000 ), E-cadherin (1:1000), glycogensyntasekinase 3 beta (GSK3p, 1:1000), GSK3p phospho S9 (1:500, Epitomics, CA, USA.) og β-catenin (1:1000) blev erhvervet fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Den anti-histon H1 (1:300) og anti-muse og anti-kanin IgG peberrodsperoxidase (HRP) (1:5000) antistoffer blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Anti-GAPDH (1:3000) og anti-β-actin (1:3000) blev købt fra Biyuntian Biotech Co., Ltd (Shanghai, Kina). Alle andre kemikalier blev købt fra Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA) og Biyuntian Biotech Co Ltd

Udarbejdelse af Huaier vandigt ekstrakt

latværge salve af Huaier var en gave fra Gaitianli medicin Co Ltd (Jiangsu, Kina). Fremgangsmåderne forberedelse til Huaier ekstrakt og dets bestanddele er blevet beskrevet andetsteds [4], [5] I alt 2 g af latværge salve blev opløst i 50 ml komplet medium og steriliseret med en 0,22 um filter til opnåelse af 40 mg /ml stamopløsning, der blev opbevaret ved -20 ° C.

Cellekultur

De tre typer af ovarieepitelceller cancercellelinier blev anvendt i denne undersøgelse. SKOV3 og Hey celler blev opnået fra American Type Culture Collection. SKOV3.ip1 celler gaver fra University of Texas MD Anderson Cancer Center (Houston, TX) [10]. Cellelinier blev rutinemæssigt opretholdt i RPMI-1640 medium indeholdende 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 5% CO

2.

Celleproliferationsassay

væksthæmmende effekt af Huaier blev bestemt under anvendelse af et sulforhodamin B (SRB) assay. Kort fortalt SKOV3-celler (2,5 x 10

3), SKOV3.ip1 celler (2 x 10

3) og Hey celler (1,5 x 10

3) blev podet i plader med 96 brønde og behandlet med Huaier vandige ekstrakt ved forskellige koncentrationer. På de angivne tidspunkter, blev cellerne vasket, fikseret med 30% (vægt /volumen) trichloreddikesyre og farvet i 30 minutter ved stuetemperatur med 0,4% sulforhodamin B (SRB) i 1% eddikesyre. Farvestoffet blev vasket af med 1% (vol /vol) eddikesyre og derefter opløst i en 10 mM Tris-base opløsning. Pladerne blev aflæst med en mikropladelæser (Bio-Rad) ved 570 nm. Hvert forsøg blev udført i tre eksemplarer og gentages mindst tre gange

Annexin V /PI farvning

The Dead Cell Apoptose Kit med Annexin V Alexa Fluor® 488 Propidiumiodid (PI) (Invitrogen, CA, USA) blev anvendt til at undersøge om behandling med Huaier inducerede de SKOV3-celler, SKOV3.ip1 celler og Hey celler til at undergå apoptose. Cellerne blev fluorescens-mærket følge instruktionerne fra producenten. Kort fortalt blev dyrkede SKOV3 celler (2 x 10

5), SKOV3.ip1 (2 × 10

5) celler og Hey celler (5 x 10

3) i en 35 mm skål blev behandlet med forskellige koncentrationer af Huaier i 48 timer. Cellerne blev høstet og resuspenderet ved 1 x 10

6 celler /ml i bindingsbuffer. Derefter, grønt fluorescerende farvestof (AlexaFluor® 488) -konjugeret annexin V og PI blev tilsat og inkuberet i mørke i 15 minutter ved stuetemperatur. Prøverne blev analyseret under anvendelse af et FACScan flowcytometer (Beckman) udstyret med CellQuest software. Procentdelen af ​​apoptotiske celler blev beregnet ud fra procentdelen af ​​celler i nederste højre (LR) kvadrant af punktdiagram, som repræsenterer antallet af tidlige apoptotiske celler (annexin V + /PI-) divideret med det totale antal celler. Hvert eksperiment blev gentaget mindst tre gange.

