PLoS ONE: Cykliske phosphatidsyre Stimulerer cAMP Produktion og Forhindrer Vækst i Human Colon Cancer Cells

Abstrakt

Tyktarmskræft er en malignitet, der udvikler sig i tyktarmen og endetarmen væv. Prognosen for metastatisk tyktarmskræft forbliver fattige, og nye terapeutiske muligheder er forpligtet til at reducere tyktarmskræft dødelighed. For nylig er intracellulære cAMP-niveauer blevet foreslået at påvirke adfærden hos cancerceller. Interessant nok cyklisk phosphatidsyre (CPA) og dets strukturelle analoger inhiberer vækst i mange cancercellelinier, og vores tidligere arbejde har antydet, at CPA øger cAMP-produktion. Phosphodiesterase (PDE) type 3 isoformer PDE3A og PDE3B udtrykkes hovedsageligt i kardiovaskulær væv og fedtvæv, hhv. Endvidere stigning i intracellulære cAMP-niveauer har været forbundet med inhiberingen af ​​væksten i colon cancerceller. Disse resultater antyder, at CPA kunne anvendes i colon cancerterapi. I denne undersøgelse fandt vi, at CPA hæmmede væksten af ​​HT-29-celler, der udtrykker høje niveauer af PDE3B, men ikke væksten af ​​DLD-1-celler, som udtrykker lave niveauer af PDE3B. Endvidere Cpa inhiberede phosphorylering af Akt i HT-29-celler på en dosis-afhængig måde. Vores resultater antyder, at PDE3B ekspression og intracellulære cAMP-niveauer er korreleret med spredning af colon cancerceller. Disse resultater viser for første gang, at CPA kan tjene som en nyttig et molekyle i målrettet terapi for tyktarmskræft

Henvisning:. Tsukahara T, Matsuda Y, Haniu H (2013) Cyklisk phosphatidsyre Stimulerer cAMP Produktion og hæmmer Væksten i Humane Colon Cancer Cells. PLoS ONE 8 (11): e81139. doi: 10,1371 /journal.pone.0081139

Redaktør: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, USA

Modtaget: Juni 22, 2013; Accepteret: 18 Oktober 2013; Udgivet: November 25, 2013 |

Copyright: © 2013 Tsukahara et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud-in-Støtte til videnskabelig forskning (C) 22.591.482 (til TT) fra Japan Society for fremme af videnskab, Grant-in-Aid fra Takeda Science Foundation (til TT), Astellas fundament for forskning i stofskiftesygdomme (til TT) og Nagano Society for Fremme af Science (til TT). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

cyklisk nukleotid-phosphodiesterase (PDE) er et enzym, der nedbryder phosphodiesterbindinger [1]. Hos mennesker er PDE’er kodet af 21 PDE gener [1], som er opdelt i 11 familier baseret på strukturel lighed såsom protein sekvenshomologi. PDE’erne udgør en gruppe af enzymer, der spalter phosphodiesterbindingen i second messenger cAMP, som spiller en central rolle i cellulære responser til forskellige ekstracellulære stimuli [2]. Intracellulær cAMP-niveauer reguleres normalt ved balancen mellem aktiviteterne i to typer enzymer, den cAMP-generering enzymer (adenylatcyclaser) og cAMP-nedbrydende enzymer (PDE’er), især som reaktion på hormoner og neurotransmittere [3] [4] . PDE3B blev identificeret hos mennesker og dets transkripter findes overvejende i fedtvæv [5], og PDE3B er blevet rapporteret at være phosphoryleret og aktiveres som reaktion på insulin og hormoner, der øger cAMP-niveauer [6]. Salg

Bioaktive lipider såsom cyklisk phosphatidsyre (CPA) [7] [8] er blevet foreslået at øge cellulære cAMP-niveauer og føre til RhoA inaktivering i hepatomceller [9]. Tidligere viste vi, at CPA reducerede intracellulære triglyceridniveauer og hæmmede PDE3B udtryk [8]. Desuden blev intracellulære cAMP-niveauer i 3T3-L1 celler sig at stige efter udsættelse for CPA. Disse resultater tyder på CPA-PDE3B-cAMP-vejen er en specifik molekylær mål. Phospholipase D2 (PLD2) genererer CPA fra lysophosphatidylcholin (LPC), og lavdosis insulinbehandling af celler stimulerer PLD2 aktivitet og øger intracellulære CPA niveauer [7].

