PLoS ONE: Shizukaol D, en dimer sesquiterpene Isoleret fra Chloranthus serratus, undertrykker væksten af ​​humane leverkræft Celler ved Modulerende Wnt Signalering Pathway

Abstrakt

Naturlige produkter er blevet kilder til udvikling af nye lægemidler til behandling af kræft. At søge kandidatforbindelser som inhiberer væksten af ​​leverkræft, komponenter af

Chloranthus serratus

blev testet. Her rapporterer vi, at shizukaol D, en dimer sesquiterpene fra

Chloranthus serratus

, udøvede en væksthæmning leverpåvirkning kræftceller i en dosis- og tidsafhængig måde. Vi viste, at shizukaol D inducerede celler til at undergå apoptose. Vigtigere, shizukaol D svækkede Wnt signalering og reducerede ekspressionen af ​​endogene Wnt målgener, hvilket resulterede i nedsat ekspression af β-catenin. Kollektivt, denne undersøgelse viste, at shizukaol D hæmmede væksten af ​​leverkræft celler ved at modulere Wnt vej

Henvisning:. Tang L, Zhu H, Yang X, Xie F, Peng J, Jiang D, et al. (2016) Shizukaol D, en dimer sesquiterpene Isoleret fra

Chloranthus serratus

, undertrykker væksten af ​​humane leverkræft Celler ved Modulerende Wnt Signalering Pathway. PLoS ONE 11 (3): e0152012. doi: 10,1371 /journal.pone.0152012

Redaktør: Chunming Liu, University of Kentucky, USA

Modtaget: December 19, 2015; Accepteret: 21 februar 2016; Udgivet: 24 marts 2016

Copyright: © 2016 Tang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. (. nr 81.301.855) Dette arbejde blev støttet af National Key Sci-Tech Special Project Kina (2013ZX10002010) og National Natural Science Foundation of China . De finansieringskilder denne undersøgelse ikke havde nogen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Leverkræft er den tredje hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1]. Hos patienter med leverkræft, kirurgiske behandlinger tilbyder en høj grad af komplet respons og tilbyde et potentiale for helbredelse [2]. Dog kan tumor resectability være begrænset af tumor omfang, placering og underliggende leverdysfunktion på sene stadier af sygdommen; som sådan, resektion er kun lade sig gøre i et mindretal af patienterne [3]. Til dato, i patienter med fremskreden hepatocellulært carcinom (HCC), kun sorafenib har vist sig at øge den samlede satser for overlevelse effektivt [4]. Selv i USA, er forekomsten af ​​hepatocellulært carcinom tredoblet, mens 5-års overlevelse er forblevet under 12% [5]. Således er et presserende behov for alternative strategier til behandling af denne aggressive tumortype.

I de senere år har et stigende antal efterforskere er blevet interesseret i at screene naturlige produkter for potentielle anticancer-midler, herunder kinesiske lægeurter (CMH) .

Chloranthus serratus

, der hører til familien

chloranthales

, er en flerårig urt, der primært fordelt over hele det nordlige Kina, Korea og Japan. På grund af sit ry lette blodcirkulationen og sprede blod immobilitet, har en række forbindelser blevet isoleret fra

Chloranthus serratus

, herunder threo-1- (1-methoxy-2-hydroxypropyl) -2-methoxy-4 , 5-methylendioxybenzen og erythro-1- (1-methoxy-2-hydroxypropyl) -2-methoxy-4,5-methylendioxybenzen [6], serralabdanes A-E [7] og serratustones En -B [8]. Lindenane-type sesquiterpenoider indregnes som den karakteristiske taksonomiske symbol på

chloranthales

familie. Mange af disse sesquiterpenoider udviser gunstige antiinflammatoriske bioaktiviteter. For eksempel, chloramultilide B besidder hæmmende aktiviteter mod