In vitro ridse assay

Et in vitro scratch-assay blev udført for at vurdere, hvordan cellemigrering var påvirket af administration af Huaier vandige ekstrakt. I alt 2 × 10

4-celler blev podet i en 24-brønds plade. Referencepunkter i nærheden af ​​”bunden” blev markeret for at sikre, at anvendelsen af ​​det samme område for erhvervelse billedet. Efter en 24-timers inkubationsperioden blev sammenflydende monolag af den SKOV3, SKOV3.ip1 og Hey celler ridset under anvendelse af en 200 pi pipettespids for at skabe en lige “bunden”. Efter vask 2 gange med PBS, serum-frit medium indeholdende Huaier ekstrakt (5 mg /ml) blev tilsat til hver brønd. Den ridse bredde blev målt til fire foruddefinerede placeringer i starten og ved 12 og 24 timer efter bunden i SKOV3 og SKOV3.ip1 celler. Og bunden bredde blev målt i Hey celler ved start og efter 6 og 12 timer efter bunden. Afstandene mellem de 2 kanter af bunden blev målt ved referencepunkterne og analyseret statistisk

Matrigel invasion analyser

Transwell-systemet (24-brønd indsats;. Porestørrelse, 8 um; Corning Costar, Lowell, MA, USA) blev anvendt til at undersøge effekten af ​​Huaier vandige ekstrakt på invasivitet af SKOV3, SKOV3.ip1 og Heycells. Indsatsene blev overtrukket med 30 pi Matrigel (B. Biosciences Pharmingen). I alt 3 × 10

4 SKOV3, SKOV3.ip1 og Hey celler hver suspenderet i 0,2 ml frisk medium uden kalvefosterserum blev tilsat til den øvre brønd i kammeret. I kontrolgruppen blev 600 pi komplet medium tilsat til den nedre brønd, hvorimod i testgruppen indeholdt mediet 5 mg /ml Huaier. Efter inkubation i 24 timer blev cellerne på den øvre overflade af membranen swiped med vatpinde. Derefter blev cellerne klæber til den nedre overflade af inserterne fikseret og farvet med hematoxylin. Seks repræsentative områder af hver indsats blev tilfældigt talt ved hjælp af et Olympus lysmikroskop.

omvendt fase proteinarray

SKOV3 celler og SKOV3.ip1 celler (5 x 10

5) blev dyrket i retter diameter 6 cm. Efter en 24 timers inkubation blev cellerne delt i fire grupper, der modtager forskellige behandlinger: komplet medium alene i 72 timer, Huaier vandig ekstrakt (5 mg /ml) i 72 timer, komplet medium i 60 timer plus natten over sult og 10 min stimulation med epidermal vækstfaktor (EGF, 20 ng /ml) og Huaier vandig ekstrakt (5 mg /ml) i 60 timer plus natten over sult og 10 minutter stimulering med EGF (20 ng /ml). Omvendt fase-protein array (RPPA) assay blev udført på det funktionelle Proteomics Reverse Phase Protein Array Core Facility på M.D. Anderson Cancer Center. Kort fortalt blev cellelysaterne justeret for deres proteinkoncentrationer, denatureret med SDS og serielt fortyndet (fra ufortyndet til 1:16 fortynding) til at definere det lineære område af hvert antigen-antistof-reaktion. Lysaterne blev spottet på nitrocellulose-coatede objektglas (Whatman, Inc.) under anvendelse af en GeneTAC G3 microarrayer (Genomiske Solutions) sammen med positive og negative kontroller. I alt 153 validerede antistoffer specifikke for proteiner eller deres phosphorylerede websteder, der er involveret i forskellige signalveje var tilgængelige og anvendes i RPPA (se tabel S1 for proteiner og fosforylering steder, der anvendes i RPPA studier). Hvert objektglas blev probet med et primært antistof plus en konjugeret sekundært antistof ved hjælp af Dako CSA (tyramid) amplifikation tilgang og visualiseret under anvendelse af DAB kolorimetriske reaktion. De indsamlede data blev kvantificeret ved hjælp af den kvantitative software MicroVigene, der specifikt blev udviklet til denne fremgangsmåde. De proteinphosphorylering niveauer blev udtrykt som et forhold til de tilsvarende totale proteiner. De værdier, der stammer fra hældningen og opfanger blev udtrykt i forhold til standard kontrol cellelysater på array. Alle værdier blev sammenlignet med gennemsnittet inden hvert antistof probe og visualiseret med heatmaps skabt af softwaren MatLab (Mathworks Inc.).