For nylig PDE3 er blevet foreslået at spille en central rolle i cancercelleinvasion og cellemotilitet [10]. PDE3-inhibitorer, såsom cilostazol hæmmede væksten af ​​småcellet carcinomaceller [11], identificere PDE3 som et mål for anti-proliferative cancerterapi. Reduktion i PDE3B aktivitet ledsages af stigninger i intracellulære niveauer af cAMP, som aktiverer cAMP-afhængig proteinkinase A (PKA) [1]. I normale humane celler, cAMP fremmer proliferation og differentiering, men i kræftceller, cAMP påvirker spredning tydeligt og undertrykker basal spredning til niveauer betydeligt end i normale humane celler [12]. Endvidere kan høje intracellulære niveauer af cAMP effektivt reducerer in vitro vækst cancercelle [1].

Akt (Protein kinase B) har vist for nylig at dæmpe cAMP signalering ved at aktivere PDE3B [13]. Siden opdagelsen som et proto-onkogen har serin /threonin kinase Akt blevet en stor fokus for opmærksomhed, fordi Akt regulerer forskellige cellulære processer kritisk, herunder kræft progression [14]. I cancer, er Akt-aktivitet ofte forhøjet på grund af flere mekanismer, herunder tab af funktion af PTEN tumorsuppressorgen [15]. Når den er aktiveret, kan Akt phosphorylerer flere downstream molekyler involveret i regulering celledeling og undertrykke apoptose [16]. Akt signalering er forbundet med tumordannelse, og AKT inhibitorer er blevet udviklet til at styre cancervækst [14]. Men for tyktarmskræft, behandlingsmuligheder er i øjeblikket begrænset, fordi disse behandlinger producere uønskede kardiovaskulære og trombotiske virkninger [17]. Således må andre signalveje anses som kan anvendes til at udvikle nye terapeutiske strategier til at målrette tyktarmskræft. Interessant nok har CPA blevet rapporteret at producere anti-mitogene virkninger og forebygge cancercelleinvasion in vitro og metastase in vivo [18] [19].

Vi undersøgte ekspressionen af ​​PDE3 isoformer PDE3A og 3B i human coloncancer cellelinier HT-29 og DLD-1. Real-time polymerasekædereaktion (RT-PCR) og western blotting viste, at PDE3D var den eneste PDE3 isoform udtrykt i begge cellelinier. PDE3B mRNA og protein blev udtrykt i høje niveauer i HT-29-celler, og vi observeret, at PDE3B ekspressionsniveauer korrelerede med coloncancer celleproliferation. Vi fandt, at CPA behandling forhøjet intracellulær cAMP og undertrykte spredning af HT-29 celler. Endvidere Cpa inhiberede Akt phosphorylering i HT-29-celler på en dosis-afhængig måde. Sammen disse resultater tyder på, at CPA-PDE3B-cAMP vej spiller en kritisk i udviklingen af ​​tyktarmskræft

Materialer og metoder

Reagenser

CPA (18:. 1 ) blev købt fra Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL). Dexamethason blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Cilostazol, anti-PDE3B antistof (sc-20793), og anti-β-actin-antistof (sc-47.778) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-Akt (# 9272) og anti-Pakt S473 (9271S) blev købt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

Cell kultur

Menneskelig Tyktarmskræft cellelinjer HT-29, LOVO, og Caco-2 blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VS). DLD-1 humane adenocarcinom celler blev opnået fra Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japan). Celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM; Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) eller RPMI-1640 medium (Nacalai Tesque) indeholdende 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin, 10 ug /ml streptomycin, og 2,5 ug /ml plasmocin

TM (Nacalai Tesque) ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO

2.