Candida albicans

Candida parapsilosis

med MIC værdier lig med 0,068 mmol /l [9]. Udover at evaluere deres anti-inflammatoriske virkninger, har flere undersøgelser fokuseret på aktiviteter sesquiterpenoider på kræftceller. Den dimere sesquiterpenoid- cycloshizukaol A har vist sig at markant inhibere ICAM-1-ekspression i HL-60-celler på en dosisafhængig måde [10], og antrocin, en sesquiterpenlacton, inducerer apoptotisk celledød af human blærecancer 5637 cellelinier via både ydre og indre signalveje [11]. Den væksthæmmende effekter af xanthorrhizol, en sesquiterpenoid- fra rhizomet af

Curcuma xanthorrhiza

mod human tyktarmskræft HCT116 celler, er relateret til cellecyklus arrest og induktion af apoptose [12].

Shizukaols er en serie af typiske sesquiterpenoid- dimer derivater. Shizukaol A blev først isoleret fra

Chloranthus japonicus

i 1990 [13]. Shizukaol D (som vist i figur 1) er blevet isoleret fra

Chloranthus serratus

[14]. Tidligere undersøgelser af bioaktivitet shizukaol D er yderst begrænset, og har primært fokuseret på sine anti-inflammatoriske aktiviteter [15]. Det har også vist sig at hæmme AMPK-afhængig lipidindhold i hepatiske celler [16] og øge glucose forbrug i L6-celler [17].

I denne undersøgelse forskellige isolationer fra

Chloranthus serratus

blev testet for deres virkninger på kræftceller. Ud fra disse isolationer blev shizukaol D sig at inducere væksthæmning og dæmpe Vingeløse-Int (Wnt) pathway signalering i lever kræftceller.

Materialer og metoder

Kemi og plasmider

Shizukaol D (figur 1) blev isoleret fra

Chloranthus serratus

ifølge en tidligere publiceret metode [14] af Bio Bli Ltd.com. Efter denne blev forbindelsen fremstillet som en 100 mmol /l stamopløsning i dimethylsulfoxid (DMSO) og opbevaret ved 4 ° C. De primære antistoffer, der blev anvendt i western blotting inkluderet antistoffer til PARP (Cell Signalling), LRP (Cell Signalling), p-LRP (Cell Signalling), Dvl2 (Cell Signalling), Axin2 (Cell Signalling), β-catenin (BD) GSK-3β (Cell Signalling), p-GSK-3β (Cell Signalling), β-actin (Sigma) og GAPDH (Abmart). En vildtype β-catenin plasmid (wt-β-catenin) blev fremstillet ved at indsætte et gen, der koder β-catenin i en pcDNA3.0 plasmid, hvorimod en mutant β-catenin plasmid (mut-β-catenin) blev fremstillet ved at indsætte en gen, der koder β-catenin med mutationer ved S33A, S37A og T41A i pcDNA3.0.

cellelinjer og cellekultur

Den menneskelige kræftceller SMMC-7721, SK-HEP1 og HepG2, blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). Yderligere cellelinjer, herunder Focus, HEK-293T, L Wnt-3A og QGY-7703, blev købt fra Institut for Cell Bibliotek Kina. SMMC-7721, Focus, og HepG2-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles Medium (DMEM, Invitogen) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibico), og SK-HEP1 og QGY-7703-celler blev dyrket i RPMI-1640 medium (Invitogen) suppleret med 10% FBS. L Wnt-3Awas dyrket i DMEM med G418 til opnåelse Wnt3a konditioneret medium. Alle cellerne blev dyrket ved 37 ° Cin en fugtig inkubator med 5% CO

2.