Cell fraktionering

kerneproteiner blev isoleret ved anvendelse af BestBio Nuclear og cytoplasmiske Ekstraktion reagenser (BestBio, Shanghai, Kina) i henhold til producentens specifikationer. Kort fortalt, 1 x 10

6 celler blev vasket to gange med kold PBS og lyseret med 100 pi iskold cytoplasmatisk ekstraktion reagens (CER) og 1 pi af proteaseinhibitor. Efter opsamling af cytoplasmatiske fraktion (supernatant), blev ekstraktionen nukleare reagens (NER) og protease inhibitor cocktail tilsat til den uopløselige fraktion og fastholde den volumenforhold på CER: NEF: protease cocktail på 100:500:1. Efter en 60 minutters inkubation og en 5-min centrifugering (16.000 x

g

ved 4 ° C), det nukleare fraktion blev opsamlet. Supernatanten og nuklear fraktion blev underkastet western blot-analyse for β-catenin.

Western blot-analyse

Cellerne blev udpladet ved en densitet på 2 x 10

5 pr 3,5 cm skål diameter og opsamlet efter den angivne behandling. Cellerne blev lyseret i lysisbuffer (Biyuntian Biotech Co., Ltd, Shanghai, Kina) at følge instruktionerne fra producenten. Lige store mængder protein (20 ug per bane) blev adskilt ved 12% SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner (Millipore, Billerica, MA). Efter blokering blev blots probet med de primære antistoffer og inkuberes natten over ved 4 ° C, efterfulgt af mærkning med de passende sekundære antistoffer konjugeret med HRP. Immunreaktive bånd blev visualiseret ved anvendelse af ECL detektionssystem (Pierce, Rockford, IL, USA). GAPDH, β-actin og histon H1 blev anvendt som indlæsning kontroller.

Immuncytokemi

Dyrkede celler blev vasket med PBS og fikseret med 4% paraformaldehyd. Objektglassene blev igen vasket, behandlet med 1% Triton i 15 minutter og blokeret med 3% H

2O

2 i 20 min. Efter vask blev objektglassene blokeret med normalt gedeserum i 10 minutter ved stuetemperatur og inkuberet først med 1:200 anti-humant E-cadherin antistof (Epitomics, CA, USA) ved 4 ° C natten over og derefter med et biotinyleret anti-kanin sekundært antistof i 30 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev objektglassene inkuberet med avidin-biotin-peroxidase-systemet i 10 minutter ved stuetemperatur og farvet med diaminobenzidin (DAB) i 2 minutter. Endelig blev de modfarvet med hematoxylin og betragtet under et lysmikroskop.

Kvantitativ real time RT-PCR

Cellerne blev behandlet med eller uden 7,5 mg /ml Huaier i 48 timer. Totalt RNA blev ekstraheret fra de behandlede og kontrol-celler under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. cDNA blev syntetiseret fra 1 pg RNA ved anvendelse af RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit (Fermentas, St-Leon-Rot, Tyskland). Ekspressionsniveauerne af gener relateret til den Wnt signalvejen [DIX domæne indeholdende-1 (

DIXDC1)

], lavdensitetslipoprotein receptor-relateret protein 6 (

LRP6)

, og vingeløse-typen MMTV integration hjemmeside familie, medlem 5A (

WNT5A)

) blev evalueret med en Illumina Eco Real-time system ved hjælp af en Perfect Real Time Kit (Takara). β-actin blev anvendt som en intern kontrol i hver reaktion. De primersæt for disse gener vil blive leveret efter anmodning. De relative fold ændringer blev beregnet ved anvendelse af ΔΔCt metoden.