Western blot-analyse

Celler blev podet i plader med 6 brønde (Iwaki, Tokyo, Japan) ved en densitet på 1 x 10

5 celler /brønd. Efter forskellige behandlinger (som angivet) blev celler lyseret på is i 30 minutter i en celle-lysis buffer (20 mM Tris-HCI [pH 7,4], 10% [vol /vol] glycerol, 100 mM NaCl, 1% [v /v] Triton X-100, 1/100 proteaseinhibitorcocktail [Sigma], 1 mM dithiothreitol) og centrifugeret ved 16.000 x

g

i 20 minutter ved 4 ° C. Supernatanterne blev gemt som cellelysater og analyseret for proteinindhold ved anvendelse af Bradford-metoden (Bio-Rad Protein Assay kit; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Cellelysater blev derefter separeret på 5% -20% natriumdodecylsulfat (SDS) -polyacrylamidgeler (e-PAGEL, Atto, Tokyo, Japan) og elektrooverført til Immobilon-P-membraner (Millipore, Billerica, MA). Membranerne blev blokeret i 1 time med Block Ace (DS Parma Biomedical Co Ltd, Osaka, Japan) og inkuberet med primære antistoffer fortyndet i TBS-T med 5% Block Ace i 12 timer ved 4 ° C. Proteinbånd blev visualiseret under anvendelse EzWestLumi plus (ATTO).

Kvantitativ realtids-PCR-analyse

Totalt cellulært RNA blev fremstillet under anvendelse NucleoSpin RNA II (Takara, Shiga, Japan), og 0,5 ug total RNA blev anvendt til syntetisering cDNA med ReverTra Ace qPCR RT Kit (Toyobo, Osaka, Japan) ifølge producentens anbefalinger. Vi målte mRNA niveauer ved hjælp af en ECO Real-Time PCR-system (Illumina Inc., San Diego, CA) og SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus (Toyobo) med følgende primerpar bliver brugt i reaktionerne: PDE3A, 5′ AAAGACAAGCTTGCTTGCTATTCCAAA-3 ‘(F) og 5′-GTGGAAGAAACTCGTCTCAACA-3′ (R); PDE3B, 5’-CCAGGTGTGCATCAAATTAGCA-3 ‘(F) og 5′-CAATGCCTTCTGTCCATCTCAA-3’ (R); 18S rRNA, 5’CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3 ‘(F) og 5′-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3’ (R). Alle PCR-reaktioner blev udført i et volumen 10 pi, ved anvendelse af 48-brønds PCR-plader (Illumina). Cykliseringsbetingelserne var 95 ° C i 10 min (enzymaktivering) efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 s, 55 ° C i 15 s og 72 ° C i 30 s. Efter amplifikation blev prøverne opvarmet langsomt fra 55 ° C til 95 ° C og fluorescensen blev målt kontinuerligt at opnå en smeltekurve. Relative mRNA-niveauer blev beregnet efter formlen 2

-ΔΔCq, hvor ΔCq er forskellen mellem tærsklen cyklus af et givet mål-cDNA og den af ​​en endogen henvisning cDNA. Udledning af formler og validering test er blevet beskrevet i Applied Biosystems User Bulletin No. 2.

Måling af celleproliferation

Celler blev podet i 96-brønds dyrkningsplader (5 × 10

3 celler /brønd) og inkuberet i 24 timer. Celleproliferation blev målt ved anvendelse af Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan): 10 pi celle Counting Kit-8-opløsning blev tilsat til mediet og inkuberet i 2 timer i en inkubator med 5% CO

2; mængden af ​​appelsin formazanfarvestof produceret blev beregnet ved at måle absorbansen ved 450 nm i en mikropladelæser (kendskab Technology, Inc., Palm City, FL).

cyklisk nukleotid-phosphodiesterase assay

aktivitet af rekombinant PDE3B tagget med GST (BPS Bioscience Inc., San Diego, CA) blev analyseret under anvendelse af en cyklisk nukleotid PDE assaykit (Enzo Life Science, Farmindale, NY) i 96-brønds plader og måle absorbansen ved 620 nm med et spektrofotometer ; assays blev udført ifølge producentens protokol.