CCK-8 assay

cellereaktioner på shizukaol D blev vurderet ved anvendelse af 2- (2 methoxy-4-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium mononatriumsalt i en modificeret CCK-8 cellulær proliferation assay kit (Roche Diagnostics, IN). Celler blev udpladet i plader med 96 brønde og derefter eksponeret for en række shizukaol D koncentrationer i varierende tidsrum. Dyrkningsmediet blev fjernet før tilsætning af 90 pi frisk medium (uden FBS) og 10 pi Cell Counting Kit-8-opløsning til hver brønd. Pladerne blev inkuberet i yderligere 2 timer ved 37 ° C, hvorefter absorbansen blev målt ved 450 nm under anvendelse af en mikropladelæser (model 550, Bio-Rad, CA). Procentdelen af ​​inhibering i forhold til en ubehandlet kontrol illustreret. Hvert forsøg blev udført mindst tre gange uafhængigt af hinanden.

Evaluering af sub-G1 celler

Focus celler blev plantet i 6-brønds plader og inkuberet i DMEM med 0, 12,50, 25,00 eller 50,00 pmol /l Shizukaol D i 48 timer. DMEM med 1,00% DMSO blev anvendt som kontrol. Cellerne blev fikseret og farvet i phosphatbufret saltvand (PBS, 140 mmol /l NaCl, 2,7 mmol /L KCI, 10 mmol /l Na

2HPO

4 og 1,8 mmol /l KH

2PO

4, pH = 7,4) indeholdende 50 ug /ml propidiumiodid og 0,03% Triton X-100 før de analyseres ved flowcytometri (FCM, FAC Star Plus, Mod-Fit LT V2.0, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ ).

Kolonidannelse assay

celler blev behandlet med 3,13, 6,25, 12,50 eller 25,00 pmol /L Shizukaol D i 48 timer, før de udpladet i 6-brønds plader ved en densitet på 500 celler per brønd og dyrket i normale medier i 7-10 dage, indtil dannede kolonier, der indeholdt mere end 50 celler. En opløsning af 0,1% DMSO blev sat som en kontrol. Efter fiksering med 4% polymethanol i 10 minutter blev kolonierne farvet med 1,0% krystalviolet i 30 minutter.

Western blot-analyse

Celler blev lyseret i Cell Lysis buffer (Cell Signaling). Efter centrifugering blev supernatanter høstet, og totalt protein blev underkastet 10% SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran (GE). Membranen blev blokeret med 5% skummetmælk i 1 time, inkuberet natten over ved 4 ° C med primære antistoffer, og derefter inkuberet med sekundære antistoffer. Antistofbinding blev påvist under anvendelse forøget kemiluminescens (GE). Membranen blev farvet med Ponceau S (Sigma) og probet med β-actin eller GAPDH-antistof for at bekræfte ækvivalent lastning og protein overførsel.

Immunfluorescensfarvning

Celler i kultur blev fikseret i 4% paraformaldehyd i 10 minutter. Herefter blev cellerne behandlet med 0,2% Triton X-100 i PBS i 20 minutter. Cellerne blev yderligere inkuberet natten over ved 4 ° C med antistoffer specifikke for p-catenin (BD) og vasket med PBS tre gange før inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur med sekundære antistoffer. Efter vask med PBS blev dækglas (der indeholdt celler) monteres derefter i DAPI-holdige monterings medier (Beyotime, CN) og afbildes på et Zeiss konfokal mikroskop.

Luciferase reporter assay

HEK -293T celler blev dyrket i medier indeholdende 20 mmol /l af LiCI før transficeret med Wnt signaling reportere TOPflash eller FOPflash som tidligere beskrevet [18]. Herefter blev cellerne behandlet med 6,25 eller 12,50 pmol /L shizukaol D i 24 timer. Renilla plasmid blev inkluderet i alle de relaterede transfektioner. Dataene er vist som normaliserede top /FOP Flash-værdier.

