PLoS ONE: Oxideret LDL receptor 1 (OLR1) som en mulig forbindelse mellem fedme, dyslipidæmi og Cancer

Abstrakt

Nylige undersøgelser har knyttet udtryk for lektinlignende ox-LDL-receptor 1 (

OLR1

) til tumorigenese. Vi analyserede microarray data fra

Olr1

knockout (KO) og vildtype (WT) mus for gener involveret i cellulær transformation og evalueret effekter af

OLR1

overekspression i normale mammaepitelceller (MCF10A ) og brystkræftceller (HCC1143) i form af genekspression, migration, adhæsion og transendotelial migration. Twenty-seks ud af 238 gener blev inhiberet i væv fra OLR1 KO-mus; det store flertal af OLR1 følsomme gener indeholdt NF-KB-bindingssteder i deres promotorer. Yderligere undersøgelser afslørede bred hæmning af NF-kB målgener uden for omdannelsen-associerede genpulje, med berigelse temaer til forsvar respons, immunrespons, apoptose, spredning og sårheling. Transkriptom af

Olr1

KO mus afslørede også hæmning af

de novo

lipogenese, hastighedsbegrænsende enzymer fedtsyre syntase (

Fasn

), stearoyl-CoA desaturase (

SCD1

) og ELOVL familiemedlem 6 (

Elovl6

), samt lipolytisk phospholipase A2 gruppe IVB (

Pla2g4b

). I undersøgelser, der sammenligner MCF10A og HCC1143, sidstnævnte viste 60% højere

OLR1

udtryk. Tvungen overekspression af

OLR1

resulterede i opregulering af NF-KB (p65) og dens target pro-onkogener involveret i inhibering af apoptose (

BCL2

,

BCL2A1

,

TNFAIP3

) og regulering af cellecyklus (

CCND2

) i begge cellelinier. Basal udtryk for

FASN

,

SCD1

PLA2G4B

, samt lipogenese transkriptionsfaktorer

PPARa

,

SREBF2

CREM

, var højere i HCC1143 celler. Overekspression af

OLR1

i HCC1143 celler forbedret også celle migration, uden at det påvirker deres tilslutning til TNF-aktiverede endotel eller transendothelial migration. På den anden side,

OLR1

neutraliserende antistof hæmmede både adhæsion og transmigration af ubehandlede HCC1143 celler. Vi konkluderer, at

OLR1

kan virke som et onkogen ved aktivering af NF-kB målgener ansvarlige for formering, migrering og hæmning af apoptose og

de novo

lipogenese gener.

citation: Khaidakov M, Mitra S, Kang BY, Wang X, Kadlubar S, Novelli G, et al. (2011) oxideret LDL receptor 1 (

OLR1

) som en mulig forbindelse mellem fedme, dyslipidæmi og kræft. PLoS ONE 6 (5): e20277. doi: 10,1371 /journal.pone.0020277

Redaktør: Carlo Gaetano, Istituto Dermopatico dell’Immacolata, Italien

Modtaget: December 20, 2010; Accepteret: April 28, 2011; Udgivet: May 26, 2011

Copyright: © 2011 Khaidakov et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

OLR1

, et lectin -lignende scavenger receptor, er stærkt bevaret hos pattedyr [1], og den er i stand til at genkende flere ligander, herunder proteindelen af ​​oxideret-LDL (ox-LDL), fremskreden glycosylering slutprodukter, grampositive og gramnegative bakterier og apoptotiske celler [2].

OLR1

primært udtrykkes i vaskulære celler og vaskulatur-rige organer [3], og dets aktivering af en lang række af stimuli, der indikerer dyslipidæmi, inflammation og skader initierer flere signaleringskaskader herunder MAPK’er, andre proteinkinaser samt som transkriptionsfaktorer NF-KB og AP-1 [4], [5].

Overekspression af

OLR1

er blevet vist i cellulære bestanddele i atherosklerotiske læsioner [6]. Sletning af

Olr1

i

LDLr

knockout (KO) mus resulterer i meget mindre aterosklerotiske læsioner forbundet med en drastisk reduktion af inflammation i aortavæggen [7].

Olr1

ophævelsen dæmper også angiotensin II-induceret hypertension [8]. Ligeledes ophævelsen af ​​

Olr1

reducerer omfanget af iskæmi /reperfusion skade [9].