Effekt af CPA på intracellulært cAMP-niveauet

Celler blev dyrket i serumfrit medium indeholdende CPA i 60 min. Cellulære cAMP-niveauer blev målt under anvendelse af ELISA (cAMP Biotrak Enzymimmunoanalyse systemet, Amersham Biosciences) i plader med 96 brønde og ved at bestemme absorbansen ved 450 nm med et spektrofotometer ved at følge producentens instruktioner.

RNA-interferens

Vi undertrykt PDE3B og Akt ekspression i HT-29-celler ved transfektion af cellerne med små interfererende RNA’er (siRNA’er) rettet PDE3B og Akt (Santa Cruz Biotechnology); Lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen) blev anvendt til transfektioner. Celler blev udpladet i 6-brønds plader (Iwaki) med en densitet på 5 x 10

4 celler /brønd i DMEM indeholdende 10% FBS og derefter transficeret med 100 pmol /ml mRNA-specifikke siRNA’er eller krypterede (kontrol) siRNAs . Reduktion af PDE3B og AKT-niveauer blev bekræftet ved western blotting.

Statistisk analyse

Studerendes

t

-test blev anvendt til statistiske sammenligninger. Forskelle blev betragtet signifikant på

s

0,05 niveau.

Resultater

PDE3 isoformer PDE3A og PDE3B er kendt for at blive udtrykt i mennesker [1]. For at evaluere funktionen af ​​PDE3 i humane coloncancer-celler anvendte vi 4 kolon cancercellelinjer, HT-29, LoVo, DLD-1, og Caco-2 (figur 1A), og undersøgt ekspressionen af ​​PDE3B protein i disse cellelinier . PDE3B blev udtrykt i høje niveauer i HT-29 og LoVo-celler.

Fire humane coloncancer-cellelinjer (HT-29, LOVO, DLD-1, og Caco-2-celler) blev dyrket i DMEM suppleret med 10 % FBS; proteinniveauer blev analyseret under anvendelse af SDS-PAGE og western blotting med et anti-PDE3B antistof og proteinbånd blev visualiseret ved anvendelse af et forøget kemiluminescens-reagens. Hver bane blev fyldt med 20 ug af helcelle-lysat. β-actin blev farvet som en loading kontrol. (B) Real-time PCR måling af ekspressionen af ​​PDE3A og 3B mRNA’er og 18S rRNA (intern kontrol) i HT-29 og DLD-1 celler (gennemsnit ± SEM, n = 3, ** p 0,01, Students

t

test). (C) Real-time PCR-analyse (til venstre) og western blotting (højre) til sammenligning PDE3B ekspression i HT-29-celler efter behandling med CPA (1, 3, og 10 uM) i 60 minutter (middelværdi ± SEM, n = 3 , ** p 0,01, Students

t

test)

for yderligere undersøgelser, valgte vi en cellelinje, der udtrykker høje niveauer af PDE3B, HT-29, og en celle. der udtrykker lave niveauer af PDE3B, DLD-1. Enig med proteinekspressionen resultater, PDE3B mRNA var også til stede ved højere niveauer i HT-29-celler end i DLD-1-celler (figur 1b). Derimod blev PDE3A mRNA ikke detekteres i enten cellelinier. Disse resultater antyder, PDE3B er den største PDE isoform i HT-29 og DLD-1-celler. Vi testede effekten af ​​CPA på ekspressionen af ​​PDE3B mRNA og protein i HT-29-celler (figur 1C), og fandt, at CPA ikke påvirkede PDE3B genekspression, tyder på, at CPA ikke producerer dens virkninger ved at mindske PDE3B udtryk i HT 29 celler. Dernæst undersøgte vi effekten af ​​CPA på intracellulære cAMP-niveauer i HT-29 og DLD-1-celler. Selvom cAMP enten kan fremme eller undertrykke proliferation i mange celletyper, i de fleste tilfælde cAMP synes at være anti-proliferative. Behandling med CPA forøgede cAMP-niveauer i det væsentlige i HT-29-celler, men ikke i DLD-1-celler (figur 2A). De ovennævnte resultater viste, at niveauet af PDE3B ekspression blev korreleret med spredning potentiale colon cancerceller. Interessant nok viste tidsforløb eksperimenter, CPA behandling inhiberede cAMP hydrolyse af PDE (figur 2B), hvilket antyder, at blokering PDE3 aktivitet med CPA forbedrer intracellulær cAMP-akkumulering. Imidlertid kan cAMP udøve sin antiproliferative virkning gennem distinkte mekanismer i forskellige cellelinier.

