PLoS ONE: Prækliniske terapeutiske potentiale af en nitrosylerende middel til behandling af æggestokkene Cancer

Abstrakt

Dette studie undersøger den rolle, s-nitrosylering i væksten af ​​kræft i æggestokkene ved hjælp af cellekultur baserede og

i vivo

tilgange. Ved hjælp af nitrosylerende agent, S-nitrosoglutathion (GSNO), en fysiologisk nitrogenoxid molekyle, viser vi, at GSNO behandling hæmmede spredning af chemoresponsive og kemoterapi æggestokkene kræft cellelinier (A2780, C200, SKVO3, ID8, OVCAR3, OVCAR4, OVCAR5, OVCAR7, OVCAR8, OVCAR10, PE01 og PE04) på ​​en dosisafhængig måde. GSNO behandling ophævet vækstfaktor (HB-EGF) induceret signaltransduktion, herunder phosphorylering af Akt, p42 /44 og STAT3, som vides at spille kritiske roller i æggestokkene cancervækst og progression. For at undersøge det terapeutiske potentiale af GSNO

in vivo

, nøgne mus med intra-peritoneale xenotransplantater af humant A2780 ovariekarcinom cellelinie (2 × 10

6) blev indgivet oralt GSNO i doser på 1 mg /kg legemsvægt. Daglig oral indgivelse af GSNO betydeligt svækkede tumormasse (p 0,001) i bughulen sammenlignet med bærer (phosphatbufret saltvand) behandlet gruppe på 4 uger. GSNO også potenseret cisplatin medieret tumor toksicitet i en A2780 ovariekarcinom nøgen musemodel. GSNO s nitrosylerende evne blev afspejlet i den inducerede nitrosyleringen af ​​forskellige kendte proteiner, herunder NFKB p65, Akt og EGFR. Som en ny fund, vi observeret, at GSNO også induceret nitrosylering med omvendt forhold på tyrosin 705 fosforylering af STAT3, en etableret spiller i kemoresistens og celledeling i kræft i æggestokkene og i kræft generelt. Samlet set vores undersøgelse understreger betydningen af ​​S-nitrosylering af centrale kræft fremme proteiner i modulerende ovariecancer og foreslår det terapeutiske potentiale nitrosyleringsmidler (som GSNO) til behandling af kræft alene eller i kombination med kemoterapeutiske stoffer i æggestokkene.

Henvisning: Giri S, Rattan R, Deshpande M, Maguire JL, Johnson Z, Graham RP, et al. (2014) Prækliniske terapeutiske potentiale af en nitrosylerende middel til behandling af kræft i æggestokkene. PLoS ONE 9 (6): e97897. doi: 10,1371 /journal.pone.0097897

Redaktør: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, Taiwan

Modtaget: Januar 7, 2014 Accepteret: April 24, 2014; Udgivet: Juni 2, 2014

Copyright: © 2014 Giri et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde understøttes af Marsha Rivkin Scholar tilskud og Department of Defense OCRP award W81XWH-12-1-0270 til SG. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene (OvCa) er den femte mest almindelige dødsårsag fra alle kræfttilfælde blandt kvinder i USA og den hyppigste dødsårsag fra gynækologiske maligniteter [1]. De høje dødelighed forbundet med OvCa skyldes størstedelen af ​​patienterne (75%) præsentation med udbredt (stadium III eller højere) sygdom på diagnosetidspunktet [2]. De fattige 5-års overlevelse (30%) skyldes det faktum, at de fleste OvCa s er ubrugeligt på tidspunktet for diagnosen. Hvis de opdages tidligt, mere end 90% af patienterne har en bedre prognose og svare terapi sammenlignet med patienter med en fremskreden fase af sygdommen. Følgelig kan en bedre forståelse af centrale molekylære begivenheder spille vigtige roller i OvCa føre til bedre diagnose og behandling.