Kvantitativ real-timePCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra dyrkede celler under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen), og DNA blev fjernet ved DNase (Promega) . Revers transkription blev udført under anvendelse SuperscriptII revers transkriptase (Takara). Kvantitativ realtids-PCR (QPCR) blev udført under anvendelse SYBR Green I-farvning (Takara) på en iCycleri QTM-system (BioRad) ifølge fabrikantens protokoller. Genekspressionsniveauer blev normaliseret til de interne GAPDH niveauer. Betingelserne var som følger:. 38 cykler af tre-trins PCR (95 ° C i 40 s, 60 ° C for 50s, og 72 ° C i 30 s) efter indledende denaturering (95 ° C i 5 minutter)

Statistik

data præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse var mindst tre sæt uafhængige forsøg. T-test-analyse blev anvendt til at bestemme betydningen af ​​statistiske forskelle. Forskellene blev beregnet ved SPSS og anses for signifikant ved P. 0,05

Resultater

Vækst hæmning af human lever kræftceller ved shizukaol D

Denne undersøgelse blev indledt for at teste cytotoksicitet af naturlige produkter er isoleret fra

Chloranthus serratus

i forskellige typer af kræftceller. Shizukaol D (figur 1) var den mest effektive forbindelse blandt dem, der er blevet rapporteret. Flydende fase kromatografi assay (S1 Fig), MHz assay (S2 Fig) og HPLC (S3 Fig) bekræftede strukturen af ​​shizukaol D og dets renhed. En CCK-8 assay blev efterfølgende brugt til at verificere væksthæmning effekt shizukaol D på liver cancerceller, herunder Focus, HepG2, QGY-7703, SMMC-7721 og SK-HEP1 cellelinjer, i forskellige koncentrationer (0-200 pmol /L). Cellerne udviste forskellig følsomhed over for shizukaol D (tabel 1). Som en positiv kontrol, IC

50 af doxorubicin (Dox) på Focus celler måltes at være 0.23μmol /l, og IC

50 af 5-FU (5-fluoruracil), som var en almindeligt anvendt agent for maligne fordøjelseskanalens tumorer [19], blev målt til at være mere end 20 pmol /L.

på grund af deres forholdsvis større følsomhed over for shizukaol D, Focus celler og SMMC-7721 blev anvendt i efterfølgende eksperimenter. Vi har registreret de væksthæmmende effekter af shizukaol D med stigende koncentrationer. Udbredelsen af ​​begge celler var i høj grad påvirket af behandling af shizukaol D ved lave koncentrationer, og denne virkning var mere indlysende følgende dosisøgning (Fig 2A). Væksten af ​​Focus celler med shizukaol D behandling faldt også i en tidsafhængig måde. Celleproliferationen udviste et gradvist fald en løbet af 96 timer efter behandling med shizukaol D med koncentrationer på 12,50 pmol /L og 25,00 pmol /l, med DMSO som en negativ kontrol (fig 2C). Samme tendens blev også observeret i SMMC-7721-celler (Fig 2D). Med den øgede koncentration af shizukaol D, Focus celler blev runde, flød og endda død i lyse felt (fig 2E). Endvidere kolonidannelse assayet viste, at kolonidannelse i SMMC-7721 celler blev reduceret med eksponering for stigende koncentrationer af shizukaol D (fig 2F og 2G). Kolonier af SMMC-7721 celle var knap påviselige når koncentrationen af ​​shizukaol D nåede 12,50 mmol /l, som foreslog en forringet spredning evne af celler med shizukaol D behandling (Fig 2F og 2G). Interessant virkningen af ​​shizukaol D på SMMC-7721 celler var mere end 5-FU (5-fluoruracil), især når koncentrationer på over 6,25 mmol /l blev anvendt (Fig 2B). Sammenfattende viste disse resultater, at shizukaol D inhiberede væksten af ​​lever cancerceller.