intracellulære cAMP-niveauer i kultur lysater blev målt ved anvendelse af cAMP Biotrak Enzymimmunoanalyse system. Cilostazol (5 uM; Cilo) blev anvendt som en positiv kontrol. Data er udtrykt som middelværdier ± SEM (n = 4), ** p 0,01. (B) Tidsforløb CPA hæmning af cAMP hydrolyse af PDE3B. PDE3B blev inkuberet med cAMP og 5′-nukleotidase med eller uden CPA (10 uM) i 10-50 min; PDE-inhibitoren IBMX (50 uM) blev anvendt som en positiv kontrol.

Virkningen af ​​CPA på celleproliferation blev bestemt under anvendelse af et kolorimetrisk assay. Vi fandt, at CPA inhiberede proliferationen af ​​HT-29 og LoVo celler, men ikke af DLD-1 og Caco-2-celler (figur 3A), der har lavere endogene niveauer af PDE3B end HT-29 og LoVo-celler [8]. For at teste, om PDE3B påvirker udbredelsen af ​​HT-29 celler, blev PDE3B udtryk slået ned ved hjælp siRNA’er. Den PDE3B-targeting siRNA slået ned PDE3B effektivt, som vist ved Western blotting med et anti-PDE3B antistof (figur 3B). Især 24 timer efter transfektion med PDE3B-siRNA, spredning af HT-29 celler faldet betydeligt. Disse resultater indikerer, at vælte PDE3B hæmmer væksten af ​​HT-29-celler. Salg

Celler (1 x 10

5 celler /brønd) blev podet i plader med 6 brønde og inkuberet i 24 timer eller 48 timer ved 37 ° C med 5% CO

2, hvorefter 10 pi af Cell Counting Kit-8-opløsning blev tilsat til mediet. Efter inkubering i 2 timer mere, genereret mængden orange formazanfarvestof blev bestemt ved måling af absorbansen ved 450 nm under anvendelse af en mikropladelæser. Data er udtrykt som middelværdier ± SEM (n = 4), ** p 0,01. (B) Knocking ned PDE3B udtryk i HT-29 celler. Totalt protein blev ekstraheret fra utransficerede celler og fra celler transficeret med kontrol siRNA eller PDE3B-specifikke siRNA og analyseret ved Western blotting med et anti-PDE3B antistof; β-actin blev farvet som en protein-loading kontrol. (C) Inhibering af cellevækst efter PDE3B knockdown blev målt ved anvendelse af Cell Counting Kit-8. Celler (1 x 10

5 celler /brønd) blev podet i plader med 6 brønde og inkuberet i 24 timer ved 37 ° C med 5% CO

2, hvorefter 10 pi af Cell Counting Kit-8-opløsning blev tilsat til mediet. Efter inkubering i 2 timer mere, genereret mængden orange formazanfarvestof blev bestemt ved opnåelse af absorbansen ved 450 nm under anvendelse af en mikropladelæser. Data er udtrykt som middelværdier ± SEM (n = 4), ** p 0,01.