Mus xenograft og måling af tumorstørrelse

Dyret eksperimenter blev godkendt af den etiske komité for Obstetrik og Gynækologi Sygehus Fudan University. Seks uger gamle BALB /c mus blev købt fra den kinesisk-britiske SIPPR /BK Lab Animal Ltd., Co (Shanghai, Kina). SKOV3-celler (4 x 10

6) blev injiceret subkutant i den højre flanke af hver mus. Derefter blev musene tilfældigt inddelt i fire grupper (n = 6 mus /gruppe) til at få enten normalt saltvand (NS) som kontrol, Huaier (4 g /kg legemsvægt), cisplatin (DDP) (5 mg /kg legemsvægt ) eller Huaier plus DDP. Huaier blev indgivet oralt dagligt. DDP blev injiceret en gang om ugen i tre uger. Kontrolmusene blev behandlet med det samme volumen NS kun. Tumorvolumener blev målt to gange om ugen ved anvendelse af en digital skydelære og beregnes efter følgende formel: tumorvolumen (mm

3) = (tumorlængde [mm] × tumor bredde × højde [mm]) ‘n /6. Musene blev aflivet på dag 42 efter tumorcelleinjektion. Legemsvægt blev også målt for at vurdere bivirkningerne. Midlerne til tre uafhængige målinger blev gennemsnit

siRNA-medieret Gene Silencing

GSK3p siRNA rækkehuse, som er rettet mod sekvenserne:. (5′-GAGCAAAUCAGAGAAAUGAdtdt-3 ‘) blev syntetiseret af Genechem (Shanghai , Kina), For siRNA transfektion, 5 × 10

5 celler /skål blev udsået i 60 mm dyrkningsskåle. Den følgende dag blev der tilsat 10 pi Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) til 0,5 ml Opti-MEM reducerede serum medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) uden antibiotika og serum, og inkuberet ved stuetemperatur i 5 min (opløsning EN). 200 pmol siRNA blev sat til 0,5 ml Opti-MEM-medium uden antibiotika og serum (opløsning B). Opløsning A og opløsning B blev derefter blandet og inkuberet ved stuetemperatur i 20 minutter. Cellekulturmediet blev fjernet, og derefter 1 ml til 2000 siRNA blanding lipofectamin og 4 ml frisk 1640 medium uden antibiotika blev tilsat til hver dyrkningsskål og blandet forsigtigt. 24 timer senere blev mediet erstattet med frisk dyrkningsmedium eller 5 mg /ml Huaier vandige ekstrakt. Celler blev høstet til Western blot-analyse efter 24 timers inkubation.

Statistisk analyse

Dataene er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse. Forsøg blev gentaget tre gange. Resultaterne blev analyseret ved anvendelse af SPSS 11.5 softwaren. p 0,05 blev accepteret som signifikant

Resultater

Huaier hæmmede levedygtighed celle i SKOV3, SKOV3.ip1 og Hey celler

For at vurdere effekten af ​​den Huaier ekstrakt på. SKOV3, SKOV3.ip1 og Hey celler, målte vi cellelevedygtighed under anvendelse af SRB-assayet. Efter at cellerne var behandlet med Huaier i 24, 48, 72 og 96 timer ved forskellige koncentrationer (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5 og 10 mg /ml), Huaier inhiberede signifikant væksten af ​​SKOV3, SKOV3.ip1 og Hey celler på en tids- og dosisafhængig måde (figur 1). Den cytotoksiske virkning startede 24 timer efter 5 mg /ml Huaier behandling og blev mere tydelig ved 48, 72 og 96 timer i SKOV3 og Hey celler, hvorimod det startede efter 48 timer i SKOV3.ip1 celler. Hey og SKOV3.ip1 celler var mere følsomme over for Huaier behandling, som levedygtighed satser blev reduceret til 31.94% (72 timer, p 0,001) og 20,43% (96 timer, p 0,001) i SKOV3.ip1 celler, 4,9% (72 timer, p 0,001) og 3,1% (96 timer, p 0,001) i Hey celler sammenlignet med 61,1% (72 timer, p = 0,01) og 40,1% (96 timer, p 0,001) i SKOV3-celler. Et signifikant fald i cellelevedygtighed blev observeret, når cellerne blev behandlet med 10 mg /ml Huaier, uafhængig af behandlingsvarigheden.