(A-D). Celler blev frø i en plade med 96 og behandles med en serie koncentration af shizukaol D. Celleproliferation blev målt ved CCK-8 assay. (A) levedygtighed Focusand SMMC-7721cells blev nedsat, når cellerne blev behandlet med stigende koncentration af shizukaol D for 48 timer. (B) Levedygtigheden faldt hurtigere, når de behandles med shizukaol D behandlet med samme koncentration af 5-FU i SMMC- 7721 celler i 48 timer. Cellelevedygtigheden faldt i Focus (C) og SMMC-7721 (D) celler behandlet med shizukaol D på en dosis- og tidsafhængig måde. (E) Den transparente version af Focus celler behandlet med 0,00, 12,50, 25,00 og 50,00 pmol /l shizukaol D i 48 timer. (F) Kolonidannelse assay af SMMC-7721 celler. Cellerne blev behandlet med 0,00, 3,13, 6,25, 12,50 og 25,00 pmol /l shizukaol D i 48 timer og celler for hver koncentration blev opsamlet henholdsvis og udpladet i plader med 6 brønde som 500 /brønd. Cellerne blev dyrket med normalt medium i 10 til 15 d derefter. (G) Statistik for kloning effektivitet i figur 2F. **: P 0,01. Værdier præsenteres som gennemsnit ± SD

Shizukaol D-induceret apoptose i leveren kræftceller

Bright-field billeder af celler viste, at shizukaol D induceret øget celledød med koncentrationsgradienter, der nødvendiggør os, at shizukaol D kan føre til celle apoptose. Vi testede adskillige apoptose markører i lever kræftceller, der blev behandlet med shizukaol D ved koncentrationer på 0-50 pmol /L shizukaol D. Resultaterne indikerede, at sub-G1-forhold på Focus celler, som blev inkuberet med shizukaol D steg fra 7,49 ± 0,59 til 21.38 ± 1.80 (fig 3A). Sub-G1 er et højdepunkt del forud for G1 højdepunkt i FCM, hvilket indebærer dannelsen af ​​apoptotiske krop. Western blotting bekræftede, at spaltede PARP blev observeret, når koncentrationen af ​​shizukaol D opnåede og over 12.50μmol /l, mens mængden af ​​pro-PARP faldt (figur 3B). Således blev væksthæmmende funktion shizukaol D medieret via induktion af apoptose.

(A) Statistikken på sub-G1-forhold på Focus af FCM. Celler blev inkuberet med shizukaol D i 48 timer før den blev opsamlet og fortyndet i PBS med 50 ug /ml PI og 0,03% Triton X-100. **: P 0,01. Værdier er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse. (B) Western blot-analyse af ekspressionen af ​​PARP. Fokus-celler blev behandlet med shizukaol D for 48 hbefore indsamlet og derefter det totale protein blev underkastet 10% SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembranen. β-actin antistof blev brugt til at bekræfte tilsvarende belastning.

Shizukaol D svækket den Wnt pathway

At udforske den mekanisme ligger til grund for apoptose blev flere signalveje evalueret ved brug luciferase reporter assays. Opmuntrende, β-catenin /Tcf4 reporter aktivitet, som blev målt med reportergener huser Tcf4-bindingssteder, hovedsagelig faldt som reaktion på shizukaol D behandling (Fig 4A). I 20-40% af HCC patienter, β-catenin viser dets nukleare ophobning og potentiel opreguleret aktivitet [20]. β-catenin er et af kendetegnene for Wnt /β-catenin-aktivering og den mest ligetil fremgangsmåde til inhibering Wnt-vejen er at målrette β-catenin af siRNA [21]. Interessant nok i vores undersøgelse, viste Western blot-analyse β-catenin-niveauer blev reduceret på en dosis- og tidsafhængig måde i både Focus (Fig 4B) og SMMC-7721 (Fig 4C) celler. Denne reduktion i proteinniveauer blev yderligere bekræftet ved immunofluorescens (Fig 4D). Desuden vi opdaget flere afgørende mediatorer af Wnt signalvejen og fundet den konsekvent nedregulering af Dishevelled 2 (Dvl2) og Axin2 (Fig 4E). Derudover phosphorylering af co-receptor LRP6 viste en reduktion i proteinniveauer. Imidlertid GSK-3β, en negativ regulator som bidrager til p-catenin-nedbrydning, ændrede sig ikke. Endelig har vi undersøgt de Wnt signal pathway target gener ved real-time PCR (QRT-PCR). C-myc, cyklin D, TCF-1 blev LEF1, Wnt3a og FGF18 signifikant undertrykt af shizukaol D, selv på tidligere tidspunkt (Fig 4F), hvilket bekræfter hæmmet β-catenin-aktivitet. Alt i alt viser resultaterne ovenfor påvist shizukaol D tilbageholder celleoverlevelse gennem undertrykke Wnt /β-catenin pathway aktivitet.