Vores resultater antyder, at PDE3B niveauer korrelerer med celleproliferation satser, og at virkningen af ​​PDE3B afhænger af celletypen. Dernæst vi fastslået, om CPA hæmmer Akt fosforylering i HT-29 celler, fordi mange virkninger af cAMP medieres gennem aktivering af Akt [20] [21]. Akt er associeret med tumor-celleoverlevelse, proliferation, og invasivitet [22] [23]. At kontrollere, om CPA bidrager til virkningerne af Akt i HT-29-celler, testede vi, hvordan CPA påvirker Akt aktivering. Inhibering af Akt signalering er blevet forbundet med den biologiske virkning af kemo-forebyggende forbindelser, såsom epigallocatechingallat, hvilket markant undertrykker Pakt niveauer i intestinale tumorer uden at ændre total Akt niveauer væsentligt [24]. Akt aktivering involverer phosphorylering af to rester, Thr308 i aktiveringen loop og Ser473 i den C-terminale hydrofobe motiv; phosphorylering af Ser473 er ​​blevet undersøgt i vid udstrækning i tumorprøver som en indikator af Akt aktivitet [25]. Først undersøgte vi baseline Akt Ser473 fosforylering i HT-29 celler og fandt denne hjemmeside i Akt at være konstitutivt phosphoryleret (figur 4A). Desuden har vi fastslået, om CPA hæmmede Akt fosforylering i HT-29 celler. Vores resultater viste, at CPA blokeret den konstitutive phosphorylering af Akt på en dosis-afhængig måde (figur 4, A og B), og at denne CPA-medieret hæmning af Akt phosphorylering varede op til 120 min (figur 4C). Selvom CPA er en stabil lipid og 75% af molekylet kan forblive intakt i dyrkningsmedium i 24 timer [19], kan CPA omdannes til LPA ved åbningen af ​​ringstrukturen i CPA. Dette rejser muligheden for, at hydrolytisk spaltning af det cykliske phosphat ring af CPA med phospholipid phosphataser i HT-29-celler fører til dannelse LPA, hvilket kan aktivere Akt [26].

(A) Akt phosphorylering i HT 29 celler behandlet med CPA (1, 3, og 10 uM), NGF (50 ng /ml, positiv kontrol) eller dexamethason (Akt inhibitor, 25 uM). Phosphoryleret Akt (p-Akt) og total Akt blev påvist ved immunblotting. (B) De intensiteter Akt bånd blev kvantificeret, og forholdet af phosphoryleret til total Akt blev beregnet. Data er udtrykt som middelværdier ± SEM (n = 3), ** p 0,01. (C) HT-29-celler blev behandlet med CPA (10 uM) og lysater blev opsamlet ved 30, 60, 90, og 120 min. Akt inhibering blev målt som tab af Ser473-phosphorylering. (D) Knocking ned Akt udtryk i HT-29 celler. Totalt protein blev ekstraheret fra utransficerede celler og fra celler transficeret med kontrol siRNA eller Akt-specifik siRNA og analyseret ved western blotting med et anti-Akt antistof; β-actin blev farvet som en protein-loading kontrol. (E) intracellulære cAMP-niveauer i HT-29 behandlet med 1, 3 eller 10 uM CPA for 60 minutter efter Akt knockdown; cAMP-niveauer blev bestemt i cellelysater under anvendelse af cAMP Biotrak Enzymimmunoanalyse system. Data er udtrykt som middelværdier ± SEM (n = 3), ** p . 0.01

Endelig målte vi cAMP niveauer i HT-29 celler i nærvær og fravær af CPA efter banker ned Akt; western blotting med et anti-Akt antistof bekræftede, at Akt-targeting siRNA slået ned Akt ekspression effektivt i HT-29-celler (figur 4D). Især, CPA behandling af HT-29-celler med formindskede Akt niveauer undladt at øge cAMP-niveauer signifikant (figur 4E).