S-nitrosoglutathion (GSNO) er en nitrosylerende middel, som medierer den posttranslationelle proces med S-nitrosylering på proteiner resulterende i modulering af deres aktivitet. S-nitrosylering er en vigtig biologisk omsætning af nitrogenoxid (NO) og henviser til omdannelsen af ​​thiolgrupper, herunder cysteinrester i proteiner, til dannelse af S-nitrosothioler. Det er en mekanisme til dynamisk posttranslationelle regulering af de fleste eller alle de store klasser af protein og er uafhængig af enzym katalyse, labile modifikation, tænd /sluk-lignende photophosphorylation [3]; imidlertid kan denitrosylation være enzymatisk eller ikke-enzymatisk. Et stigende antal proteiner har vist sig at gennemgå S-nitrosylering

in vivo,

kaldet S-nitrosothioler, og de spiller en vigtig rolle i forskellige processer lige fra signaltransduktion, DNA-reparation, vært forsvar, og blodtryk kontrol til ionkanal regulering og neurotransmission [3]. Men rollen som S-nitrosylering i OvCa vækst og progression er ikke undersøgt.

Denne undersøgelse var planlagt til at undersøge den terapeutiske virkning af en nitrosylerende middel (GSNO) i OvCa ved hjælp af

in vitro

og

in vivo

modeller og til at undersøge, hvilken rolle nitrosylering i OvCa.

Metoder

Reagenser og antistoffer

GSNO blev købt fra verdens Precision Instruments (Sarasota, FL) og dens renhed er 98%. Følgende antistoffer phospho-STAT3 (Y705) (Cat # 9145, anvendes på 1:1000), Pakt (Ser473) (Cat # 4060, anvendes på 1:1000), p-p42 /44 (Thr202 /Tyr204) (Cat # 4370, anvendes på 1:1000), STAT3 (Kat # 9139, anvendes på 1:1000), Akt (Kat # 4685, anvendes på 1:1000), p42 /44 (Cat # 9107, anvendes på 1:1000) var fra Cell Signaling (Danvers, MA). Beta-actin (b-actin) blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO). Føtalt bovint serum blev indkøbt fra BioAbChem (Ladson, SC). Rekombinant STAT3 blev købt fra SignalChem (Richmond, Canada).

Cell Culture

Menneskelig OvCa cellelinje SKOV3 og OVCARs var fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). A2780, C200 og OVCAR4 cellelinjer var en slags gave fra Dr. Tom Hamilton (Fox Chase Cancer Center) [4]. PE01 og PE04 var en slags gave fra Dr. Taniguchi (University of Washington, Seattle) [4]. Alle OvCa cellelinier blev opretholdt og dyrket i komplet Roswell Park Memorial Institute (RPMI)

medier indeholdende 10% føtalt bovint serum og antibiotika.

Dyr

etiske retningslinjer.

Six – til otte uger gamle kvindelige nøgne mus blev købt fra National Cancer Institute-Frederick Cancer Research og Development center (Frederick, MD). Alle mus blev huset og holdt under specifikke forhold i faciliteter på Mayo Clinic i Rochester, MN. Faciliteterne er godkendt og kontrolleret af American Association for akkreditering af Laboratory Animal Care (AAALAC Akkreditering # 000.717) og i overensstemmelse med gældende regler og standarder for det amerikanske Department of Agriculture, US Department of Health og Human Services, og National Institutes of Sundhed. Alle undersøgelser blev godkendt og overvåget af Mayo Clinic Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) i henhold til protokollen nummer A13909.

