PLoS ONE: Fækal mikrobiota, Fækal metabolomet, og kolorektal cancer indbyrdes

Abstrakt

Baggrund og Formål

Undersøgelse af mikrobe-metabolit relationer i tarmen er nødvendig for at forstå og potentielt reducere kolorektal cancer (CRC) risiko.

Metoder

mikrobiota og metabolomics profilering blev udført på frysetørrede afføring fra 42 CRC tilfælde og 89 matchede kontroller. Multivariable logistisk regression blev anvendt til at identificere statistisk uafhængige foreninger med CRC. Første principal koordinere-komponent par (PCo1-PC1) og falsk opdagelse sats (0,05) -corrected P-værdier blev beregnet for 116.000 Pearson korrelationer mellem 530 metabolitter og 220 mikrober i en sex * case /kontrol meta-analyse.

Resultater

Samlet mikrobe-metabolit PCo1-PC1 blev mere stærkt korreleret i tilfælde end i kontrollerne (Rho 0,606 vs 0,201, P = 0,01). CRC blev uafhængigt associeret med lavere niveauer af clostridier, Lachnospiraceae,

s

-aminobenzoate og konjugeret linoleat, og med højere niveauer af Fusobacterium, Porphyromonas,

s

hydroxy-benzaldehyd, og palmitoyl-sphingomyelin . Gennem postulerede effekter på celle udgydelse (palmitoyl-sphingomyelin), inflammation (konjugeret linoleat), og medfødte immunitet (

s

-aminobenzoate), metabolitter medierede CRC samarbejde med Fusobacterium og Porphyromonas med 29% og 34%, henholdsvis . Samlet set palmitoyl-sphingomyelin korrelerede direkte med mængderne af Enterobacteriaceae (Gammaproteobacteria), tre aktinobakterier og fem Firmicutes. Kun Parabacteroides korrelerede omvendt med palmitoyl-sphingomyelin. Andre lipider korrelerede omvendt med Alcaligenaceae (Betaproteobacteria). Seks Bonferroni-signifikante korrelationer blev fundet, herunder lav indolepropionate og threnoylvaline med aktinobakterier og høj erythronate og en karakteriseret metabolit med Enterobacteriaceae.

Konklusioner

Fæces fra CRC tilfælde havde meget stærke mikrobe-metabolit sammenhænge som blev domineret af Enterobacteriaceae og aktinobakterier. Metabolitter medierede en direkte CRC association med Fusobacterium og Porphyromonas, men ikke en omvendt sammenhæng med Clostridia og Lachnospiraceae. Denne undersøgelse identificerer komplekse mikrobe-metabolit netværk, der kan give indsigt på neoplasi og mål for intervention

Henvisning:. Sinha R, Ahn J, Sampson JN, Shi J, Yu G, Xiong X, et al. (2016) Fækal mikrobiota, Fækal metabolomet, og kolorektal cancer sammenhænge. PLoS ONE 11 (3): e0152126. doi: 10,1371 /journal.pone.0152126

Redaktør: Peh Yean Cheah, Singapore General Hospital, SINGAPORE

Modtaget: September 15, 2015; Accepteret: 9 mar 2016; Udgivet: 25 Mar 2016

Dette er en åben adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:.. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af National Cancer Institute Intramural Research Program og tilskud R03CA159414 og R01CA159036. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Forkortelser : BMI, body mass index; CRC, colorectal cancer; CI, konfidensinterval; FDR, falsk opdagelse sats; OR, odds ratio; PABA,

s

-aminobenzoate; PC, principal komponent; PCO, principal koordinere; SD, standardafvigelse

Introduktion

tarmen mikrobielle population (mikrobiota) bærer større end 100 gange flere gener end det menneskelige genom, hvorigennem det regulerer mange forskellige processer, såsom energi høst, stofskifte af kosten komponenter, immunitet og aktiviteter af vært eller mikrobielle stammer kemikalier. [1] Ændring eller regulær dysfunktion af disse processer er tæt knyttet til inflammatorisk tarmsygdom, fejlernæring og metabolisk syndrom, [2-4], og det påvirker risikoen for en bred vifte af sygdomme, herunder colorectal cancer (CRC). [5-11] Whole-genomet haglgevær sekventering har tilvejebragt indsigt i den metaboliske potentiale tarmens mikrobiota, især i undersøgelser, der omfattede transcriptomics. [1, 12-14] Målrettede indsigt har kommer fra studier af mikrobiel konsortier, kosten interventioner, gnotobiotiske musemodeller, og overførsel af fækal mikrobiota fra syge eller raske mennesker. [3, 13, 15] på trods af disse fremskridt, en omfattende sammenligning af alle påviselige metabolitter med alle mikrober i den distale menneske gut mangler.