væksthæmmende effekt af Huaier blev målt ved anvendelse af SRB-assayet. SKOV3 (A) SKOV3.ip1 (B) og Hey (C) -celler blev behandlet med Huaier i 24, 48, 72 og 96 timer. Forsøgene blev udført i tre eksemplarer, og dataene præsenteret som middel ± SD af tre separate eksperimenter.

Cell apoptose analyseret med PI-annexin-V farvning

Fordi Huaier ekstrakt signifikant inhiberede cellevækst, vi nærmere om denne virkning blev opnået ved at inducere apoptose. PI-annexin V-farvning assay viste, at den sene apoptose eller celledød sats (UR) og tidlig apoptose sats (LR) efter Huaier behandling i 48 timer, både forøget på en dosis-afhængig måde i SKOV3, SKOV3.ip1 og Hey celler (figur 2 og tabel 1).

procentdelen af ​​apoptotiske celler blev målt ved flowcytometri under anvendelse af PI-annexin V assay. (A, B, C) Dot plots viser apoptose i SKOV3 (A), SKOV3.ip1 (B) og Hey (C) celler med Huaier behandling ved 0, 2,5, 5 og 10 mg /ml i 48 timer.

Cell motilitet faldt på grund af eksponering for Huaier ekstrakt

for at undersøge, om den Huaier ekstrakt påvirkede celle motilitet, celle invasion og scratch blev udført. Når SKOV3-celler blev behandlet med 5 mg /ml Huaier ekstrakt, antallet af invaderende celler gennem Matrigelcoatede membran blev signifikant reduceret sammenlignet med den ubehandlede gruppe (218 ± 35 mod 18 ± 7, s 0,001,), hvilket indikerer, at invasion evne blev inhiberet. Lignende resultater blev fundet i SKOV3.ip1 og Hey celler (SKOV3.ip1: 438 ± 26 versus 83 ± 25; Hey: 264 ± 21 versus 62 ± 16 p 0.001, figur 3).

(A ) virkningen af ​​Huaier på invasionen af ​​SKOV3, SKOV3.ip1 og Hey celler blev undersøgt under anvendelse af Transwell system. Repræsentative billeder præsenteres. (B) Efter en 24 timers behandling med 5 mg /ml Huaier, antallet af held invadere SKOV3, SKOV3.ip1 og Hey celler blev talt. Dataene er præsenteret som middelværdi ± SD. ** P. 0,01 sammenlignet med kontrollen

En ridse assay blev udført for at vurdere cellemigrering in vitro. Som angivet i figur 4, migration index (svarende til sårheling kapacitet) var signifikant inhiberet i SKOV3 celler behandlet med Huaier i 48 timer sammenlignet med ubehandlede celler (23,3% versus 69,8%, p 0,01), mens den var ens i celler behandlet med Huaier i 24 timer og ubehandlede celler (17,5% versus 24,7%, p 0,05). Men migration indekset faldt så tidligt som 24 timer efter Huaier behandling i SKOV3.ip1 celler sammenlignet med ubehandlede celler (19,3% versus 60,6%, p 0,05). For Hey celler, kan såret næsten lukket op kun 12 timer healing i ubehandlede celler, og migrationen indekset blev hæmmet betydeligt i behandlede celler med Huaier for blot 6 timer (58,2% versus 29,1% p. 0,01).