Mus blev fastholdt efter Institutional IACUC godkendt protokol. A2780 celler blev vasket to gange og resuspenderet i phosphatbufret saltvand (PBS) ved 2 × 10

6/100 pi og injiceret i den intraperitoneale kavitet i nøgne mus (dag 0). Behandling med GSNO (1 mg /kg legemsvægt) blev startet 3 dage efter podning af cellerne. GSNO blev indgivet ved oral sondeernæring i 0,1 ml volumen ved anvendelse af en 20 gauge nål fodring med kugle diameter på 2,25 mm (Braintree Scientific, MA). Kontrolgruppen modtog PBS som et køretøj. Musene blev overvåget dagligt for ubehag og vejet hver tredje dag for at kontrollere for tumorvækst. For kombinationsstudier, cisplatin behandling (4 mg /kg legemsvægt) ved intraperitoneale injektioner blev givet på dag 7, 14 og 21 sammen med GSNO behandling som beskrevet ovenfor (dag 0 blev taget som dagen for inokulering af celler). Efter tumor induktion blev mus overvåget dagligt for tegn på nogen nød. Musene blev menneskeligt dræbt med overdosis af CO2 på 4 uger, når tumoren byrde nåede mandatet vægt i ubehandlede mus [4], [5] og tumorer blev skåret ud og fikseret i formalin til sektionering.

Immunblotanalyse

Efter den fastsatte inkubationstid i nærvær eller fravær af angivne mængder GSNO, immunoblotanalyse med specifikke antistoffer blev udført som tidligere beskrevet [6] – [9]. Kort fortalt, behandlet og ubehandlet A2780 eller SKOV3-celler blev behandlet med HB-EGF (50 ng /ml) og /eller GSNO (2 timer forbehandling før tilsætning af HB-EGF på celler) ved forskellige tidsperioder (5-20 min ) blev lyseret i lysebuffer [50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM DTT, 50 mM Na3VO4 og 0,5% Nonidet P-40] indeholdende en proteasehæmmer cocktail ( Sigma, St. Louis, MO). Fyrre ug af proteiner blev adskilt ved SDS-PAGE og overført til nitrocellulose-membran. Membranen blev derefter blokeret i 1 time i 5% fedtfri tørmælk TTBS (20 mM Tris, 500 mM NaCl og 0,1% Tween 20, pH 7,5) og inkuberet natten over i primære antisera mod fosfor-STAT3 (Y705), STAT3, s -p42 /44 (Thr202 /Y204), p42 /44, Pakt (Ser473), Akt eller β-actin indeholdende 5% fedtfri tørmælk eller 5% BSA i tilfælde af phospho-antistoffer. Efter inkubering med HRP-konjugeret sekundært Ab blev blots fremkaldt med et ECL detektionssystem (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

Proliferationsassay

Celler (2,5-5,0 x 10

4) blev udpladet i 24-brønds plade i tre eksemplarer og behandlet med angivne koncentrationer af GSNO i 48 timer. Inaktive oxiderede GSNO blev anvendt som kontrol. Inaktive oxiderede GSNO blev fremstillet ved at udsætte GSNO-opløsning (0,2 mM i DMSO) for lys i 7 dage. Oxideret GSNO er ​​farveløs og ikke producerer NO ved tilsætning til cellemediet alene eller med celler i modsætning ueksponeret GSNO (fig S1A × 400). Celler, som undergår mitose blev talt i tumorerne, i det mest aktive område ( “hot spots”) i mindst 5 på hinanden følgende HPFS. Det gennemsnitlige antal celler, som undergår mitose pr HPF blev optalt. Maksimale diameter af levedygtige tumor blev beregnet som summen af ​​største unidimensional diameter af hver fragment af tumor under anvendelse af Olympus BX-41-mikroskop og et mikrometer. Ligeledes blev nekrotiske områder målt og den sammensatte levende tumorstørrelse blev beregnet ud fra hver slide som offentliggjort før [4], [5].