En association mellem fedme og aterosklerotiske sygdomstilstande hos mennesker er veletableret [10], [11]. Foreninger med fedme er blevet fundet for forskellige kræftformer, herunder bryst- og prostata neoplasmer [12], [13], hvilket tyder på en mekanistisk overlap i Patobiologi af atherogenese og tumorigenese. For nylig,

Olr1

, der virker gennem NF-KB-medieret inflammatorisk signalering, var stærkt impliceret i carcinogenese [14].

Fokus i denne undersøgelse var at yderligere at belyse rolle

OLR1

som et onkogen baseret på den forudsætning, at som en sensor af dyslipidæmi og et molekyle involveret i NF-kB-aktivering,

OLR1

kan være en sammenhæng mellem dyslipidæmi og kræft. Den første del af undersøgelsen var baseret på microarray analyse af vildtype (WT) og

olr1

KO mus. Den anden del definerer forholdet mellem

olr1

og apoptose og lipogenese gener i brystkræft cellelinje HCC1143 og migration og adhæsion af disse celler.

Resultater

Sammenligning af

OLR1

KO og transformation transcriptomes

de vigtigste resultater fra analysen af ​​microarray data fra hjerter vildtype (WT) og

Olr1

KO fra vores gruppe er blevet rapporteret andetsteds [15]. En yderligere analyse mod overlappende sæt af gener (n = 238) fundet at være opreguleret under transformation af to isogene celletyper [14] viste, at 26 gener fra denne liste blev hæmmet i

Olr1

KO transkriptom ved på mindst 20% (tabel 1). Blandt disse var forskellige komponenter i immunrespons (

Isg20

,

C1s

,

S1R

,

Ifrd1

) og en række af transkriptionsfaktorer, herunder vel- kendte onkogener (

JunB

,

Rel

,

Irf2

,

Crem

). Promotor analyse af resulterende sæt af gener [16] identificerede deres berigelse for NF-KB-bindingssteder (p 0,03), som var placeret inden for 500 nukleotider proksimalt for transkriptionelle starte sites i alle undtagen en (

C1s

)

Olr1

følsomme gener (n = 25, fig. 1).

et diagram, der afbilder et sæt af overlappende gener mellem transformation og

Olr1

KO transcriptomes. Fra sættet af 238 gener opregulerede under transformation blev fundet 26 gener, der skal inhiberes i

Olr1

KO-mus. Langt størstedelen af ​​disse gener gennemføres NF-KB sites i deres proksimale promotorsekvenser. I alt blev fundet 86 NF-KB målgener skal inhiberes i

Olr1

KO-mus med berigelse for regulering af apoptose (p = 0,0002), proliferation (p = 0,00003), sårheling (p = 0,0002) , forsvar respons (p = 0,0011), immunrespons (p = 0,0003) og celle migration (p = 0,0009).

OLR1

sletning resulterer i en bred hæmning af NF-KB målgener

Yderligere søgen efter NF-KB regulerede gener ved hjælp af en liste udarbejdet af tilgængelige webbaserede databaser og litteraturen viste, at hæmning af p65 subunit observeret i

Olr1

KO transkriptom blev suppleret med opregulering af hæmmende

Ikbα

underenhed (1,36 gange, p = 0,002, tabel 1) og ledsaget af betydelig nedregulering af flere (n = 61) NF-KB-target gener (tabel 2). Den kombinerede sæt

Olr1

følsomme NF-KB målgener viste berigelse for regulering af apoptose (p = 0,0002), proliferation (p = 0,00003), sårheling (p = 0,0002), forsvar respons (p = 0,0011 ), immunrespons (p = 0,0003) og cellevandring (p = 0,0009) (figur 1). Blandt de der er involveret i apoptose gener (n = 11) og celleproliferation (n = 12), 6 og 5, henholdsvis var negative regulatorer (David Bioinformatik Database, 17).