Diskussion

Lysophospholipid har længe været anerkendt som en membran phospholipid metabolit. For nylig har imidlertid den lysophospholipid opstået som et kandidatmolekyle til diagnostiske og farmakologiske formål, og LPA er blevet rapporteret at være en potent inducer af cancer progression på flere niveauer. Selvom CPA er kemisk ligner LPA, funktioner CPA er forskellige fra eller endda modsat dem af LPA. F.eks LPA stimulerer men CPA inhiberer celleproliferation og cancer-celleinvasion [19] [27] [9]. Desuden kan CPA undertrykker kræft invasion og øge intracellulære cAMP-niveauer [27]. PDE3 enzymer udgør en af ​​de mest omfattende undersøgt familier af cAMP-hydrolyserende PDE’er, fordi PDE3 enzymer spiller flere roller i fysiologiske og patofysiologiske processer i kræft [28]. I forbindelse med tyktarmskræft, PDE3-specifikke inhibitor cilostazol, som tidligere er blevet anvendt til behandling af patienter med thrombose, blev anvendt til at vurdere virkningerne af PDE3B inhibering på cellevækst. Proliferation af celler inhiberes af cAMP via diverse mekanismer, der kan inducere cellecyklus-standsning ved G1 og apoptose [29]. Imidlertid har den mekanisme, gennem hvilken PDE3B er involveret i intracellulær cAMP-produktion som respons på CPA forblev uklart. Vi har udført denne undersøgelse om kolon kræftceller bruger CPA, som tidligere var blevet vist sig at øge intracellulære cAMP niveauer direkte [8], en funktion af CPA, der også foreslået af anti-invasive egenskaber af CPA [9]. Vi fandt, at CPA hæmmede væksten af ​​HT-29 og LoVo-celler, der udtrykker høje niveauer af PDE3B, men ikke væksten af ​​DLD-1 og Caco-2-celler, som udtrykker lave niveauer af PDE3B. Støtter disse resultater, CPA inhiberede PDE3B aktivitet i celler, der udtrykker høje niveauer af PDE3B, og siRNA-medieret suppression af PDE3B ekspression inhiberede cellevækst. Disse resultater antyder, at PDE3B regulerer intracellulære cAMP-niveauer i colon cancerceller og er involveret i cancercellevækst. I denne undersøgelse fandt vi, at CPA inhiberede phosphorylering af Akt i HT-29-celler på en dosis-afhængig måde. Akt regulerer flere cellulære funktioner, herunder celle overlevelse og spredning og forskellige aspekter af mellemmand stofskifte. I neoplastiske colon epitel, blev Akt fundet at være ikke alene udtrykt ved højere niveauer, men også hyperaktiveret [30], og undersøgelser om kemiske modeller har bekræftet, at Akt er opreguleret i de tidlige stadier af tarm tumorigenese. PDE3B ekspression og intracellulære cAMP-niveauer er korreleret med en mangfoldighed potentiale colon cancerceller. Vi bekræftede vores resultater ved hjælp siRNA analyse og viste en formindskelse i pSer473-Akt med god korrelation mellem graden af ​​cAMP-produktion og nedregulering af Akt phosphorylering. Disse resultater tyder på, at Akt relaterede signalvej stramt er forbundet med CPA-PDE3B-cAMP vej og dermed indikerer for første gang, at CPA kan tjene som et nyttigt molekyle i målrettet terapi for tyktarmskræft.

Konklusioner

Vores resultater viser, at cAMP spiller en afgørende rolle i hæmning af tyktarmskræft cellevækst efter CPA. Baseret på vores resultater, foreslår vi, at belyse de molekylære mekanismer, som CPA fremkalder cAMP produktion ved at hæmme PDE3B i colon cancerceller kan give værdifuld indsigt, der hjælper forklare, hvordan kræft cellevækst reguleres. Forstå, hvordan cancercellevækst reguleres ville til gengæld hjælpe opklare molekylære mekanismer i kræft-celleinvasion og metastase og lette analysen af ​​signaltransduktionsvejene, der fører til celleproliferation. Selvom yderligere forskning er nødvendig for behandlingen af ​​krydstale mellem de signalmolekyler, vi har beskrevet her, vores resultater kollektivt støtter den potentielle anvendelse af CPA som en terapeutisk forbindelse til behandling af tyktarmskræft.