Statistisk analyse

Data er udtrykt som middel + SD og blev analyseret statistisk ved anvendelse af Students t-test (Prism). P 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant

Resultater

GSNO hæmmer proliferation af OvCa cellelinjer

For at vurdere effekten af ​​GSNO behandling på OvCa vækst, diverse OvCa celle. linjer (A2780, C200, PE01, PE04, OV202 og SKOV3) blev behandlet med forskellige koncentrationer af GSNO (0,1-1 mM). Proliferation blev bestemt ved MTT-assay efter 24 timer. Behandling med GSNO inhiberede proliferationen af ​​disse OvCa cellelinjer betydeligt på en dosisafhængig måde (fig. 1), herunder cisplatin resistente C200 (fig. 1B), taxol resistent PE04 (fig. 1D) og aggressive SKOV3 cellelinjer (Fig. 1E ). Tilsætning af GSNO i medierne frigivet NO i dosisafhængig måde; imidlertid havde oxideret GSNO ikke producerer NO (fig. S1B-C). Vi målte også IC50 på GSNO på celleproliferation af forskellige OVCA cellelinjer under anvendelse CalcuSyn program. IC50 for GSNO var 0,162, 0,385, 0,337, 0,427, 0,196 og 0,235 mmol /l i A2780, C200, PE01, PE04, OV2O2 og SKOV3 (tabel S1). GSNO behandling også svækket celleproliferation af andre OvCa cellelinjer, herunder OVCAR-3, -4, 5, -7, -8 og -10 på en dosisafhængig måde (fig. S2). IC50 for GSNO i disse cellelinjer blev fundet forskelligt og opført i tabel S1. Den inaktive oxiderede form af GSNO havde ingen effekt på udbredelsen af ​​OvCa cellelinjer

Procent levedygtighed A2780, C200, PE01, PE04, SKOV3 og OV202 behandlet med angivne doser af S-nitrosoglutathion (GSNO;. 0,1- 1 mM) blev bestemt ved MTT-assayet. Inaktiv GSNO (oxideret, sidste bar) blev anvendt som kontrol. Dataene repræsenterer 3 individuelle forsøg gennemført in triplo. *** P 0,001; ** P 0,01; * P 0,05 og NS; ikke signifikant sammenlignet med ubehandlede celler ved hjælp af t-test (Prism).

For at afgøre, om dette hæmning blev afspejlet i klonogene overlevelse, kolonidannende evne A2780, C200, PE01 og PE04 celler blev udført . Som vist i figur 2, en enkelt behandling af GSNO signifikant svækket klonogen overlevelse for OvCa cellelinjer på en dosisafhængig måde sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 2). IC50 for GSNO viste sig at være 0,122, 0,161, 0,356 og 0,352 mmol /l i i A2780, C200, PE01 og PE04 (tabel S2). Inaktiv oxideret form af GSNO havde ingen virkning på kolonidannelse af OvCa cellelinier. Disse resultater antyder, at GSNO behandling kan resultere i en vedvarende inhibering af proliferation af forskellige OvCa cellelinjer, herunder kemoterapi cellelinjer (C200 og PE04) (fig 2B, C . F). Salg

Celler (2 x 10

3) /brønd (A2780, C200, PEO1 og PEO4) blev udpladet i 6-brønds plader og behandlet med angivne koncentrationer af S-nitrosoglutathion (GSNO) en gang. Oxideret GSNO blev anvendt som en negativ kontrol (sidste søjle). Efter 2 uger blev kolonierne farvet med MTT og talt. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD af triplikater. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 og NS; ikke signifikant sammenlignet med ubehandlede celler ved hjælp af t-test (Prism).