OLR1

sletning undertrykker lipogenese gener

resultaterne microarray blev valideret for udvalgte gener ved hjælp af kvantitativ real-time PCR. For de fleste af de testede gener, de transkriptionelle skift i

Olr1

KO observeret i mikroarrays blev bekræftet (figur 2A). Desuden

Olr1

deletion resulterede i inhibering af nøgleenzymer for lipogenese (figur 2B), herunder ATP-citrat-lyase (

Acly

), acetyl-coenzym A-carboxylase alpha (

Acaca

), fedtsyre syntase (

Fasn

), stearoyl-CoA desaturase 1 (

SCD1

) og ELOVL familiemedlem 6 (

Elovl6

). Det er af interesse, at ingen af ​​de

Olr1

-følsom Lipidmetabolisme gener foretaget NF-KB bindingssteder i deres initiativtagere. Dette tyder på, at virkningerne af

Olr1

på lipogenese kan være uafhængig af sin NF-KB-signalering arm. På den anden side, flere lipid metabolisme transkriptionsfaktorer, herunder sterol regulatorisk element bindende faktor 2 (

Srebf2

), cAMP responsivt element modulator (

Crem

), peroxisomproliferatoraktiveret receptorer alfa og gamma (

PPARa

Pparg

), samt CCAAT /forstærker bindende protein (C /EBP) beta, viste sig at være nedreguleret i

Olr1

KO-mus (figur 2B ).

A. qPCR validering af udvalgte gener fra overlappende sæt (fra tabel 1); B. Angivelse af lipogenese gener og transkriptionsfaktorer i

olr1

KO mus. Hvide søjler – microarray data; sorte bjælker – qPCR data. Alle P-værdier. 0,05

Virkninger af

OLR1

overekspression i normale epitel og cancerceller

Transfektion af MCF10A og HCC1143 celler med

OLR1

ekspressionsvektor resulterede i 5 til 8 gange forøgelse af

OLR1

udtryk, der falder inden for området OLR1 opregulering. I epiteliale celler udsat for ox-LDL [18]. Dette førte til beskedne opregulering af

RELA

(p65) og betydelige stigninger i RNA besked til

BCL2, BCL2A1, TNFAIP3 og CCND2

(figur 3B). Sammenlignet med MCF10A celler, de viste HCC1143 celler øget basale niveauer af

OLR1 Hotel (59%, p 0,05),

FASN Hotel (24%, p 0,03),

SCD1

(21%, p 0,01) og

PLA2G4B Hotel (153%, p 0,01) (figur 3C). Svaret fra lipogenese gener til

OLR1

transfektion varierede i disse cellelinjer (figur 3D). I MCF10A celler, overekspression af

OLR1

væsentligt stimuleret transskription af

SCD1 Hotel (37%, p 0,02),

ELOVL6 Hotel (38%, p 0,05) og

PLA2G4B Hotel (153%, p 0,02) samtidig med opregulering af

CREM

, mens der i HCC1143 celler

CREM

transskription faldt og

SCD1

PLA2G4B

blev inhiberet sammenlignet med kontrolkulturer transficeret med tom vektor.

Disse celler blev transficeret med enten tom vektor eller

OLR1

cDNA (Origene, Rockville, MD) under anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen). Transfektionseffektivitet (70-80%) blev vurderet ved anvendelse af GFP-vektoren. RNA blev ekstraheret 48 timer efter transfektion, omdannet til cDNA og ekspressionen af ​​gener blev bestemt ved kvantitativ PCR. A. Effektivitet af transfektion (celler transficeret med GFP-vektoren). B. Kvantitativ PCR plot. Bemærk forbedring af OLR1 udtryk i både kontrol og OLR1-transfekterede kulturer i respons på ox-LDL. C. Ekspression af gener involveret i apoptose og proliferation. For at stimulere

OLR1

tilhørende signalering kræver OLR1-ligand-interaktion,

OLR1

transfekterede celler blev behandlet med 40 pg /ml ox-LDL i 24 timer; grafer repræsenterer sammenligning med ubehandlede kontrolceller transficeret med tom vektor; D. Basal udtryk for

OLR1

,

PLA2G4B

lipogenese gener i normale humane mammae epitelceller (MCF10A) og brystkræftceller (HCC1143); E. Angivelse af

OLR1

,

PLA2G4B

lipogenese gener i MCF10A og HCC1143 celler transficeret med OLR1 behandlet i overensstemmelse med den ovenfor beskrevne protokol. F. Ekspression af lipogenese transkriptionsfaktorer i MCF10A og HCC1143 celler transficeret med OLR1 og behandlet ifølge protokollen beskrevet ovenfor. Alle forsøg blev udført i triplikater. (*) P 0,05 sammenlignet med respektive kontrol; (†) – p. 0,05 sammenlignet med MCF10A