(a) en lige sårområde blev genereret på hver kultur godt i starten, og administration af Huaier (5 mg /ml) viste en forsinket proces med sårlukning sammenlignet med de ubehandlede celler. Repræsentative billeder af kontrol celler og 5 mg /ml Huaier-behandlede celler blev erhvervet ved 0, 12,24 h (SKOV3, SKOV3.ip1) eller 0, 6, 12 timer (Hey). (B) De migration indeks var signifikant hæmmet af Huaier. Søjlerne repræsenterer migration indeks for hver behandling, udtrykt som en værdi i forhold til afstanden bevæges af cellemonolaget. Dataene er præsenteret som middelværdi ± SD. Forsøgene blev gentaget mindst tre gange. ** P 0,01 sammenlignet med kontrolgruppen

celleproliferation, apoptose og celleadhæsion eller invasion signalering proteiner nedreguleres af Huaier behandling

For at undersøge signalveje, der kunne. bidrage til Huaier s hæmmende virkning på motilitet, brugte vi RPPA analyse for at vurdere protein ændringer i SKOV3 og SKOV3.ip1 celler behandlet med Huaier. RPPA er et nyt high-throughput teknologi, der overvåger ændringer i proteinekspression over tid, før og efter behandlingerne, mellem sygdom og ikke-sygdomstilstande og mellem respondere og non-respondere [11]. Under anvendelse RPPA analyserede vi ekspressionsniveauet af 153 proteiner og /eller phosphoryleringssteder i Huaier-behandlet eller ubehandlet æggestokkene cancercellelinier med eller uden EGF-stimulering. For hver prøve og hvert antistof, signalet forskellen mellem ubehandlede og Huaier-behandlede celler blev beregnet som følger [12]: ([betyde af behandlede celler – krævet ikke-behandlede celler] /[hjælp af ikke-behandlede celler]) × 100%.

af de 153 proteiner og phosphoryleringssites analyseret, 7 og 10 afveg med mere end 30% i de behandlede og ubehandlede forhold i SKOV3 og SKOV3.ip1 celler. Repræsentative heatmaps er vist i figur 5A. I SKOV3 celler, Huaier behandling hæmmede celledeling og ændret de niveauer af beslægtede proteiner /phosphoryleringssteder; for eksempel, faldt HER2 phosphorylering på Y1248 og ER-proteinniveauer men opreguleret p53 og Taz phosphorylering på S79. I SKOV3.ip1 celler, mere pro-proliferative proteiner, såsom ER, c-kit og phosphoryleret S6 (ribosomal protein S6 kinase; phosphoryleret ved S235-236 og S240-244) blev nedreguleret ved Huaier. Desuden Huaier inhiberede ekspressionen af ​​den længere isoform af Bcl (Bd-XL) og opreguleret ekspression af pro-apoptotiske proteiner, såsom p53 og spaltede poly (ADP-ribose) polymerase (PARP_cleaved), i SKOV3.ip1 celler (figur 5B).

(A) Hierarkisk klynge analyse af fire prøver (kontrol, Huaier-behandlet i 72 timer, sult + stimulering EGF, sult + EGF stimulation + Huaier i 60 timer) i SKOV3 og SKOV3 .ip1 celler ifølge ekspressionen af ​​16 signalmolekyler. Cluster farve nøgle: rød – opreguleret; grøn – nedreguleret; sort – uændret. (B og C): Fold ændringer i ekspressionen eller phosphorylering af forskellige proteiner efter Huaier behandling og tilsætning af EGF blev analyseret under anvendelse af RPPA assayet i SKOV3 (B) og SKOV3.ip1 (C) celler. De relative værdier af kontrolgruppen og sult + EGF stimulation grupper blev sat som 1,0. *:. Fold-change 30%

Vi fandt også, at Huaier kan regulere celleadhæsion og invasion, baseret på nedregulering af fibronectin, β-catenin og caveolin-1-ekspression i begge cellelinier og opregulering af claudin 7 i SKOV3.ip1 celler efter Huaier behandling (figur 5B).