GSNO dæmper vækstfaktorer induceret celle migration og invasion

in vitro

Vi næste undersøgt virkningen af ​​GSNO på vækstfaktor medieret cellemigration og invasion. SKOV3 celler dyrket natten over i lavt serum (0,2%) indeholdende medium blev ridset under anvendelse af en steril 200 gl pipettespids, når de havde nået 90% konfluens. Forskellige vækstfaktorer, herunder HB-EGF og SDF1 (50 ng og 25 ng /ml) blev tilsat individuelt til medium i nærvær eller fravær af GSNO (200 uM). Fireogtyve timer senere blev hastigheden for sårlukning beregnet. Som vist i figur 3A, GSNO inhiberede alle HB-EGF og SDF1 medieret cellemigration i SKOV3 cellelinie. Lignende resultater blev opnået for A2780 og C200-cellelinjer (data ikke vist). Næste vi vurderet virkningen af ​​GSNO modulering vækstfaktormedieret invasion af SKOV3-celler under anvendelse Boyden kammer migration assay (BD Bioscience, San Jose, CA) som tidligere beskrevet [11]. Figur 3B viser tydeligt, at GSNO behandling signifikant hæmmet vækst faktor induceret invasion af SKOV3-celler sammenlignet med ubehandlede celler. Disse resultater indikerer, at GSNO har evnen til at inhibere migration og invasion af OvCa celler.

A. Celler dyrket med HB-EGF og SDF1 i fravær eller nærvær af S-nitrosoglutathion (GSNO) og cellemigration blev målt ved sårlukning assay som beskrevet i materiale og metoder. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD af n = 7. B. For at undersøge virkningen af ​​GSNO på invasion, 1 x 10

5 SKOV3-celler blev podet i de øvre brønde med 0,2 mM GSNO i det øvre kammer af Transwell i 500 pi dyrkningsmedium. Forskellige vækstfaktorer (HB-EGF og SDF1) (25 ng /ml) blev tilsat til de underliggende medier. Fireogtyve timer senere, invasion blev bestemt ved at følge producentens anvisninger. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD af triplikater. $$$ P 0,001 vækstfaktor behandlet sammenlignet med kontrol. * P 0,05; *** P. 0,001 GSNO behandlet i forhold til vækstfaktor hjælp t-test (Prism)

GSNO ophæver vækstfaktor induceret signalering i OvCa celler

For at undersøge effekten af GSNO på vækstfaktor-induceret signalering, serumudsultet A2780 og SKOV3-celler blev behandlet med GSNO efterfulgt af HB-EGF behandling for forskellige tidsperioder. Celler blev høstet og immunoblottedes til forskellige signaleringsmolekyler. Som vist i figur 4, behandling med GSNO inhiberede HB-EGF induceret aktivering af STAT3, Akt og p42 /44 som fremgår af de reducerede eller manglende phosphorylering detekteret i forhold til HB-EGF-behandlede prøver. GSNO behandling reducerede også de basale niveauer af phosphorylerede form af Akt, STAT3 og p42 /44 i A2780 og SKOV3 cellelinier (fig. 4). Inaktiv kontrol (oxideret GSNO) havde ingen virkning på vækstfaktoren induceret signalering, hvilket antyder specificiteten af ​​GSNO i dæmpning af HB-EGF induceret signalering og en mulig mekanisme, ved hvilken GSNO medierer dæmpning af cellevækst, migrering og invasion af OvCa celler

in vitro

A2780 (A) og SKOV3 (B) celler blev udpladet, serum sultet natten over og behandlet med S-nitrosoglutathion (GSNO; 0,5 mM). eller inaktiv kontrol (oxideret GSNO; 0,5 mM) i nærvær eller fravær af HB-EGF (50 ng /ml) i forskellige tidsperioder (5-20 min). Celler blev høstet ved angivne tidspunkter og oparbejdet til detektion af forskellige signalmolekyler, herunder pSTAT3 (Tyr705), Pakt (Ser473) og p-p42 /44 (Thr202 /Tyr204) ved hjælp af deres specifikke antistoffer fra Cell Signaling (Danvers, MA). Total STAT3, Akt, p42 /44 og β-actin blev anvendt for samme belastning. Blots er repræsentative for to uafhængigt kører eksperimenter.