Over-ekspressionen af ​​

OLR1

letter sårheling, men har ingen effekt på vedhæftning

Det har været rapporterede, at hæmning af

OLR1

bruge siRNA’er resulterede i reduktion af tumorvækst

in vivo

og kræft celle migration

in vitro

[14]. For at vurdere virkningerne af

OLR1

opregulering, transficerede vi HCC1143 celler med enten tomme plasmid eller

OLR1

ekspressionsvektor og testet migration i en sårhelende assay (figur 4A). Over-ekspressionen af ​​

OLR1

blev bekræftet ved hjælp af qPCR. Celler med opreguleret

OLR1

bro sårene meget hurtigere end kontrolkulturer (p 0,001). I modsætning hertil vedhæftning og transendotelial migrering af

OLR1

transfekterede kræftceller adskilte sig ikke fra kontrolværdier (ikke vist).

A. Sårheling assay. Øverste panel – repræsentative billeder af sårheling assay udføres ved hjælp af HCC1143 celler transficeret med enten tomme plasmid eller

OLR1

cDNA vektor; Nedre panel – graf, der viser afstanden mellem kanterne af såret efter 36 timers inkubation. (*) – P 0,01; B. Adhæsion assay. Øvre XLRF repræsentative billeder af vedhængende ikke-transficerede HCC1143 celler fyldt med CellTracker Red CMTX (Invitrogen, Carlbad, CA) og anvendes til ikke-aktiverede eller aktiverede (50 ug /ml oxLDL, 4 timer) sammenflydende HUVEC’er transficeret med OLR1 Silencer eller krypteret siRNA. Nedre panel – graf, der viser antallet af adhærente celler midlede fra flere synsfelter i tredobbelte kulturer. (*) – P 0,05 sammenlignet med ikke-aktiverede kontrol ( “scrRNA”); (†) – p 0,05 sammenlignet med krypterede RNA; C. Kolorimetrisk transendothelial migration assay. Øverste panel – kontrol af sammenløbet af HUVEC’er på membranerne ved farvning af celler med CellTracker Red CMTX. Lavere panel – absorbansværdier af pletten udvundet fra cellerne migreret gennem TNF-aktiverede endotel monolag i tilstedeværelse af

OLR1

neutraliserende antistof eller humant IgG (Control)

Men basal vedhæftning. og transendotelial migrering af ikke-transficerede HCC1143 celler var signifikant svækket, da OLR1 blev hæmmet eller neutraliseret i endotelceller ved hjælp siRNA eller forbehandling celler med

OLR1

neutraliserende antistof (figur 4BC).

diskussion

Denne undersøgelse tyder på flere potentielle forbindelser mellem

OLR1

og modtagelighed for kræft. Først databasen mikroarray i mus med

Olr1

ophævelsen udviste en markant reduktion i ekspression af NF-kB target gener involveret i cellulær transformation [14], samt gener relateret til lipogenese. For det andet, over-ekspression af

OLR1

i en human cancercellelinie viste signifikant opregulering af adskillige gener med onkogene egenskaber og en betydelig stigning i cellemigrering.

Vores microarray analyse viste, at det store flertal af gener rapporteret at være opreguleret under celletransformation (men inhiberet i

Olr1

KO-mus), der bæres NF-kB-bindingssteder i deres promotorer (tabel 1). Desuden er en betydelig del af NF-kB målgener uden for omdannelsen-relaterede pool, især dem der er involveret i regulering af apoptose, proliferation og migration, blev også nedreguleret i

Olr1

KO transkriptom (tabel 2 ). I mus

Olr1

KO microarray, både B-celle leukæmi /lymfom 2 relateret protein A1 (

Bcl2a1

) og

Bcl2

var transkriptionelt hæmmet.

Bcl2a1

er en opstrøms negativ regulator af mitochondriocentric tilstand af apoptose

via

forebyggelse af cytochrom c-frigivelse i cytoplasmaet, som er nødvendig for indledningen af ​​apoptotiske kaskade. Det er blevet rapporteret, at en øget syntese af

BCL2A1

BCL-XL

er den underliggende årsag til omkring 1000 gange større modstand af delmængder af kronisk lymfatisk leukæmi celler [19]. TNFa-induceret protein 3 (

TNFAIP3

) er en central regulator af inflammation og immunitet involveret i udviklingen af ​​forskellige autoimmune sygdomme og det desensibiliserer også celler fra TNFa-induceret cytotoksicitet og blev vist at være anti-apoptotisk i bryst- cancer MCF7S1 celler [20]. Hæmning af

TNFAIP3

kompromiser vækst og overlevelse af glioblastom stamceller

via

hæmning af cellecyklusprogression og NF-KB-aktivitet, og øger overlevelsen af ​​mus med glioblastome xenografter [21].