Inddragelse af Pakt /mTOR /S6 vej i Huaier-induceret æggestokkræft celievækstinhiberingen

Brug den RPPA, fandt vi, at ribosomal S6 kinase fosforylering blev undertrykt af Huaier behandling. S6-kinase er et vigtigt mål for mTOR pathway, og det fremmer cellevækst og proliferation. Den AKT pathway er en opstrøms aktivator af mTOR pathway. Derfor har vi analyseret protein niveauer af Pakt, AKT, PS6 (S235-236) og PS6 (S240-244) ved western blotting. Vi fandt, at AKT phosphorylering blev reduceret betydeligt i SKOV3.ip1 celler efter 72 timers Huaier behandling, enten med eller uden EGF-stimulering. I overensstemmelse med faldet i Pakt, phosphoryleringen af ​​S6 på S235-236 og S240-244 blev også nedreguleret. Men i SKOV3 celler, phosphorylering af S6 på S235-236 og S240-244 blev nedreguleret i celle behandlet med Huaier kun, men ikke i EGF stimulation grupper, mens Pakt lidt blev øget i Huaier-behandlede SKOV3 celler. Huaier nedreguleret i phosphorylering af S6 på S240-244 i både Huaier-behandlede kun og EGF stimulering grupper Hey celler. (Figur 6).

AKT phosphorylering, total AKT niveauer, og S6 phosphorylering på S235 og S240 blev målt ved Western blotting af prøver fra hver af de fire behandlingsgrupper (kontrol, Huaier-behandlet i 72 timer, udsultning + EGF stimulering, sult + EGF stimulation + Huaier i 60 timer). Numrene på protein bands repræsenterer fold ændringer, med de basale niveauer i kontrol eller sult + EGF grupper tildelt en værdi på 1,0.

Huaier hæmmer cellulær invasion via GSK3p /β-catenin vej

Fordi resultaterne af annexin V /PI-farvning indikerede, at Huaier inducerer apoptose og RPPA resultater indikerer endvidere, at flere program- og anti-apoptotiske proteiner blev moduleret af Huaier behandling, vores resultater støtter den pro-apoptotiske virkning af Huaier observeret i andre studier. Men RPPA analyse viste også, at proteiner involveret i celleadhæsion og invasion blev moduleret af Huaier behandling (figur 5). Dette antyder, at Huaier kan have en anden terapeutisk vigtige virkninger, navnlig fordi epiteliale ovariecancerceller har en unik invasiv /metastatisk kapacitet og ofte implantatet i bækken eller bughulen.

Blandt de proteiner, β-catenin er en nøgle komponent af E-cadherin-medieret celle-celle-adhæsion kaskade. Ved hjælp af western blots, vi yderligere bekræftet ændringerne i β-catenin udtryk i SKOV3, SKOV3ip1 og Hey celler. Som vist i figur 7, Huaier faldt dramatisk den cytosoliske akkumulering af β-catenin i en tidsafhængig måde i SKOV3, SKOV3.ip1 og Hey celler. Den nukleare ekspression af β-catenin blev også reduceret. Vores data indikerer, at Huaier undertrykker ikke kun det protein ekspression, men også den nukleare translokation af β-catenin.

Både den cytoplasmatiske ekspression og nuklear translokation af β-catenin var signifikant inhiberet ved Huaier behandling. (A) SKOV3, (B) SKOV3.ip1 og (C) Hey celler blev behandlet med 5 mg /ml og 7,5 mg /ml Huaier i 24, 48 og 72 timer. De cytoplasmiske og nukleare proteiner blev ekstraheret separat. Et repræsentativt Western blot vises. For densitometrisk analyse af β-catenin-niveauer, resultatet blev normaliseret til niveauerne af GAPDH (for cytoplasmatiske proteiner) eller histon 1 (kerneproteiner). Det basale niveau for de ubehandlede grupper ved hvert tidspunkt blev tildelt en værdi på 1,0.

For at klarlægge mekanismen forårsager nedregulering af β-catenin, vi evalueres yderligere udtryk for GSK3p (glykogen syntase kinase 3β), som vides at negativt regulere klassiske Wnt /β-catenin signalvejen ved phosphorylering β-catenin, hvilket fører til dens nedbrydning [13]. Fordi phosphorylering af GSK3p på S9 hæmmer dets aktivitet og forhindrer målretning af β-catenin til nedbrydning blev helcellelysater undersøgt for både total GSK3p og phosphoryleret GSK3p på S9 niveauer efter Huaier behandling.