Oral administration af GSNO dæmper tumorvækst og forbedrer cisplatin induceret cytotoksicitet

in vivo

For at bestemme, om GSNO kunne dæmpe tumorvækst

in vivo

, A2780-celler (2 × 10

6) i PBS blev inokuleret intraperitonealt i 6 uger gamle kvindelige nøgne mus for etablering af tumorer. Mus blev tildelt til to behandlingsgrupper. Den første gruppe (ubehandlet) fik 100 pi PBS som køretøjet ved tvangsfodring. Den anden gruppe blev givet GSNO oralt i PBS (100 pi) i en dosis på 1 mg /kg legemsvægt hver dag som beskrevet i materiale og metoder (fig. 5A). Ved udgangen af ​​4 uger blev musene aflivet, og tumorbyrde blev groft undersøgt, udskåret og vejet. Daglig administration af GSNO reducerede signifikant den abdominale omkreds (p 0,01) (Fig 5B.), En angivelse af tumorbelastning, som transporteres i peritoneum. GSNO også reduceret tumorvækst (p 0,001) i den peritoneale kavitet af A2780 bærende nøgne mus sammenlignet med køretøjet (PBS) behandlede gruppe. De gennemsnitlige vægt af de udskårne tumorer var ca. 68% mindre i GSNO (3,35 ± 0,52 g) behandlede mus i sammenligning med ubehandlede mus (7,91 ± 0,412 g) (fig. 5C). Som tidligere rapporteret af Shaw et al [12] og os [4], intraperitonealt injiceret A2780 celler hovedsagelig dannet solide tumorer og fremlagt med ovarie-specifikke metastaser (fig 5D, nederste panel). Ovariet-associerede tumorer i de GSNO behandlede mus var meget mindre end i ubehandlede mus (fig. 5D). For yderligere at vurdere levedygtigheden af ​​tumoren, blev nekrotisk og levedygtig tumorstørrelse bestemmes ud fra hæmatoxylin og eosin farvede sektioner. Forholdet mellem levende tumorstørrelse til total tumorstørrelse blev beregnet ud fra den største unidimensional diameter som beskrevet i fremgangsmåderne. Som vist i figur 5E, xenotransplantater afledt fra GSNO behandlede mus havde signifikant mindre levedygtige tumorstørrelser (p 0,01 behandlede i forhold til køretøjet). C. Nedsat udskårne tumorvægte af GSNO behandlede mus sammenlignet med bærerbehandlede i uge 4 (*** p 0,001 behandlet sammenlignet med vehikel). Resultaterne er vist som middelværdi ± SD af 10-14 individuelle dyr. D. repræsentant brutto morfologisk billede af tumormasse og tumor associeret med ovarie af køretøjet og GSNO behandlede mus. E. Målinger af levedygtige tumorstørrelse af GSNO vs PBS-behandlede mus, som beskrevet i fremgangsmåder (*** p 0,001 behandlede sammenlignet med vehikel). F. Optælling af mitotiske celler og G. optælling af CD31 positive kar pr HPF (x400) i GSNO vs PBS-behandlede mus, som beskrevet i fremgangsmåder), blev tællinger udføres fra 5 områder af 3 forskellige tumorer fra hver gruppe. NS; ikke-signifikant behandlet i forhold til køretøjet.

Vi undersøgt, om en kombination af GSNO med cisplatin kunne øge den cytotoksiske effekt i tumorer. Derfor efter injektion af A2780 celler, 2 sæt mus blev behandlet dagligt med oral indgivelse af GSNO (1 mg /kg legemsvægt) og cisplatin (ugentlig intraperitoneal injektion af cisplatin på dag 7, 14 og 21) som monoterapi. Til kombinationsterapi, blev ét sæt mus behandlet med GSNO og cisplatin som vist i figur 6A. Både GSNO og cisplatin var signifikant effektive til reduktion af tumorvækst og masse som monoterapi ved A2780 bærende mus (fig. 6B). Imidlertid kombinationsterapi var mere effektiv til inhibering af tumorvækst i forhold til monoterapi af hvert lægemiddel. Kombination af cisplatin (4 mg /kg legemsvægt) med GSNO (1 mg /kg legemsvægt) (2,08 ± 0,18 g) (fig. 6B) signifikant reduceret tumorvækst sammenlignet med enten GSNO (3,54 ± 0,35 g) eller cisplatin behandling alene (3,15 ± 0,34 g) eller ubehandlede mus (6,9 ± 0,66 g). Tumorvolumen blev reduceret med -90% i de fleste af musene behandlet med kombinationen. Kollektivt antyder disse resultater, at kombinationen GSNO med cisplatin behandling er signifikant mere effektiv til reduktion af tumorvækst i en OvCa musemodel.