Vi har tidligere rapporteret CRC foreninger med fækal mikrobiota, specielt nedsat relativ overflod af Lachnospiraceae og andre Clostridia og øget transport af Fusobacterium, Atopobium, og Porphyromonas. [16] i samme population, CRC var forbundet med forskelle fra de matchede kontroller i niveauer af snesevis af fækale metabolitter. [17] Heri vi søgt at afdække sammenhænge mellem fecal mikrober og metabolitter og identificere statistisk uafhængige forskelle mellem CRC og matchede kontroller.

Materialer og metoder

undersøgelse deltagere og prøver

undersøgelsen design er blevet beskrevet tidligere. [18, 19] Kort fortalt nydiagnosticerede tilfælde med adenocarcinom i colon eller rektum blev rekrutteret før operation og behandling i løbet af 1985-1987. [18, 19] Controls var syge, der afventer elektiv kirurgi for ikke-onkologiske, ikke-gastrointestinale forhold på disse hospitaler i samme periode. En median på 6 dage (interkvartile område, 3-13 dage) forud for indlæggelse og operation, deltagerne afsluttet kosten og demografiske spørgeskemaer og forudsat to dages fækale prøver, der blev nedfrosset hjemme på tøris og efterfølgende frysetørret. De to-dages lyofilater blev samlet, blandet og opbevaret ved -40 ° C. Deltagerne forudsat skriftligt informeret samtykke. Procedurerne for samtykke proces- og studie blev gennemgået og godkendt af en Institutional Review Board på National Cancer Institute. [18, 19]

Af 69 tilfælde og 114 kontroller i den oprindelige undersøgelse, [18, 19] sagen -styring analyse omfattede 48 tilfælde og 102 kontroller for hvem mindst 100 mg frysetørrede afføring var tilgængelig. Kontroller blev frekvens matches til sager efter køn og body mass index (BMI). Mikrobiota og metabolomiske analyser blev udført med disse frysetørrede fækale prøver. Som tidligere beskrevet [16, 17] i begge analyser systemer, data var af fremragende kvalitet og meget reproducerbar. For de nuværende analyser, der var 42 tilfælde og 89 kontroller, der havde både metabolomics og mikrobiota data.

mikrobiota analyser

Detaljerne om forstærkning, sekventering, klassifikation og analyse af 16S rRNA-generne er i Ahn et al. [16] Kort fortalt, DNA blev ekstraheret under anvendelse af Mobio PowerSoil DNA Isolation Kit (Carlsbad, CA). 16S rRNA amplikoner dækker variable regioner V3 til V4 blev dannet, og de amplikoner blev sekventeret med 454 Roche FLX Titanium pyrosekventering system. Filtreret sekvenser blev arkiveret lodret i operationelle taksonomiske enheder med 97% identitet og justeret til fuldt sekventeret mikrobielle genomer (IMG /GG Greengenes) ved hjælp af QIIME pipeline. [20] Den nuværende analyse var begrænset til de 220 mikrober (på tværs taksonomiske niveauer, herunder 91 Firmicutes, 33 Bacteroidetes, 45 Proteobacteria, 11 aktinobakterier, 5 Fusobacteria, og 35 i andre phyla), der blev påvist i mindst 13 (10%) af forsøgspersonerne.

Metabolomics analyser

A række små molekyler (mest 1000 Dalton) blev påvist i de lyofiliserede fækale prøver ved højtydende flydende fase og gaskromatografi kombineret med tandem-massespektrometri (HPLC-GC /MS-MS, Metabolon, Inc., North Carolina, USA) som beskrevet tidligere. [21, 22] Kort fortalt blev ikke-øremærket enkelt methanol ekstraktion udført, efterfulgt af protein udfældning. Enkelte molekyler og deres relative niveauer blev identificeret fra massen spektrale spidser sammenlignet med en kemisk reference bibliotek genereret fra 2.500 standarder, baseret på massespektrale toppe, opholdstider og masse-til-ladningsforhold. Molekylerne omfatter, men er ikke begrænset til, aminosyrer, carbohydrater, fedtsyrer, androgener og xenobiotika. Flygtige molekyler, såsom kortkædede fedtsyrer, kan gå tabt under lyofilisering eller ekstraktion. Men et sådant tab er generelt svarer tværs prøver, og frysetørring er optimal for fækale prøver for at sikre lige belastning af tørvægt. Den aktuelle analyse blev begrænset til de 530 metabolitter, der er konstateret i mindst 118 (90%) af forsøgspersonerne.