Vi observerede en betydelig reduktion af

Ccnd2

besked i

Olr1

KO mus og dens multi-fold opregulering i

OLR1

transgene HCC1143 celler. Cyclin D2 er en særdeles konserveret regulator af cyclinafhængige kinaser 4 og 6 ansvarlig for af G1 /S transition. Dette gen epigenetisk tavs i de fleste brystcancere [22]. Dens overekspression i LNCaP celler resulterer i en hindring for spredning og øget apoptose [23]. Desuden

Olr1

sletning syntes at kompromittere hele teknologiske kæden af ​​

de novo

lipogenese, herunder syntese af mættede C16 og C18-fedtsyrer (

Fasn

og

Elovl6

), og deres omdannelse til MUFA’er (

SCD1

). Mange kræftformer, herunder dem, der involverer prostata og bryst [24], [25], næsten udelukkende på

de novo

syntese uanset ernæringsmæssige tilgængelighed. Kontakten til

de novo

lipogenese opstår tidligt og er en forudsætning for effektiv transformation. Nye effekter af

OLR1

på lipidmetabolisme kunne tegne sig for meget af sin rapporterede pro-onkogen aktivitet. For eksempel

ekspressionsniveauet af

FASN positivt korrelerer med dårlig kræft prognose [26], dens genomiske forstærkning er en fælles begivenhed i nogle kræftformer [27], og dets overekspression fremmer transformation af epitelceller [28 ]. Ligeledes overekspression af

SCD1

er blevet observeret i flere typer af kræft, herunder brystkræft [29]; dens opregulering er associeret med transformation og dens knock-down resulterer i nedsat celleproliferation, et tab af forankringsuafhængig vækst og forringet apoptose [30]. Det er at bemærke, at i forhold til MCF10A celler, overekspression af

OLR1

i HCC1143 celler ikke fremkalde den forventede aktivering af lipogenese gener. Dette kan forklares ved maksimalt øget basal ekspression af disse gener i HCC1143 celler ved baseline (figur 3D).

Da de fleste af de gener opreguleret i

OLR1

-TG HCC1143 celler er funktionelt pleiotropisk, vi evaluerede den kumulative resultat af deres opregulering på sårheling, adhæsion og transendotelial assays migration (figur 4). Især blev migreringen af ​​celler ses at næsten dobbelt kontrolværdien i celler med overekspression af

OLR1

, hvilket kraftigt antyder en rolle for dette molekyle i vækst brystkræft. På den anden side, havde præsentation af

OLR1

på overfladen af ​​cancerceller synes ikke at være afgørende for adhæsion til aktiverede endotelceller eller til transendotelmigrering migration. Niveauet af

OLR1

i endotelceller, synes imidlertid at være vigtig, da tilsætning af neutralisere

OLR1

antistof til mediet eller hæmning af OLR1 transskription væsentligt forringet vedhæftning og transendotelial migration i ikke- transficerede cancerceller. Dette er tegn på

OLR1

som en mulig mekanisme for kræft celle-endotel-interaktioner, som tumorceller er karakteriseret ved overflod af

OLR1

ligand phophatidylserine på de cellulære membraner [31].

sammenfattende vores data fra flere tilgange i transgene mus og humane normale epitelceller og kræft cellelinjer tyder på, at

OLR1

har flere pro-onkogene handlinger baseret på: a) aktivering af NF-KB signalvej resulterer i hæmning af apoptose og stimulering af spredning; b) aktivering af de novo lipogenese, og c) mere effektiv adhæsion og transendothelial migrering grund opregulering af

OLR1

i endotel. Vi mener, at disse data tyder på, at

OLR1

kan fungere som bindeled mellem fedme og modtagelighed for brystkræft.

Materialer og metoder

Dyr

C57BL /6-mus blev opnået fra Jackson Laboratories. De homozygote

Olr1

KO mus blev udviklet på C57BL /6 baggrund som tidligere [17] beskrevet.