A. Skematisk diagram af eksperimentel design. B. Kumulativ udskåret tumorvægt fra individuelle mus ved 4 uger med S-nitrosoglutathion (GSNO, 1 mg /kg legemsvægt) (felt 2), cisplatin (4 mg /kg legemsvægt) (panel 3) og GSNO (1 mg /kg kropsvægt) og cisplatin (4 mg /kg legemsvægt) kombination (panel 4). Cisplatin blev givet 3 gange ved intraperitoneal vej på dag 7, 14 og 21 post-tumor injektioner. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD af 7 dyr. *** P 0,001 kombination af GSNO + cisplatin behandlede gruppe sammenlignet med ubehandlet eller cisplatin alene behandlede gruppe; ** P 0,01 GSNO behandlede gruppe sammenlignet med ubehandlede gruppe; * P 0,05 cisplatin behandlede gruppe sammenlignet med ubehandlede gruppe; # P. 0,05 kombination af GSNO + cisplatin gruppen sammenlignet med GSNO alene gruppen

GSNO behandling induceret nitrosylering af STAT3

Da GSNO er ​​en nitrosylerende agent og er kendt for at mægle den posttranslationelle processen med S-nitrosylering på proteiner, hvilket resulterer i modulering af deres aktivitet [13]. Vi undersøgte effekten af ​​GSNO på nitrosylering om forskellige endogene proteiner, der vides at være nitrosyleres og nøgleaktører i OvCa herunder Akt, p65 og EGFR [14] – [17].

For at undersøge nitrosyleringen af ​​forskellige proteiner anvendte vi en sofistikeret biotin-switch assay. kunne detekteres basalt nitrosylerede proteiner mellem 250 og til 35 kd molekylvægt i OvCa celler (fig. 7A, bane 1). GSNO behandling forstærkede nitrosyleringen af ​​endogene proteiner i behandlede celler med GSNO (0,5 mM) i 2 timer (fig. 7A, bane 2). Specificiteten af ​​nitrosylering kunne opnås ved at udelade tilsætningen af ​​HPDP-biotin under biotin-switch assay. Som vist i figur 7A, bane 3, udeladelsen af ​​HPDP-biotin trin blokerede fuldstændigt påvisning af nitrosylering af endogene proteiner, hvilket understreger specificiteten af ​​nitrosylering fremgangsmåde i vores laboratorium. Vi yderligere valideret induktion af nitrosylering af GSNO ved at observere for nitrosylering af allerede rapporteret signalering proteiner forbundet med kræft progression, herunder i æggestokkene. GSNO behandling inducerede nitrosyleringen af ​​p65, Akt og EGFR som forventet (fig. 7B). Vi yderligere opdaget unikke observation af STAT3 undergår nitrosylering upon GSNO behandling (fig. 7B, C). For at bekræfte, at STAT3 er nitrosyleres blev STAT3 immunopræcipiteret efter biotin-switch under anvendelse af dets specifikke antistof og immunblottet med anti-biotin-HRP. En lignende observation af STAT3 undergår nitrosylering upon GSNO behandling blev set. Disse sæt af eksperimenter klart angive en roman regulering af STAT3 ved s-nitrosylering. For yderligere at undersøge, om dette fænomen ikke er kun begrænset til én celletype, vi behandlede forskellige OvCa cellelinjer, herunder A2780, C200 og SKOV3 med GSNO og oxideret GSNO som kontrol. Efter 2 timers inkubering blev total cellelysat oparbejdet til detektion af phosphorylering status STAT3. Som vist i figur 7D, GSNO behandling ophævede eller reducerede tyrosinphosphorylering i alle OvCa cellelinjer uden at påvirke STAT3 niveauer. Oxideret GSNO påvirkede ikke pSTAT3 niveauer i nogen cellelinjer. Under tilsvarende forsøgsbetingelser, undersøgte vi nitrosyleringen af ​​STAT3 anvendelse af biotin switch metode. GSNO behandling steg den samlede nitrosyleringen af ​​multiple proteiner med lav til høj molekylvægt sammenlignet med ubehandlede og oxiderede GSNO-behandlede prøver som det fremgår af figur 7E. Et lignende mønster blev observeret i nitrosylering af STAT3 antyder, at GSNO medierede stigning i nitrosylering af STAT3 er et generelt fænomen i alle OvCa cellelinier.