statistiske analyser

Det overordnede mål var at identificere samvariation og mulige interaktioner mellem fækal metabolitter og fecal mikrober, enten forbundet med CRC eller ej. På CRC forening, anvendte vi ubetinget logistisk regression til at beregne odds ratio (OR) og 95% konfidensinterval (CI), med kasse status som den afhængige variabel og med hver CRC-associeret mikrobe som den primære uafhængig størrelse, [16] alder, køn og BMI blev inkluderet for empirisk justering af potentiel forvirrende. Herunder løb i modellerne ikke havde nogen væsentlig indvirkning på estimaterne. Til hver mikrobe model blev metabolitter tilføjet i en fremadrettet trinvis logistisk regression, og metabolitter, der er forbundet med CRC på P≤0.15 blev bibeholdt. Ændring i OR med tillæg af metabolitter blev beregnet som (OR

ingen metabs-OR

metabs) /(eller

ingen metabs- 1). For standardiserede estimater blev relative forekomst af de mikrober og naturlige-log niveauer af metabolitter normaliseret til at betyde 0 og standard fejl 1. Vi rapporterer også Pearson korrelationskoefficienter mellem metabolitter og mikrober, der var forbundet med CRC.

for det globale mål uanset CRC, vi overvejet alle 530 metabolitter og 220 mikrober, og brugte lineær regression, stratificeret efter køn og tilfælde status, til at identificere sammenhænge mellem metabolitter og mikrober. For hver af de 530 x 220 regressioner, vi korrigeret for alder, race (hvid vs Andet), BMI, og hospital. Vi illustrerer det samlede omfang af foreninger ved at plotte den-log10 (P-værdier) for hver metabolit-mikrobe parring i en “Manhattan” plot. Vi beregnede også korrelationer af den øverste hovedkomponent (PC1) og hovedstol koordinat (PCo1) af metabolitterne og mikrober, hhv. De vigtigste komponenter og væsentligste koordinater blev opnået fra den resterende matrix af lineære regressionsmodeller, justeret for alder, race, BMI, og hospitalet, for hver metabolit eller mikrobe hhv. For at sammenligne korrelationen ρ

1, mellem PC1 og PCo1 i sager mod korrelationen ρ

2 i kontrol, vi anvendt Fishers Z-transformation Z (ρ) = 0.5ln ((1 + ρ /1-ρ) ) til hver korrelation og derefter testet, om Z (ρ

1) -Z (ρ

2) var signifikant forskellig fra 0. Vi antog Z (ρ

1) -Z (ρ

2) blev normalfordelt med middelværdi 0 og varians 1 /(N

1-3) + 1 /(N

2-3) under nulhypotesen hvor N

1 og N

2 er nummer af tilfældene og kontroller hhv. Den 2-sidet P-værdi er 2 * (1-P

norm [(Z (ρ

1) -Z (ρ

2)] /sqrt (var)). Statistiske analyser blev udført i R-version 3.1.0 (R Foundation for Statistisk Computing, Wien, Østrig, https://www.R-project.org/).

Resultater

Komplette fecal mikrobiota og metabolomet data var analyseret for 42 CRC tilfælde og 89 alders- og BMI-matchede kontroller [2] Disse 131 forsøgspersoner havde en gennemsnitsalder på 60 år (SD 13.2) og en gennemsnitlig BMI på 25,6 (SD 4.2). de var overvejende hvide og mandlige ( tabel 1). sager adskilte sig ikke fra kontrol af alder, BMI, rygning eller hospital, men en højere andel af tilfældene var African American og mandlig (tabel 1).

fælles sammenslutninger af fækal mikroflora og fecal metabolitter med CRC

i logistiske regressionsmodeller, der omfattede alder, køn og BMI, fire mikrober var signifikant associeret med CRC i separate modeller: Fusobacterium (OR 10,17, CI 2,95 til 35,0), Porphyromonas (OR 5,32, CI 1,76-16,05), Clostridia (OR 0,57, CI 0,38-0,85), og Lachnospiraceae (OR 0,61, CI 0,40-0,92). Tabel 2 viser disse og tilsætning af fækale metabolitter forbundet med CRC ved et kriterium P≤0.15. I disse modeller, OR for CRC var ca. 2,8 med palmitoyl-sphingomyelin, 2.4 med

s

hydroxy-benzaldehyd, 0,5 med

s

-aminobenzoate (PABA), og 0,5 med conjugated- linoleat-18-2N7 (CLA). Alpha tocopherol (OR 0,6) bidrog til Fusobacterium og Porphyromonas modeller, og mandelat (OR 1.6) bidraget til Clostridia og Lachnospiraceae modeller. Med metabolitter i mikrobe-modeller, blev den høje OR af CRC med Fusobacterium reduceret med 29% (fra 10,17 til 7,53), og den høje OR med Porphyromonas blev reduceret med 34% (fra 5,32 til 3,83). Dæmpning af de lave yderste periferi med clostridier og Lachnospiraceae blev mindre markant (3,9% og 1,5%, henholdsvis).

For yderligere indsigt i de mikrober og fire metabolitter, der bidrog til alle de logistiske regressionsmodeller, parvis Pearson korrelationskoefficienter blev beregnet ved case-kontrol status. I tilfælde, stærke korrelationer (