(A) Shizukaol D faldt TOPflash aktivitet og svækket TOPflash aktivitet i HEK-293T-celler dyrket i RPMI-1640 medium indeholdende 50 mmol /l LiCI. Renilla plasmid blev inkluderet i alle de transfektioner som kontrol. (BC) Western blot analyse af ekspression af β-catenin ekspression i Focus (B) og SMMC-7721 (C) celler behandlet med shizukaol D. (D) Immunofluorescensanalyse af β-catenin i lever cancerceller med 10μmol /L shizukaol D behandling i 24 timer. Rød: farvning for aktiv β-catenin, blå: nuklear farvning af DAPI. Øvre: Focus celler; lavere: SMMC-7721 celler. (E) Western blot-analyse af ekspressionen af ​​endogene Wnt målgener. SMMC-7721 celler blev behandlet med 20μmol /L shizukaol D i 24 timer før collectedand GAPDH blev sat som kontrol. (F) mRNA-ekspression niveau af endogene Wnt målgener, c-myc, cyclin D, TCF-1, LEF1, Wnt3a og FGF18, efter QPCR. Totalt RNA af SMMC-7721 celler blev isoleret efter behandlet ved 20μmol /L shizukaol D for 6 eller 12 timer, og derefter blev transskriberet omvendt til cDNA. GAPDH blev sat som kontrol. **: P 0,01. Værdier er præsenteret som gennemsnit ± SD

Wnt-aktivering kompenseret for levedygtighed leverkræft celle

Der er talrige måder at aktivere Wnt-vejen, såsom at tilføje Wnt3a protein til celledyrkningsmedier eller forøgelse af ekspressionen af ​​β-catenin. Levedygtighed SMMC-7721 celler steg, da de blev dyrket med Wnt3a-condition medier, uanset om de samtidig blev inkuberet med 6,25 eller 12,50 pmol /l shizukaol D, selvom cellen levedygtighed ikke nåede niveauet for kontrol ( fig 5A). En alternativ fremgangsmåde til aktivering af Wnt-vejen er via transfektion med plasmid, der udtrykker β-catenin. Efter inkubering i 12,5 pmol /l shizukaol D i 48 timer, levedygtighed SMMC-7721 celler, som var blevet transficeret med plasmider, der udtrykker enten wt-β-catenin eller mut-β-catenin kraftigt i forhold til celler transficeret med en tom bærer (plasmid pcDNA3.0). Western blot viste wt-β-catenin eller mut-β-catenin transfektion producerede forøgede β-catenin proteiner end kontrol i SMMC-7721 celler (figur 5B). Endvidere er de celler, der var transficeret med mut-β-catenin plasmid udviste lidt højere levedygtighed end dem transficeret med wt-β-catenin. Disse resultater antyder, Wnt-aktivering kompenserer for levedygtighed for leverkræft celler, som blev behandlet ved shizukaol D.

Actviation af Wnt-vejen reddet hæmmende virkning af shizukaol D på liver cancer celler. (A) Cellen levedygtighed SMMC-7721-celler behandlet med shizukaol D øges, når inkuberet med Wnt3a konditioneret medium. (B) Cellen levedygtighed SMMC-7721-celler behandlet med shizukaol D øges, når transficeret med wt-β-catenin eller mut-β-catenin. Ekspressionen af ​​β-catenin-protein af tilsvarende prøve blev analyseret ved western blots og illustreret nedenfor. β-actin monoklonalt antistof blev anvendt til at bekræfte tilsvarende belastning.