Olr1

KO mus viste totalt fravær af

Olr1

som bestemt ved RT-PCR og immunfarvning, og bindingen af ​​oxLDL til det vaskulære intima var helt fraværende i disse dyr. Alle dyr modtog human måde i overensstemmelse med Public Health Service Politik om Humane Pleje og anvendelse af forsøgsdyr udgivet af National Institutes of Health. De nuværende undersøgelser blev godkendt af UAMS Animal Care og brug Udvalg godkendelsesnummer 2484, dateret november 2007.

microarray analyse

Totalt RNA af hjerte blev ekstraheret fra WT mus og

Olr1

KO-mus. Microarray analyse blev udført af Affymetrix Mouse Genome GenChip 430 2.0 genekspression array (Affymetrix Inc. Santa Clara, CA) og analyseret ved hjælp af Affymetrix Microarray Analyse Suite (MAS) 5,0 for at vurdere kvaliteten af ​​RNA og hybridisering. En log bund 2 transformation blev anvendt på data, før de arrays blev normaliseret. Alle værdier fra hvert array blev normaliseret til den 75. percentil værdien af ​​array, som vilkårligt blev fastsat til intensitet minimum 100. For genekspression annotation, EASE (som beskrevet i https://apps1.niaid.nih.gov/David) analyse blev udført på væsentlige gener identificeret af én prøve

t

-test. Desuden blev Gene Ontology (GO) vilkår https://www.geneontology.org) for biologiske processer og cellulære komponent identificeres som foreslået af GO Consortium. Alle microarray data MIAME kompatibel og at den rå data er blevet deponeret i en MIAME kompatibel database (ArrayExpress) som angivet på MGED Society hjemmeside https://www.mged.org/Workgroups/MIAME/miame.html (tiltrædelse nummer E -MTAB-473).

reagenser og cellelinier

Alle reagenser, medmindre andet er angivet, blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO). Human brystcancer cellelinje HCC1143 var en venlig gave fra Dr. A. Basnakian (University of Arkansas for Medical Sciences, Little Rock AR). Pattedyrekspressionsvektor (pCMV5-XL5) med human

OLR1

cDNA blev opnået fra Origene (Rockville, MD). Lyddæmper Vælg Valideret siRNA til OLR1 (s9843) blev købt fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Celler blev dyrket under anvendelse af standard RPMI 1640 vækstmedium suppleret med føtalt bovint serum (10%) og ampicillin /streptomycin. Høj TBAR ox-LDL (90 nmol MDA /mg protein) blev indkøbt fra Biomedical Technologies Inc. (Stoughton, MA). Humant IgG blev købt fra Abcam (Cambridge, MA).

Real-Time kvantitativ PCR

Celler blev transficeret med enten tomme vektor eller

OLR1

ekspressionsvektor. Effektiviteten af ​​transfektion blev bekræftet i parallelle forsøg med GFP bærer plasmid. En del af de transficerede kulturer (alle i triplikater) blev behandlet med oxLDL (40 ug /ml) i 24 timer før høst og RNA-ekstraktion. RT qPCR blev udført under anvendelse af Applied Biosystems 7900 real-time PCR-system. qPCR specifikke primere blev designet ved hjælp af Probe-Finder (https://www.roche-appliedscience.com) web-baseret software. Alle qPCR reaktioner blev udført i et slutvolumen på 15 pi indeholdende 1 × af SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA), 300 nM af hver genspecifikke primere, 100 ng cDNA, i sterilt deioniseret vand. Standarden cykling tilstand var 50 ° C i 2 minutter, 90 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 62 ° C i 1 min. Resultaterne blev analyseret under anvendelse af SDS 2.3 relative kvantificering Manager-software. De sammenlignende tærskelværdier cyklusser værdier blev normaliseret til GAPDH referencenumre gener. qPCR blev udført tredobbelt for at sikre kvantitativ nøjagtighed. Salg

transfektionsprotokol

Celler blev transficeret med enten tom vektor eller

OLR1

cDNA-konstruktioner (Origene, Rockville, MD) under anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) i overensstemmelse med producentens instruktioner med mindre modifikationer. I indledende eksperimenter, vi bestemt, at højere transfektionseffektivitet opnås ved at anvende en 2:01 forhold af DNA til Lipofectamine i forhold til den planlagte fusion af DNA anbefales i den generelle protokol. Ved anvendelse af disse betingelser, vi rutinemæssigt observeret 70-80% transfektionseffektivitet.