A. Påvisning af biotinylerede proteiner efter biotin-switch metoden i nærvær eller fravær af S-nitrosoglutathion (GSNO; 0,5 mM). Udeladelse af biotin-HPRT angiver specificiteten af ​​S-nitrosylering af biotin-switch metode. B. Påvisning af nitrosylering af forskellige proteiner, herunder EGFR, p65, Akt og STAT3 i æggestokkene cancerceller upon GSNO behandling. C. STAT3 blev immunpræcipiteret fra nitrosyleret protein lysat efter biotin switch assay og dens biotinylering blev påvist ved anti-biotin-HRP anvendelse af Western blot analyse. D. A2780, C200 og SKOV3 cellelinjer blev behandlet med GSNO (0,5 mM) eller oxideret GSNO (0,5 mM) som kontrol i 2 timer efterfulgt af immunoblotanalyse til påvisning af tyrosinphosphorylering af STAT3 på 705 rester og samlet STAT3. E. Under lignende eksperimentelle betingelser som “D”, A2780, blev C200 og SKOV3 celler behandlet til biotin skifte metode til påvisning af STAT3. Prøve i bane 4 blev behandlet med GSNO som bane 2, undtagen under behandling til biotin skifte assay; tilsætningen af ​​HPDP blev udeladt. Øvre panel viser de biotinylerede proteiner efter biotin-switch assay. Nitrosyleret STAT3 blev påvist ved at trække ned biotinylerede proteiner ved streptavidin agarose efterfulgt af immunoblotanalyse under anvendelse af anti-STAT3 antistof. Lavere bands vise de samlede niveauer af input STAT3 behandles til biotin switch assay.

GSNO nitrosylates STAT3 og påvirker dets evne til at binde DNA

Når vi konstateret, at STAT3 gennemgår nitrosylering i dyrkede celler , vi yderligere undersøgt, om STAT3 kunne nitrosyleres

in vitro

og hvis det kan påvirke dens DNA bindende evne. Til dette, tog vi to fremgangsmåder, først isoleret vi kerneekstrakt fra SKOV3, som udviser højere basale niveauer af den phosphorylerede form af STAT3 og har evnen til at binde STAT3 DNA-bindende motiv uden stimulering. Vi inkuberede 20 ug kerneekstrakt (NE) med GSNO eller oxideret GSNO i nærvær eller fravær af DTT i 4 timer. Efter inkubation blev det DNA-bindende evne STAT3 undersøgt ved inkubering nitrosyleres NE med STAT3 gelændring oligonukleotider konjugeret med agarose. Som vist i figur 8A viste GSNO behandlede prøve nitrosylering af STAT3 som tydeligt ved biotin switch assay og kunne ikke trækkes ned af STAT3 gelændring oligonukleotider konjugeret med agarose. Optagelse af DTT i prøver afskaffet GSNO medieret nitrosylering af STAT3, hvilket resulterer i bindingen af ​​STAT3 på dens DNA-bindende motiv. STAT3 også har vist sig at rekruttere coaktivator herunder p300. 0,01;