Diskussion

Naturprodukter bliver ofte kilder til nye lægemidler [22]. Fra 1940’erne til i dag, i alt 85, eller 48,6%, af de terapeutiske midler, der er blevet godkendt af FDA og lignende organisationer til behandling af cancer var enten naturlige produkter eller derivater af naturprodukter [23]. Her viste vi, at shizukaol D, en dimer sesquiterpene isoleret fra

Chloranthus serratus

, induceret væksthæmning i lever kræftceller. Kun en enkelt tidligere rapport har drøftet cytotoksicitet shizukaol D, hvor cytotoksicitet af ekstrakter isoleret fra

Chloranthus japonicus

blev evalueret, og IC

50 værdi shizukaol D mod SMMC-7721 viste sig at være 13,71 ± 1,68 mmol /l [24]. I denne undersøgelse blev IC

50 værdi shizukaol D mod SMMC-7721 fundet at være 8,82 ± 1.66μmol /l, hvilket var tæt på resultaterne af den foregående rapport og bevist pålideligheden af ​​vores metoder.

Endvidere har vi testet en række liver cancer celler og fandt, at vækstinhibering, der induceres af shizukaol D var både dosisafhængig og tidsafhængig (figur 2). Adskillige leverkræft cellelinjer udstillet højere følsomhed over for dette stof, især Fokus celler. Den inhiberende virkning af shizukaol D på liver cancerceller var i overensstemmelse med resultaterne af kolonidannelse effektivitet (Fig 2F og 2G) .Den vækstinhibering, der var forårsaget af shizukaol D blev signifikant sammenlignet med den fremkaldt af 5-FU, især når koncentrationer oversteg 6,25 pmol /L (fig 2B). 5-FU er en pyrimidin-analog, der er blevet anvendt til behandling af cancerpatienter; det er blevet administreret systemisk til behandling af anal, bryst, hud, øsofageale, mave, pancreas og kolorektal kræft. Selvom cytotoksiciteten, der induceres af shizukaol D ikke var robust på 24 timer efter behandling, er det stadig oversteg induceret af 5-FU og derfor optimering af shizukaol D kan tjene som et lovende retning til udvikling af nye antitumormidler.

for at afdække den mekanisme der ligger bag den observerede væksthæmning blev et luciferase reporter, der anvendes til at vurdere variansen i forskellige celle signalveje, der er involveret i celledeling. Resultaterne indikerede, at shizukaol D svækkede Wnt pathway signalering (Fig 4A) på en måde svarende til XAV939, som har vist sig at være en potent inhibitor af Wnt /β-catenin signalering [25]. Wnt-vejen er et centralt udviklingsbane der også er involveret i patogenesen af ​​mange forskellige typer cancer [26], og det udgør en potentiel målrettet vej for terapeutisk intervention i patienter med HCC [27]. Næste generation sequencing (NGS) har afsløret, at Wnt signalvejen er en vigtig onkogen driver i HCC patienter [28]. Wnt signalvejen er også involveret i apoptose i cytopatiske celler. In vivo IFN-a2b behandling inhiberer Wnt /β-catenin /TCF-vejen og fremmer programmeret celledød [29]. To Wnt signaling pathway komponenter, AXIN2 og FRA1, fandtes at udstille reduceret ekspression under hepatisk stjerneformet celle apoptose [30]. I vores undersøgelse shizukaol D steg forholdet mellem sub-G1 celler, som er produkter af apoptose (fig 3A), samt mængden af ​​89kD spaltet PARP (Fig 3B), som er et substrat for apoptose-relaterede protease caspase 3 [31]. Udtrykkene for Wnt pathway målgener, såsom C-myc, cyclin D, TCF-1, LEF1, Wnt3a, FGF18, blev signifikant undertrykt ved shizukaol D (Fig 4E). Disse data antydede, at celledød og apoptosis i leverkræft celler behandlet med shizukaol D blev forbundet med svækkelse af Wnt-vejen.

Desuden western blotting viste, at ekspressionen af ​​β-catenin i leverkræft celler faldt i både en tids- og dosisafhængig måde (fig 4B og 4C) .Den β-catenin-protein, som kodes af CTNNB1 genet, spiller en vigtig rolle i kanonisk Wnt pathway signalering. I mangel af Wnt-signalering, er det cytosoliske protein β-catenin målrettet og nedbrydes af et multi-protein kompleks, som omfatter axin1, APC, GSK3b og CK1 [32]. Aktivering af Wnt signalering kaskade forstyrrer β-catenin-nedbrydning kompleks, derefter β-catenin-proteiner akkumulerer i cytoplasmaet og translokeres ind i kernen. Nukleare β-catenin virker som en transkriptionsfaktor aktiverende nedstrøms målgener, såsom c-myc, cyclin D1 [33, 34] og suvivin [35]. Et fald i β-catenin udtryk ledsaget leverkræft cellevækst hæmning, der er fremkaldt ved shizukaol D behandling, hvilket indebar, at væksthæmning skyldtes modulation af Wnt-vejen.

For at bestemme, om aktivering af Wnt vej før at shizukaol D behandling reddet de observerede virkninger blev to forskellige metoder anvendt i denne undersøgelse for at aktivere sti: lever kræftceller blev dyrket i Wnt3a aircondition medier eller blev alternativt transficeret med plasmider, der koder β-catenin. I begge tilfælde cellelevedygtighed øges efter behandling med shizukaol D (Fig 5A og 5B). Cellelevedygtighed efter transfektion med wt-β-catenin var lidt faldt sammenlignet med transfektion med mut-β-catenin, hvilket kan skyldes S33A, S37A og T41A er GSK3 regulerende kassetter [36] og er sårbare over for shizukaol D. imidlertid Wnt-vejen aktivering ikke kompensere for virkningerne af shizukaol D i lever kræftceller fuldt ud og derfor yderligere mekanismer for væksthæmning kan tage effekter på samme tid. Opsvinget af levedygtighed i lever kræftceller, der blev behandlet med shizukaol D efter aktivering af Wnt signalering bekræftet, at Wnt vej er et potentielt mål for shizukaol D og undertrykkelse af Wnt vej af forbindelsen fører til reduktion af spredning og overlevelse af leverkræft celle linjer.

Naturlige forbindelser har vist sig at være nyttige både enkeltvis og i kombination med almindelige behandlinger i at forebygge tumor progression og behandling af humane maligniteter [37]. Baseret på vores resultater, shizukaol D, en dimer sesquiterpene isoleret fra

Chloranthus serratus

, kan tjene som en potentiel kandidat til behandling af leverkræft, selv om identifikationen af ​​dens direkte mål kræver yderligere undersøgelser.

konklusioner

sammenfattende viste vores data, at shizukaol D udøvede en hæmmende effekt på væksten af ​​leverkræft celler på en dosis- og tidsafhængig måde, som var i en del som følge af graduering af den Wnt signalvejen.

Støtte Information

S1 fig. Massen spectrometryof shizukaol D.

doi: 10,1371 /journal.pone.0152012.s001

(TIF)

S2 Fig. Den 1H NMR spektre af shizukaol D.

doi: 10,1371 /journal.pone.0152012.s002

(TIF)

S3 Fig. HPLC af shizukaol D.

doi: 10,1371 /journal.pone.0152012.s003

(TIF)

Tak

Dette arbejde blev støttet af National Key Sci-Tech Special Project Kina (2013ZX10002010) og National Natural Science Foundation of China (nr. 81.301.855). De finansieringskilder denne undersøgelse ikke havde nogen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.